유동 세포 계측법에 의해 인간 호중구에 핵 팩터 활성화를 감지 할 간단하고 효율적인 방법

Summary

호중구는 혈액에서 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 호중구는 전 염증성 크린 시토 킨 및 apoptosis의 억제 생산 등 transcriptionally 규제 기능을 가지고 있습니다. 이 기능은 절연 핵에 유동 세포 계측법에 의해 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수 있습니다 여기에 제시된 방법으로 공부 할 수 있습니다

Abstract

호중구는 말초 혈에서 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 이러한 세포 따라서 미생물을 침해에 대한 방어의 첫 번째 줄되고, 염증 및 감염의 사이트에 게재 처음입니다. 호중구는 phagocytosis, lytic 효소의 출시, 그리고 반응성 산소 종의 생산과 같은 중요한 항균 기능을 가지고 있습니다. 다음과 같은 중요한 방어 기능뿐만 아니라, 호중구는 전 염증성 크린 시토 킨 및 apoptosis의 억제 생산 등의 감염에 대한 응답으로 다른 작업을 수행 할 수 있습니다. 크린 시토 킨은 감염을 선명하게 할 수 다른 백혈구를 모집하고, apoptosis의 억제는 호중구는 감염의 사이트에 더 오래 살 수 있습니다. 이 함수는 스크립트 수준의 규제를받습니다. 호중구는 수명이 짧은 세포이기 때문에 더 effi가 없기 때문에 그러나, 이러한 세포의 transcriptionally 규제 응답의 연구는 종래의 리포터 유전자 방법으로 수행 할 수 없습니다호중구 transfection에 대한 cient 기술. 여기, 우리는 유동 세포 계측법에 의한 분리 및 immunolabeled 핵의 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제시한다. 우리는 인간의 말초 혈액에서 순수 호중구를 분리하는 기술을 설명, 안티 - 수용체 항체와 함께이 세포를 자극 분리하고 immunolabel의 핵 및 유동 세포 계측법에 의해 핵을 분석 할 수 있습니다. 방법이 성공적으로 호중구 및 다른 세포 유형에서 핵으로 NF-κB와 엘크-1 핵 요소를 검색하는 데 사용되었습니다. 따라서,이 방법은 세포 유형의 다양한 절연 핵에서 전사 인자의 활성을 분석하기위한 옵션을 나타냅니다.

Introduction

호중구는 말초 혈 ^1의 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 염증과 감염 호중구 동안 그들은 방어 ^2의 첫 번째 줄의 역할을 어디에 해당 사이트에 표시 할 수있는 최초의 세포입니다. 호중구는 phagocytosis, 반응성 산소 종의 생산, degranulation의 lytic 효소의 출시, 그리고 ^4,5 염증성 크린 시토 킨의 생산 등 여러 가지 항균 메커니즘 ³ 가지고 있습니다. 호중구는 빠른 속도로 다양한 세포 표면 수용체에서 신호를 통해 작동하게 수명이 짧은 세포입니다. 호중구는 자신의 짧은 수명으로 인해 터미널 셀을 고려하여 염증 과정을 ^여섯 동안 활성화하지 않는 한 그들은 apoptosis를 받아야하기 때문에, 그것은 그들은 또한 특정 유전자의 전사 수준을 변경하여 자신의 표현형을 수정할 수 있도록 지금 명확되어 있지만. 크린 시토 킨 ⁵ apoptosis ^7,8의 억제의 생산은 두있다,mportant 활성화에 의존적 세포 기능은 호중구의 전사 수준에서 조절. 원자력 요소 κB (NF-κB)는 시토 킨 생산 ^(4)의 전사 조절과 세포 생존과 다양한 세포 유형에 apoptosis ^9-11의 규정에 참여하고 있습....

Protocol

1. 인간의 피에서 호중구의 절연 (PMN)

1. 항응고제로 헤파린 (10 U / ML)로 약 20 ML 인간의 피를 사용하십시오. 피 venopuncture으로 성인 건강 자원 봉사자로부터 수집되었다. UNAM - 모든 실험은 Instituto 드 Investigaciones Biomédicas의 생명 윤리위원회의 승인하에 수행되었다.
2. 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 PBS에서 6% dextran T500의 2 ML을 넣고 혈액의 10 ML를 추가합니다. 반전 지하철로 두 세 번 혼합하고 적혈구 침강을 할 수 있도록 45 분에 앉아 보자.
3. 신선한 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브의 5 ML Ficoll-Paque두고.
4. sedimented 적혈구 위에 형성 백혈구 풍부한 플라즈마을 가지고, 신중하게 두 번째 층을 형성 Ficoll-Paque 상단에 피펫. 두 단계가 있는지 확인합니다.
5. 4 ° C.에 20 분에 516 XG에 원심 분리기 원심 분리 한 후, 플라즈마 및 Ficoll-Paque의 계면에서 mononuclear 세포의 층이 있습니다. NEutrophils는 튜브의 하단에 있습니다.
6. 표면에 뜨는을 제거, 선반 위에 튜브를 활용하여 세포 펠렛을 아프게하고, 감기의 10 ML (....

Results

정화 방법은 여기에 설명하는 것이 95 % (그림 1A)보다 큰 결함으로 unstimulated 호중구 (PMN)를 제공합니다. 절연 PMN 그런 다음 특정 단클론 항체와 crosslinking 특정 수용체​​에 의해 자극 될 수 있습니다. 우리는 FC 수용체와 integrins (그림 1B)를 통해 PMN을 자극했다. 일단 자극, PMN은 lysed하고 핵은 높은 수율로 분리되어 있습니다. 핵은 그러한 특정 항체와 핵 요소 κB (NF-κB), (그림 1B) 등의 특정 핵 요소에 대한 immunolabeled 있습니다.

핵은 쉽게 점 플롯 (그림 2A)로 흐름 cytometer에 그대로 PMN에서 다른 인구로 인식 할 수 있습니다. 쉬고있는 PMN에서 NF-κB의 기저 수준은 세포 핵 (그림 2B)에서 찾을 수있다. cros.......

Discussion

여기에 설명 된 정화 방법은 짧은 시간에 95 % (현미경 관찰에 의해 평가)보다 큰 결함이있는 unstimulated 호중구의 분리 (PMN)를 할 수 있습니다. 후자가 완전히 lysed되지 않은 경우 때때로 호중구는 적혈구에 의해 오염 될 수 있습니다. 적혈구와 PMN 쉽게 유동 세포 계측법에 의해 서로 다른 세포 집단으로 구별 할 수 있기 때문에 이것은 보통, 기술에 영향을주지 않습니다. 절연 PMN 그런 다음 특정 단클론 항체와 crosslinking 특정 수용체​​에 의해 자극 될 수 있습니다. 사실, PMN은 또한 약리 방법이나 다양한 기판 또는 다른 셀에 부착하여 자극 할 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 세포가 실질적으로 관련 생물학적 자극에 의​​해 활성화 된 후 PMN 핵의 핵 요인의 변화로 이어질 신호 경로를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

PMN이 자극되면이 문서에 설명 된 방법은 신속하고 effici이 가능immunofluorescence 및 유동 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Heparin	PiSA (멕시코)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
염화나트륨	시그마	S7653
인산나트륨 일염기성	시그마	S9638
인산나트륨 이염기성	시그마	S9390
소 혈청 알부민 (BSA)	시그마	A2153	콘 분획 V
HEPES	시그마	H3375
염화칼	시그마	P9541
염화 마그네슘 무수	시그마	M8266
DL- 디티오트레이톨 (DTT)	시그마	D9163
트리판 블루 (0.4 % 용액)	시그마	T8154
파라포름알데히드	시그마	P6148
트리톤 X-100	시그마	X100
소 태아 혈청 (FBS)	GIBCO	10437-028
단클론 항체 IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	인간 특이적 항-FcRII (CD32)
단클론 항체 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	인간 특이적 항-FcRIII (CD16)
단클론 항체 TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Martin Hemler 박사가 기증한	인간 특이적 항-항체-β 1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4	University of California, San Francisco	Eric J. Brown 박사가 기증	한 인간 특이적 항 -&# 946; 2 integrin (CD18)
F(ab')2 염소 anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-conjugated F(ab')2 염소 anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-conjugated F(ab')2 염소 anti-rabbit IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κ B p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	토끼 다클론 항체
Anti-NF-κ B p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
EQUIPMENT
strong>15-ml 원심분리기 튜브	Corning	430791
50-ml 원심분리기 Corning		430291
Centrifuge, Sorvall 탁상용	듀퐁 기기	RT 6000D
pH-meter	Corning	340
Pipetman 피펫 P-20	Gilson	F123600
Pipetman 피펫 P-200	Gilson	F123601
Pipetman 피펫 P-1000	Gilson	F123602
혈구계	Fisher Scientific	0267110
현미경	Nikon	Eclipse E600
도립 현미경	Nikon	TMS
수조 인큐베이터	Fisher Scientific	2IS-M
마이크로 원심분리기	Eppendorf	5414C
마이크로 원심분리기	Eppendorf	5418
유세포 분석기	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur