방법 논문

높은 처리량 마이크로 분석 실험을 사용하여 워터스, 토양 및 퇴적물에있는 미생물 세포 외 효소 활성의 결정

DOI:

10.3791/50399

⸱

2013년 10월 1일

 ,  , 
1Department of Biology, The University of Mississippi

이 논문에서

요약

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마이크로 플레이트 기반 절차는 세포 외 효소 활성의 형광 또는 비색 분석을 위해 설명된다. 이러한 절차는 관리 기간 내에 환경 시료 다수 이러한 활동의​​ 신속한 분석을 허용한다.

초록

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자연 환​​경의 영양 순환과 탄소 처리의 대부분은 미생물에 의해 발표 세포 효소의 활동을 통해 발생합니다. 따라서, 이러한 세포 외 효소의 활성 측정은 유기물 분해 또는 질소와 인 광물 등의 생태계 수준의 프로세스의 속도에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 환경 시료에서 세포 외 효소 활성의 분석은 일반적으로 인공 측색 또는 형광 기질에 샘플을 노출하고, 기판의 가수 분해 속도를 추적 포함한다. 여기에서 우리는 짧은 기간 내에 다수의 샘플의 분석을 할 수있는 절차를 마이크로 기반의 방법을 설명한다. 샘플은 마이크로 블록 마이크로 플레이트 또는 디프 웰 96 - 웰 내에 인공 기질과 반응 할 수 있으며, 효소 활성이어서 전형적인 마이크로 플레이트를 사용 Reade에 얻어진 최종 생성물의 흡수 또는 형광에 의해 결정된다R 또는 형광 분석기. 이러한 높은 처리 절차는 공간적으로 분리 된 사이트 또는 생태계 간의 비교를 용이하게, 또한 실질적으로 샘플 당 필요한 시약 전체적인 부피를 감소시킴으로써 그러한 분석법의 비용을 줄일뿐만 아니라.

서론

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박테리아 및 곰팡이 등의 미생물 세포 효소의 생산을 통해 복잡한 유기 화합물의 영양분과 탄소를 얻을 수 있습니다. 이러한 효소는 전형적 셀로 취할 수 작은 소단위로 중합체를 가수 분해한다. 따라서, 생태 학적 수준에서, 이러한 미생물의 세포 외 효소는 영양 광물 및 자연 환경에서 발생하는 유기물 분해의 대부분에 대한 책임이 있습니다. 이러한 cellobiohydrolase (CBH) 및 β-글루코시다 제 등의 효소는 미생물의 흡수와 동화에 대한 utilizable 탄소 기판을 제공 1,2 포도당 셀룰로오스의 가수 분해를 촉진하기 위해 한마음으로 셀룰로오스 분해 작업을 위해 중요하다. 효소 포스는 유기 인계에서 수용성 무기 인산염 그룹, 기본적으로 인산염 광물 화하고 대부분의 생물 3에서 사용할 수있게 만들을 출시. 이러한 N-acetylglucosaminidase (나가세)와 같은 다른 효소는 importan 아르키틴 분해에 t, 탄소 및 미생물 인수 4에 해당하는 질소의 양을 만들 수 있습니다.

자연 환경에서 미생물의 세포 외 효소 활성의 분석을위한 절차 중 하나는 인공 P-니트로 페닐 (p의 NP) 연결된 기판 원래 토양 오 ....

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프로토콜

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토양 및 퇴적물의 세포 외 효소 활성의 비색 분석

1. 효소 활성의 비색 분석 용 기판 및 버퍼 솔루션의 제조

  1. 50 ㎖의 0.1 M 아세트산 (2.87 ㎖를 500 ㎖의 물에 빙초산)를 혼합하여 50 mM의보기 아세테이트 완충액 (pH 5.0-5.5)를 준비하고, 150 ㎖의 0.1 M 아세트산 나트륨 및 200 ㎖의 증류수 H 2 O. 필요한 경우 0.1 M 아세트산으로 5.0-5.5로 산도를 조정합니다.
  2. 증류 H 2 O. 1 M 수산화 나트륨 (NaOH를)의 용액을 준비
  3. 50 mM의 아세테이트 버퍼에 P는 NP-연결된 기판 솔루션을 준비합니다. 인산 가수 분해 효소는 50 mM의 아세테이트 버퍼에 5 밀리미터 P는 NP-인산염을 준비을 검정, β-글루코시다 아제가 5 밀리미터 P는 NP-β-글루 코피 라노를 준비 분석 실험하기 위해, 나가세가 2 ㎜ PNP-β-N-acetylglucosaminide을 준비 분석 실험 할 수 있습니다. 멸균 15 ML 50 ML의 원심 분리기 튜브의 모든 기판 솔루션을 준비합니다. 솔루션 2 ~ 3 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

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결과

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토양과 수생 퇴적물 일반적 부착 미생물 군집 (생물막) 입자의 표면에 성장의 결과로 세포 외 효소 활성의 상당한 수준을 가지고.이 액티비티는 제 3 표면 침전물로부터 얻어지는 입자의 크기에 따라 변경하는 방법도 3 도표 북부 미시시피, 미국에서 주문 스트림. 이전의 연구는이 스트림에서 퇴적물 입자의 세균성 지역 사회가 사회 구조의 분자 분석을 기반으로 세 가지 그룹으로 분리 될 수있는 것으로 나타났습니다 : 0.063 mm 입자, 0.125에 그, 0.25, 0.5 mm 입자에 그, 그 1mm에 (15)는 입자. 세포 외 효소 활성의 패턴의 분석은 이러한 결론을 지원 포스파타제 (도 3a)와 0.125, 0.25, 및 0.5 mm의 입자에 유사한 것으로하지만, P는 NP-결합 기판 기술을 사용하여 측정시, 1 및 0.063 mm 분획에 훨씬 높다. O이러한 β-글루코시다 아제 (그림 3B), 그리고 나.......

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토론

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토양과 퇴적물에있는 미생물의 세포 외 다양한 효소의 활동을 결정하는 것은 영양 광물 및 유기물 처리 17의 속도로 유용한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나 토양은 수분 수준이 다를 수 있으므로 토양 건조 중량으로 활동을 표준화하는 것이 중요합니다. 이것은 단순히 효소 활성을 측정 넘어 (전형적 이틀) 추가로 건조 공정을 필요로한다. 따라서, 즉각적인 결과를 제공하는 근처에 물 샘플에있는 효소 활성의 분석에 대비, 토양 및 퇴적물에있는 효소 활성의 신뢰할 수있는 분석은 몇 일이 소요된다. 일부 토양의 경우, 심지어는 건조 과정을 넘어 추가 애싱 단계 (500 ° C에서 일반적으로 2 시간)을 필요로하는 유기물 또는 재 무료 건조 질량의 그램 당 활동을 표현하는 것이 더 적절할 수있다. 관계없이, 토양 또는 퇴적물 효소 활성의 비색 분석에서 가장 중요한 단계는 딥 - 웰 블록 F로부터 상등액 철수이다배양 기간의 끝에서 원심 분리를 따르게. 이 절차는 흡광도를 측정에 의존하기 때문에, 최종 마이크로 몇 부유.......

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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이 작품의 측면에 대한 자금 조달은 미국 농무부 구체적인 협력 계약 58-6408-1-595과 국립 과학 재단 (상 1049911)를 포함하여 다양한 소스에 의해 제공되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
< 강> 시약 및 재료 < / 강>
빙산다양한 공급 업체
아세트산다양한 공급 업체 수
산화다양한 공급 업체
p< / em>-NitrophenolFisherBP612-1교대 가능
p-니트로페닐 (pNP)-인산염시그마N3234pNP-substrate
pNP-β-glucopyranosideSigmaN7006pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminideSigmaN9376p NP-substrate
Clear 96-well microplatesFisher12-563-301대체 사용 가능
96-well 딥 웰 블록Costar3958대체 사용 가능
알루미늄 계량 팬다양한 공급업체
멸균 15ml 원심분리기 튜브다양한 공급업체
멸균 50ml 원심분리기 튜브다양한 공급 업체
4-Methylumbelliferone시그마M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphateSigmaM8883MUB-substrate
4-MUB-glucopyranosideSigmaM3633MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminideSigmaM2133MUB-substrate
중탄산다양한 공급업체
검은색 96웰 마이크로플레이트Costar3792
피펫 저장소다양한 공급업체
EQUIPMENT
CentrifugeEppendorf5810R
Centrifuge rotorEppendorfA-4-81마이크로플레이트/딥웰 블록용
마이크로플레이트 리더BioTekSynergy HT대체 사용 가능
마이크로플레이트 형광측정기BioTekFLx 800대체 사용 가능
8채널 피펫터다양한 공급업체
나트륨 나트륨 나트륨: , , ,

참고문헌

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  1. Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
  2. Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Woo....

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