Method Article

현지화 된 조직 병리학 적 분석을 위해 망막 보철물 이식 처리 눈을위한 기법

DOI:

10.3791/50411

⸱

August 2nd, 2013

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1Bionics Institute, 2Department of Anatomical Pathology, St Vincent's Hospital Melbourne, 3Department of Pathology, University of Melbourne, 4Medical Bionics Department, University of Melbourne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

망막 자극기 내의 개별 전극에 바로 인접한 망막 cytoarchitecture를 시각화하는 기술.

Abstract

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망막 보철의 최근 발전과 함께, 그것은 전임상 연구에서 이러한 장치의 안전성을 평가하기위한 신뢰성있는 기술을 개발하는 것이 중요합니다. 하지만 표준 고정, 준비, 자동화 조직학 절차는 이상적인 없습니다. 여기에서 우리는 임플란트에 바로 인접한 망막의 상태를 평가하기위한 새로운 절차에 대해 설명합니다. 망막 보철 눈 조직에 접촉 전극 배열을 갖추고 있습니다. 이전 방법은 공간적으로 배열 내의 각 전극에 인접한 안구 조직을 지역화 할 수 없었다. 또한, 표준 조직 학적 처리는 종종 이식 눈을 평가 망막 층의 총 인공적인 분리의 결과. 따라서, 그것은 이식 된 전극 배열의 주입 자극에 의​​한, 존재하는 경우, 지역화 손상을 평가하기 어렵게되었습니다. 그러므로, 우리는 이식 전자에 인접한 안구 조직을 식별하고 지역화하는 방법을 개발(색상 코드) 염료 마킹 기법을 사용하여, 우리는 인공적인 망막 박리를 최소화하기 위해 눈을 고정 기법을 수정 lectrodes. 이 방법은 각각의 전극과 임플란트의 특정 부분의 국산화를 가능 공막 반투명 렌더링. 마지막으로, 우리는 조직 병리학 적 평가의 힘을 높이기 위해 대조군을 사용했다. 요약하자면,이 방법은 이식 눈 망막 cytoarchitecture의 안정적이고 효율적인 차별과 평가를 할 수 있습니다.

Introduction

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망막 보철는 곧 심각한 시력 상실의 다양한 형태의 치료에 유용한 임상 개입 될 수 있습니다. 일부 같은 색소 성 망막염과 같​​은 조건 (RP), 눈의 광 수용체의 광범위한 변성 결과, 이러한 신경 신호로 빛을 transducing에 대한 책임을 세포입니다. 그러나 망막의 다른 레이어에있는 일부 세포가 남아 망막 보철 1 전기 자극에 대한 잠재적 인 공격 대상입니다. 인간의 임상 실험에서 초기 결과는 전극 망막 2,3, 망막 4,5에 이식 배열, intrascleral 6 위치에 대한 약속되었다. 이러한 장치는 다른 모양과 다른 재료로 만든,하지만 그들은 모두 시각적 지각을 만들기 위해 망막의 잔여 가능한 뉴런을 활성화하기 위해 전기 펄스를 사용하고 있습니다.

우리의 넓은 그룹 (생체 공학 비전 호주) 진행이가 망막 임플란트를 개발했습니다맥락막 상강 전극 배열 (임상 시험 번호 : NCT01603576)와 이식 3 RP 환자와 임상 시험 연구에 나오지. 그림 1A이 맥락막 상강 프로토 타입 망막 보철물을 보여줍니다.

환자의 안전은 인체에 실험을 시작하기 전에, 우리는 (그림 1B) 전임상 모델에서 광범위한 급성 및 만성 테스트를 수행함으로써 임상 연구에서 가장 중요합니다. 조직 병리학 적 평가는 수술을 세분화 전극 디자인을 통해 반복하고, 궁극적으로 임플란트의 안전을 확립하는 것이 필수적이었다. 표준 임상 병리 관행이되었으며, 효율적인 워크 플로우를 유지하기 위해, 파라핀 임베딩 기술이 채택되었다. 그것은 또한 쉽게 병리학 자에 의해 해석되는 haematoxylin과 에오신 (H & E)와 같은 임상 기준과 비교 염색 절차를 활용하는 것이 바람직했다. 우리는 또한 면역 조직 화학 분석에 적용 할 수있는 기술에를 원또한 조직의 세포 평가를 촉진하기 위하여.

임플란트 재료, 만성 전기 자극의 안전의 생체 적합성은 신중하게 평가해야합니다. 그것은 배열 내의 개별 자극 전극에 인접한 안구 조직의 조직 병리학을 검토 할 수있을 것이 중요합니다. 그러나 배열은 테스트 할 수 있도록 샘플을 처리하기 전에 제거 할 필요가, 그들의 금속 부품은 쉽게 단면 수 없습니다 때문입니다. 따라서, 우리의 설립 조직 준비 이식 전극 7에 대해 조직의 현지화 및 매핑을 허용하지 않았다. 조직의 지역화 방법의 부족뿐만 아니라, 표준 포름 알데히드 기반의 고정 및 처리 기술은 눈의 다양한 계층의 차등 수축률 (그림 2)에 망막 따라 광범위 유물과 분리습니다. t의 비 동질성으로 인해그는 망막, 그것은 특히 정량적 측정, 제어 조직에 유효한 비교를하기가 어렵습니다. 이 결합 제한은 우리의 이식 배열에 의한 손상의 정확한 평가를 복잡.

여기에서 우리는 이러한 한계를 극복하기위한 새로운 기술을 제시한다. 우리는 파라핀 기반의 조직학과의 호환성을 유지하기 위해 전문적인 눈을 고정 및 처리 기술 8-10을 수정했습니다. 우리는 임상 병리학의 의견에 따라 비교 결과를 제공하는 표준 조직 학적 및 면역 얼룩을 수정했습니다. 공막 조직 반투명 렌더링 한 후, 염료 기반 컬러 코드는 맥락막 상강 공간에서 배열을 제거하기 전에, 각 전극에 인접한 안구 조직을 표시하기 위해 사용되었다. 전극 배열과 각각의 전극 위치를 표시하여, 샘플을 정확하게 전극의 인접 지역에서 수집 할 수 있습니다. 일치하는 샘플은 일에서 수집 할 수전자 제어 눈 쌍 비교를 용이하게하기 위해합니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 안구 적출술 및 사후 고정

이 프로토콜은 피사체가 맥락막 상강 전극 배열을 일방적으로 이식 된 것으로 가정합니다.

  1. 유리 쇼트 병에 접미사 솔루션을 준비합니다.
    1. 데이비슨의 정착액 솔루션 100 ml의 2 배
      • 포르말린 2 ㎖ (37 % 포름 알데히드)
      • 10 ㎖ 빙초산 (99.7 %)
      • 35 ML 에탄올 (98 %)
      • 53 ML 증류수
    2. 50 % 에탄올 100 mL를 2 배
    3. 70 % 에탄올 100 mL를 2 배
  2. Transcardially 따뜻함 제목을 붓는다 (37 ° C) 다음에 헤파린 생리 식염수 감기 (4 ° C) 중립 (10 %) 포르말린.
  3. 두 눈의 윤부 (또는 맥락막 상강 배열에서 원격 위치)에서 봉합을 연결 - 직근에 맞춰, 랜드 마크 역할을 할 수 있습니다.
  4. 명백히 눈, 이식 눈에서 외부 리드를 유지.
  5. EAC를 놓고H 데이비슨의 정착액 솔루션 100 mL에 눈과 상온에서 사후 해결하기 위해 떠난다.
  6. 18 후 - 70 % 에탄올 (실내 온도)에 마지막으로 다음 8 시간 - 데이비슨의 고정액에 36 시간, 6에서 50 % 에탄올 (실내 온도)로 전송.
  7. 4에서 샘플을 냉동 해부까지 ° C 및 저장.

손상 및 가압 아이 글로브는 부정적인 결과 조직학에 영향을 미치지없이 3 개월이 방법에 저장되어있다.

2. 식별 및 조직 매핑

위의 고정 프로토콜 (단계 1) 공막 반투명 렌더링하고 배열을 지금 볼 수 있습니다 - 각 전극 위치 (그림 3)를 포함.

  1. 에탄올 이식 지구를 제거하고 조심스럽게 결막과 테 논낭 등의 과잉 조직을 멀리 트림. 3mm 길이 (그림 3A) - 2 시신경을 잘라.
  2. 조직 학적 염색 markin를 사용하여G 계획, 미리 정의 된 색상 코드 레이블이 전극은 염료를 더럽되지 않도록주의.
  • 우리는 전문 조직 학적 염색의 시판 스위트 (부록 참조) 선택했습니다. 염료의 소량주의 깊게 조직에 뾰족한 페인트 브러시 (Roymac 크기 00)를 적용하여 최대 5 분까지에서 건조 할 수 있었다.
  • 다른 활성 전극 빨간색; 큰 직경의 반환 전극 황색; (했다)이었다 활성 전극 (들) 녹색 연구 기간 동안, suprathreshold 수준에서 최대한 자극 : 우리의 목적을 위해, 우리는 선택했다 추가 가이드 및 / 또는 해부학 거리 표시 (그림 3B 및 3C) 파란색.
  • 약간의 시행 착오가 후속 단계에 걸쳐 안정 염료를 발견해야 할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 4에, 그것은 녹색 염료 붉은 염료보다 더 탄력적이라고 ​​볼 수있다. 70 % 에탄올에 염료를 희석하여 지질 penet을 향상시킬 수배급 및 조직 코팅.
  • 그것은 나중에 참조 염색 지구를 스케치하거나 촬영하는 데 유용합니다.
  1. 염료를 탈수 70 % 에탄올로 돌아갑니다.
  2. unimplanted 제어 글로브 2.1 단계를 반복합니다.
  3. 단계 1.3에서 봉합사를 사용하여 제어 눈과 미러링 쌍으로 이식 눈을 맞 춥니 다.
  4. 임플란트 이식 배열 위치의 준비를 시각화 할 수 있도록 이식 눈 (NB 반투명 공막과 2.2 단계에서 염료 표시에 위치하고으로 컨트롤 눈에 미러 위치에 실리콘 템플릿 (전극 배열과 같은 크기로) 배치 ).
  5. 각각의 이식 전극 사이트 해부학 비교 (즉, 미러가 상당 일치) 위치 제어 쌍을 수 있도록, 단계 통제 눈을위한 2.2 2.3를 수행합니다.

3. 해부 및 포함

  1. 눈에서 임플란트 배열을 제거하고 눈의 앞쪽을 제거(각막, 홍채 렌즈 포함). 나머지 아이 컵 (후방 챔버)에서 유리체 액체를 제거합니다.
  2. 여러 대표 스트립 (1 ~ 2 mm 두께) 염료 표시 영역 (그림 3D)의 하위 집합을 포함하는 각에 이식 눈을 해부하다. 스트립의 방향이 임플란트 7 조직 반응의 다양한 측면을 평가에 도움을 선택해야합니다.

그것은 염료 영역이 각 지구와의 상대적인 위치 (및 색상)에 존재하는의 기록을 만들기 위해 나중에 참조 할 수 있도록 유용합니다.

  1. 처음 마주 아래쪽 (그림 3E)를 절단 할면 -; 액화 한천의 얕은 수영장 (90 ° C 80 4 %)에 자사의 측면에 스트립을 놓습니다.
  2. 일단 한천 설정 폼을 삽입합니다 (그림 3 층)에서 지원하는 조직 카세트에 시료와 장소 주위 인하했다.
  3. 반복 제어의 눈에 대한 3.1-3.3 단계 - 탁ING 케어 거울 일치 스트립을 해부한다.
  4. 표준 (야간 자동) 파라핀 가공 기술을 통해 모든 카세트를 처리합니다.
  5. 처음 마주 아래​​쪽을 절단 할면 파라핀 처리 조직을 포함합니다.

4. 절단 및 염색

  1. 2 단계와 3 단계에서 노트를 정기적으로 참조 5 μm의 섹션으로 파라핀 블록을 잘라.
  2. 염색 각 지역에서 섹션을 수집하고 슬라이드에 장착합니다.

공막의 각 염색 현장 바로 옆 지역은 지금은 배열에서 해당 전극 (그림 4)에 가까운 근접 있다는 자신감과 함께 평가 될 수있다.

  1. 얼룩이나 원하는대로 면역을 수행합니다. 그림 5의 예를 들어 얼룩과 면역는 : H &E; Luxol 빠른 블루 (LFB) 크레 실 바이올렛, 메이슨의 trichrome 블루, 주기적으로 산 쉬프 (PAS) Perls '감청 역에서, 안티 - 글루타민 합성 효소 (GS), 안티 - 신경 미세 섬유 단백질 (NF), 안티 - 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)와 4 ',6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI).
  2. 표준 및 특수 얼룩 자세한으로 수행 하였다 :
    1. H & E 염색 라이카 multistainer 목욕 배열 ST5020 (라이카 생물계)에서 제공하는 프로토콜에 따라 수행되었다.
    2. LFB와 크레 실 바이올렛 (11에서 수정)
      1. 크실렌의 3 변화 (배 2 분)과 에탄올의 2 변경 (100 %, 100 %) (배 1 분)과 수돗물 (45 초)에 린스 Dewax.
      2. 95 % 에탄올로 수화 섹션을 참조하십시오.
      3. 37 LFB 솔루션 11 위 - 42 ° C (하룻밤).
      4. 초과 70 % 에탄올로 얼룩을 씻어 낸다.
      5. 증류수에 씻어.
      6. 묽은 탄산 리튬의 장소 (8 %) (몇 초).
      7. 70 % 에탄올 (몇 초)로 구분.
      8. 증류수에 씻어.
      9. 필요한 경우 B까지, 4.4.2.8 단계 4.4.2.6를 반복고는 ackground은 무색이다.
      10. 37 ° C (10 분)에서 크레 실 바이올렛 아세테이트 작업 솔루션의 장소입니다.
      11. 물로 세척하지 마십시오.
      12. 절대 알코올의 3 변화 (1X 30 초, 2 배 20 초)과 크실렌의 3 변화 (1X 1 분 30 초, 2 배 1 분)에서 탈수.
      13. DPX와 마운트와 coverslip을.
    3. 메이슨의 trichrome 블루 (11에서 수정)
      1. 4.4.2.1에 따라 Dewax.
      2. 섹션 물 (2 분)을 가져옵니다.
      3. Weigert의 철 haematoxylin (2 분)를 사용하여 핵을 얼룩.
      4. 수돗물에 씻고 증류수에 씻어.
      5. 비 에브리 히 주홍 산성 푹신 용액 (5 분)에 얼룩.
      6. 증류수에 씻어.
      7. 콜라겐 창백한 핑크 (6 분) 때까지 phosphomolybdic-phosphotungstic 산에서 차별화.
      8. 증류수에 씻어.
      9. 아닐린 블루 (1 분)에 Counterstain.
      10. 1 % 아세트산 (1 분)에서 잘 씻으십시오.
      11. P로 탈수, 마운트 및 coverslip에어 4.4.2.12 및 4.4.2.13.
    4. PAS (11에서 수정)
      1. 4.4.2.1에 따라 Dewax.
      2. 1 % 정기 산 (15 분)에서 산화.
      3. 물에 증류수를 실행에 씻으십시오.
      4. 시프 시약 (15 분)에 얼룩.
      5. 물 (5 분)에 씻으십시오.
      6. 해리스 haematoxylin (1 분)에 Counterstain.
      7. 수돗물에 잠시 씻으십시오.
      8. 0.5 % 산성 알코올 (1 딥)에서 차별화.
      9. 수돗물에서 잘 씻으십시오.
      10. 스콧의 수돗물 (1 분) 블루.
      11. 물에 잘 씻는다.
      12. 4.4.2.12 및 4.4.2.13에 따라 마운트와 coverslip을 탈수.
    5. 11에 설명 된대로 Perls '감청 얼룩.
  3. 면역 형광 염색 자세한으로 수행되었다 :
    1. 4.4.2.1에 따라 Dewax.
    2. 증류수 (배 5 분)에 씻어.
    3. ° C (20 분) 80-75시 0.01 % 구연산 버퍼, 산도 6을 사용 항원 검색을 수행D 0.01 %의 구연산 완충 용액 (20 분)에 냉각 할 수 있습니다.
    4. 인산염 세척 섹션 식염수 (PBS)을 (2X 5 분) 버퍼.
    5. 세척 완충 용액 (10 분)의 세포막을 Permeabilize.
    6. 혈청 블록 솔루션 (2 시간)에 품어.
    7. 항체 희석액에 희석 한 일차 항체 (10 % 정상 염소 serum/0.1 % 트리톤 X-100/PBS) (냉장고에 하룻밤)의 섹션을 품어. 사용 된 각 일차 항체의 역가가 표 1에 나타나있다.
    8. 하룻밤 배양 한 후 세척 완충액 (배 3 분)로 섹션을 씻으십시오. 이 점에에서 어두운 부분을 유지합니다.
    9. 특정 기간 (자세한 내용은 표 1 참조) 1:500의 역가에 해당하는 이차 항체의 섹션을 품어.
    10. 세척 완충 용액 (배 5 분)의 섹션을 씻으십시오.
    11. DAPI (1:25,000 / PBS) (30 분)의 섹션을 품어.
    12. 세척 완충 용액 (배 5 분)의 섹션을 씻으십시오.
    13. 마운트 및 coverslip에 형광을 사용하여NT 장착 매체.

시험 시료 및 제어 샘플 쌍 비교를 위해 준비가되어 있습니다.

Results

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그림 4는 그림 3에 묘사 된 샘플을 절단에서 얻은 대표적인 섹션을 보여줍니다. 섹션은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 H & E와 5 μm의 두께와 스테인드에서 절단되었다. 샘플 스트립의 총 모양은 최소 차동 조직 아티팩트 (그림 4A)로 유지됩니다. 녹색 염료 빨강 (그림 4B)보다 더 탄력 있었지만 모두 염료 표시는, 공막에 표시 하였다. 망막 층은 artifactually 분리되지 않은 및 망막 형태는 (그림 4C) 보존됩니다. 배열 전극의 위치에 해당하는 염료 표시에 인접한 망막 조직은 쉽게 식별 할 수 있습니다.

그림 5는 조직 섹션의 대표 특수 염색 및 면역 현재 프로토콜에 따라 제조이다. 5 오세영 그림을 참조하십시오특정 얼룩과 사용에 적용된 수정 사항에 대한 자세한 사항 n과 보충 자재. 수정 후,이 얼룩 및 면역 설립 기준에 해당했다 - 병리학 자에 의해 검증으로.

차 항체 역가의 유형 (괄호 안) GFAP (1:1500) NF200 (1:100) GS (1:100)
이차 항체 역가의 유형 (괄호 안) 알렉사 플 루어 594 알렉사 플 루어 488 알렉사 플 루어 488
이차 항체의 배양 기간 1 시간 2 시간 45 분

표 1. 항체 종류, 역가 및 라벨링 기간.

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그림 1. SuprachoroIDAL 프로토 타입 전극 배열입니다. 임상 등급 성형 배열의) 매크로 사진. B) 수제 전임상 배열의 현미경 사진.

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그림 2. 전 망막 조직학. 표준 조직 학적 방법은 다음을 준비하는 데 사용 된, H & E 염색, 맥락막 상강 전극 배열을 이식 눈의 섹션을 참조하십시오.) 전극 배열 캐비티 (별에 의해 설명)를 통해 직교 섹션을 참조하십시오. 망막은 외부 안구 조직에서 분리된다. 이 이식 부위 (화살표) 아래에 특히 분명하다. 이 배열의 각 전극에 인접한했다 망막의 어떤 부분을 결정하는 것은 불가능하다. Scalebar = 1mm. B) 패널 박스 영역의 높은 배율. 망막 앙레에서 정기적으로 간격, 여러 가지 유물이 있습니다RS (화살표)뿐만 아니라, tapetal 층 (고양이 눈에서 반사 층)에서 주요 분리. Scalebar = 100 μm의. C) 패널 B에서 박스 영역의 높은 배율. 화살표 박리 등의 생체 외상이나 병리에 의해 발생되는 반대, 처리의 부작용 인공적인 것을 제안, 광 수용체의 외부 세그먼트뿐만 아니라, 그대로 남아있는 색소의 상피 세포를 지적했다. Scalebar는 = 20 μm의.

figure-results-3
그림 3. 전극 인접 조직. 광고의 현지화 및 해부) 현장에서 맥락막 상강 전극 배열 적출 눈의 높은 동적 범위 매크로 사진.) 포스트 데이비슨의 고정액으로 고정하고, 사전에 배열 제거에, 반투명 공막의 시각화를 가능하게배열의 각 전극 (한 예는 화살표로 표시). B) 전극은 미리 정의 된 염료 색으로 표시됩니다. C) 해부학 적 랜드 마크에서 일정한 간격으로 염료 표시는 실험에서 일관성을 유지하는 데 사용됩니다. D)이 제거되면 배열, 눈이 샘플 스트립에 손으로 해부한다. 색 화살표는 공막에 전극을 인접 사이트 중 두 가지를 나타냅니다. 노란색 점선 단면의 평면을 나타냅니다. E) 패널 E에서 한천 - 소스 샘플 스트립, 거품 생검 패드에서 지원 잘라 끼워 카세트에 배치의 한천 블록. F에 내장 된 샘플 스트립의 매크로 사진) 매크로 사진 처리하는 동안 섹션의 움직임을 최소화 할 수 있습니다.

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그림 4. 새로운 망막 조직학. trong> 전극 포켓을 포함하는 위의 예제 스트립 (그림 3D에서), H & E.) 녹색과 빨간색 염색 한 지역 (그림 3D와 같은 화살표로 표시)와 5 μm의 스테인드에 파라핀 임베디드 단면이었습니다은에서 볼 수 있습니다 섹션은 그림 3 차원 노란 점선의 수준에서 찍은 사진. 스케일 바는 1,000 μm의. 망막 배열 포켓 아래도 원격으로도, 분리되지 않습니다. B) 패널에서 박스 영역 표시 빨간색과 녹색 염료로는 화살표로 표시하고, 그대로 망막에 걸쳐. 스케일 바는 = 500 μm의. 녹색 염료에 인접한 그대로, 첨부, 망막를 보여주는 패널 B에서 C) 박스형 지역. 스케일 바는 = 50 μm의. 염료의 위치가 전극의 위치에있는 경우, 우리는 자신있게 전기 자극에 의​​한, 손상 인접한 망막 조직을 평가할 수 있음을 나타냅니다 것을 알고.

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그림 5. 특별한 얼룩 및 면역을 사용하여 수정 망막 cytohistochemistry의 예.만큼 주요 프로토콜 텍스트에 설명 된 표준 포르말린 고정 기술, 일반적인 염색 프로토콜에 필요한 변경에 반대 데이비슨의 고정액의 사용. 병리학 이러한 수정은 해당 염색 결과 확인되었습니다.) H는 &E; 핑크 에오신 얼룩 세포의 세포질, 콜라겐과 지원 조직의 다양한 음영이. B) LFB는 얼룩 수초 블루 크레 실 바이올렛 counterstain가에 보라색 haematoxylin 얼룩 세포 핵 사용할 수 있지만 동시에 . perikaryon 파란색에서 Nissl 시체를 염색하고 세포를 둘러싸고있는 위성 세포를 강조 신경절 세포를 식별 C) 메이슨의 trichrome 청색, 에브리 히 주홍 산성 푹신 솔루션 얼룩 근육 Fi를BERS 빨강, 아닐린 블루 얼룩은 콜라겐,이 경우 공막, 파란색 D) PAS 동안,.. haematoxylin 세포 핵 보라색 E) Perls '감청을 counterstains 동안 지하 막과 결합 조직 성분의 당 단백질 구성 요소는 보라색 염색된다; 중립 붉은 얼룩 색상의 추가가 빨간색 리소좀 동안 출혈의 사이트에서 철 복합체의 저하 적혈구 및 릴리스 haemosiderin의 형성 보라색 색상을 생산 F) GS는;. 뮐러 세포가 13이되는 신경 전달 물질 분해 효소 (녹색 .), 내부 핵 계층과 내부 경계 막 G) NF-200를 형성 뮐러 세포 endfeet에서 뮐러 세포 기관으로 양쪽 방향으로 연장 볼 수 있습니다,이 무거운 사슬 골격 단백질 (녹색) 셀 소마와 프로세스에서 발견 뉴런 14,15의 구조를 유지하기 위해 다른 neurofilaments와 가교. 신경절고양이 망막의 내부 핵 계층의 외부 국경에있는 수평 세포의 축삭은 또한 강조하는 동안 세포와 그 축삭은 신경절 세포 레이어와 신경 섬유 층에서 볼 수 있습니다. . DAPI (파란색)와 Counterstaining은 망막 층의 시각화 H) GFAP 수 있습니다,이 세포 골격 단백질 (적색), gliosis 16시 뮐러 세포와 성상 세포의 증식에 내부를 통해가는 확장을 형성 뮐러 세포와 신경 섬유 층을 일렬로 볼 수 있습니다 바깥 쪽 망막 층. DAPI와 Counterstaining은 (파란색) 망막 층의 시각화 할 수 있습니다. 모든 패널의 스케일 바는 = 50 μm의. 안쪽 망막은 각 이미지의 상단에 표시되며 외부 망막 subscleral 반응을 보여 패널 E, 제외, 각 이미지의 하단에 표시됩니다.

Discussion

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임플란트의 안전성을 평가하는 임상 연구를위한 주요 고려 사항이다. 망막 보철물이 인간에 이식하기 전에 그것이 어떤 악영향을 미치지 않을 것이라는 점을 확인하는 것이 필수적입니다. 이 임플란트 생체 적합성 17-23뿐만 아니라 24-26 만성 전기 자극에 의해 발생 될 수있는 모든 잠재적 인 손상 모두에 대한 평가가 필요합니다. 이러한 인공 와우와 유사한 신경 보철, 경험은 자극의 넓은 범위 및 조직 손상 27가 발생하지 않습니다 물리적 매개 변수에 대한 통찰력을 제공합니다. 그러나 망막 다른 주입 사이트에 서로 다른 특성 때문에 정확한 안전 기준 (예 : 최대 충전 밀도 등) 다른 시스템에서 이전의 연구에서 가정 할 수 있습니다. 충전 밀도는 활성 전극 사이트에서 가장 높은이 손상에 대한 큰 잠재력과 일치합니다. 직접 인접 조직을 지역화 따라서 방법각 활성 전극에 크게 이러한 연구의 유용성을 증가시킬 것입니다. 임플란트의 특정 지역에 인접한 조직은 또한 가까운 검사에 강조 표시 할 수 있습니다. 이 타겟 접근 방식은 "최악의 시나리오"를 검토했다 유지 신뢰하는 동안, 분석 할 적은 부분​​을 허용합니다.

여기에 설명 된 공막 염색 지역화 방법은 광범위 손 모양과 성형 실리콘 / 백금 전극 배열을 28-30로 테스트되었습니다. 그것은 박막 폴리 아미드 배열 7,31 또한 박막 실리콘 / 태평양 표준시 배열을 32로 사용되었습니다. 일부 망막 보철 연구 intrascleral 착상 33과 "총알 모양의"전극을 채택했다. 본 기술은 전극 배열의이 유형을 평가하기위한 효과적이어야한다. 얇은 공막을 가진 고양이 눈 (극부 90 두께 - 200 ㎛) 배열의 각 전극의 시각화를 허용했다. 그러나 경우에도 개별 전기DES는 자신의 위치를​​ 쉽게 배열의 외곽선 (단계 2.6에서 사용되는 것과 유사한) 볼 수있는 실리콘 템플릿을 사용하여 추론 할 수있는 보이지 않았다.

염료 매핑 염료 현재 만 섹션을 얻을 수있다 비 관련 조직 섹션을 얻을 필요성을 제한합니다. 정확하게 전극의 위치를​​ 추론하는 능력은 관련 조직 병리학 적 분석과 큰 전력 통계 수 있지만, 노동 비용뿐만 아니라 사용되는 슬라이드와 블레이드의 양을 줄임으로써 시간과 비용 관리에 큰 영향을 가지고뿐만 아니라. 부착하고도 흠 조직 섹션에 표시되는 동안 조직의 처리를 견딜 수있는 염료의 사용이 중요한 초기 고려 사항이다. 해부에서 조직의 염료 방향 및 포함시 위치의 지식은 절단 과정을 지원합니다. 이 제대로 비스듬하게 절단되지 않은 부분을 달성하기 위해 블록을 배향 포함 전체 representati을 제공합니다조직의합니다. 그것은 절단을 수행하는 사람이 염료 응용 프로그램, 해부 및 포함시 존재한다는 것이 중요하다.

전체 프로토콜은 특히 고정 타이밍으로, 사소한 변경에 대한 강력한 것입니다. 그러나, 눈의 해부 및 염료 표시 단계는 좋은 손재주의 혜택은 시편의 손상을 방지 할 수있는 섬세한 과정이다. 데이비슨의 정착은 임플란트 주변 망막의 인공적인 분리를 줄이는 효과가 입증 동안, 그것은 해부 동안 직접적인 기계적 손상을 방지하지 않습니다. 데이비슨의 정착은 특별한 조직 학적 및 면역 절차와 쉽게 호환되지 않았습니다. 따라서 위에서 설명한대로 다음 단계를 수정 / 최적화 할 필요가 있었다. 최적의 결과를 얻을 때까지 염색 시간과 농도 증분 변경되었다 - 자세한 내용은 보충 자료를 참조하십시오.

망막의 정량조직학 문제가 남아있다. 망막은 비 균일하며 두께와 지역 centralis 34,35에서 거리 증가와 세포 밀도의 변화 모두. 따라서 이식 된 안구 내 주변의 조직은 비교를 위해 사용할 수 없으며 컨트롤 눈 대신 사용됩니다. 페어 제어 눈을 가진 각 섹션의 일치는 우리에게 병적 인 변화의보다 강력한 통계 비교를 제공, 대상 36 동료의 눈을 비교할 때 망막 보철에 효능과 안전성 결과는 더 나은 평가됩니다. 특별한주의는이 정량에 영향을 미칠 수로 경사 절단을 최소화하기 위해주의해야합니다.

요약하면, 방법은 크게 차례 더 효율적인 임상 워크 플로우하게되었다 우리의 조직​​ 병리학 적 분석, 개선 위에서 설명한. 이러한 방법을 사용하여 전임상 연구의 결과는 직접 3 RP 환자가 안전하게 suprachoroi에 이식되어있는 임상 시험을 주도DAL 망막 보철. 이러한 방법은 망막 자극 및 장기 이식에 대한 병적 인 반응을 평가해야 할 다른 안구 이식에 모두 적합하다. 이 방법은 임플란트에 대한 관심 영역에 병리의 cytoarchitecture 및 등록 유지를위한 가치있는 이점을 제공했다. 구체적으로 테스트되지는 않았지만, 이러한 절차의 수정은 배열이 피상적 이식, 특히 여기서 다른 종과 다른 해부학 적 위치에서 사용할 수 있습니다.

Disclosures

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저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgements

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저자는 감사드립니다 : 양 알렉 손더스 씨와 미셸 McPhedran 실험 지원, 전극 제조를위한 양 헬렌 펭, 박사 페니 알렌 및 수술 지원 조나단 예오, 로얄 빅토리아 눈과 귀 병원의 생물의 직원 동물 케어 연구 센터;에 걸쳐 일반적인 지침에 대한 교수 롭 셰퍼드, 박사 브리오니 Nayagam 및 원고의 초안 양식에 중요한 주석 씨 로널드 양조위.

이 작품은 생체 공학 연구소와 세인트 빈센트 병원, 멜버른에서 수행되었다. 기금은 이안 포터 재단, 존 T 리드 자선 신탁 및 생체 공학 비전 호주 (BVA)에 슈퍼​​맨 비전 과학 기술 기금에서 특별한 연구 이니셔티브를 통해 호주 연구위원회에 의해 제공되었다. 생체 공학 연구소는 그것의 운영 인프라 지원 프로그램을 통해 빅토리아 정부로부터받은 지원을 인정합니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
The Davidson 마킹 시스템Bradley Products1163-4 - 빨강 1163-5 - 파랑 1163-2 - 노랑 1163-1- 녹색 
토끼 다클론 항신경교세포 섬유상 산성 단백질 항체MilliporeAB58041:1500, 하룻밤 배양
마우스 단클론 항글루타민 합성효소 항체MilliporeMAB3021:100 하룻밤 배양
단클론 마우스 항신경필라멘트 200 항체Sigma-AldrichN01421:100 하룻밤 배양
4',6-디아민디노-2-페닐린돌, dilactate (dilactate)Life TechnologiesD35711:25,000 30 분 배양
Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgGLife TechnologiesA110291:500
Superfrost 90° 노란색Grale ScientificSF41299 
FLEX IHC 현미경 슬라이드DAKOK802021-2 
Alexa Fluor 594 염소 안티 토끼 IgGLife TechnologiesA110371:500
일반 염소 세럼Life TechnologiesPCN500010% 세럼/0.1% Triton X-100/PBS

Non-Standard Solution Preparation for Special Stains

1% 수성 Cresyl Violet 스톡 솔루션< / p>

  • Cresyl violet 1 g< / li>
  • 증류수 100 ml < / li> < / ul>

    Cresyl Violet Acetate Working Solution< / em>< / p>

    • 1 % 수성 크레실 바이올렛 스톡 용액 9 ml< / li>
    • 증류수 51 ml
    • 10% 아세트산 0.5 ml

    Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution

    • 1% Beihrich scarlet 90 ml
    • 1% Acid Fuchsin 10 ml
    • Glacial Acetic acid 1 ml

    포스포몰리브딕-포스프텅스텐 산 용액

    • 포스포몰리브딕산 2.5 g
    • 포스포텅스텐 산 2.5 g
    • 증류수 100 ml

    아닐린 블루 솔루션

    • 아닐린 블루 2.5 g
    • 빙초산 2 g
    • 증류수 100 ml

    면역조직화학을 위한 용액

    세척 완충액인산염 완충 식염수(PBS)의

    • 0.1% 트리톤 X-100

    혈청 블록 솔루션

    • 10% 일반 염소 혈청/0.1% 트리톤 X-100 PBS

    SUPPLEMENTARY MATERIAL

    Luxol Fast Blue

    Luxol Fast Blue(LFB) 염색을 수행하는 목적은 크레실 바이올렛의 카운터 염색을 통해 신경절 세포층의 신경절 세포를 확인하는 것이었습니다. LFB가 미엘린을 염색하는 동안 크레실 바이올렛 염색은 거친 소포체와 리보솜으로 구성된 뉴런의 Nissl 물질에 결합합니다. 망막의 수많은 세포에는 무축삭 세포를 포함한 Nissl 물질이 포함되어 있습니다. 이 세포들은 보통 내부 핵층의 내부 경계층에 위치하지만, 치환된 무축삭 세포는 신경절 세포층에서 발견될 수 있습니다. Nissl 물질의 염색은 크고 심하게 염색된 신경절 세포와 더 작은 변위된 무축삭 세포를 구별하는 데 도움이 됩니다. 이러한 세포의 시각화를 돕기 위해 작업 용액에서 cresyl violet stock 용액의 부피를 증가시켜 cresyl violet working solution protocol을 수정했습니다. 우리는 6.0ml에서 9.0ml로 1.0ml 단위로 부피를 늘려 증류수의 부피를 줄였습니다. 신경절 세포를 시각화하고 식별하는 것의 용이성을 평가하여, 9ml의 크레실 바이올렛 스톡 용액과 51ml의 증류수로 최적의 염색을 달성했습니다. 크레실 바이올렛은 염기성 염료이지만 Nissl 물질을 염색하려면 산성 용액에 사용해야하므로 아세트산의 부피는 0.5ml로 변하지 않았습니다 .

    Periodic Acid Schiff

    Periodic Acid Schiff (PAS) 염색을 강조하기 위해 수행되었습니다. 다당류, 특히 글리코겐은 기저막과 곰팡이 세포벽에서 발견되며 곰팡이 감염을 나타냅니다. PAS 염색 과정은 주기적인 산을 사용하여 다당류의 수산기를 산화시켜 알데히드기를 생성하는 것입니다. Schiff 시약의 적용은 자주색 세포 핵을 생성하는 haematoxylin counterstaining과 함께 자홍색을 생성하는 알데히드 그룹에 결합합니다. 우리의 슬라이드는 내부 제한 막에서 약한 염색을 보여주었습니다. 이는 모든 다당류, 특히 음이온성 다당류를 포함하는 다당류가 표준 시간 프레임으로 산화될 수 있는 것은 아니기 때문에 존재하는 다당류 때문일 수 있습니다. 따라서 산화 단계의 지속 시간을 10분에서 12분, 15분, 20분으로 늘렸습니다. 우리는 15분의 산화 단계가 PAS 염색에서 가장 효과적이라는 것을 발견했습니다.

    Masson' s 트리크롬 블루

    Masson의 트리크롬 블루 염색의 원리는 콜라겐과 근육을 염색하는 것이며, 이는 망막 슬라이드에서 부상으로 인한 섬유증을 나타낼 수 있는 콜라겐 조직의 증가를 나타내는 데 사용될 수 있습니다. 이 염색은 고정 기술에 민감하기 때문에 최적의 염색을 얻기 위해 변경이 필요했습니다. 이 염색의 과정은 처음에 산성 Biebrich scarlet-acid fuchsin red 염료를 사용하여 세포질과 근육 섬유를 빨간색으로 염색하는 것입니다. 포스포몰리브딕산/포스포텅스텐산과의 분화는 콜라겐 섬유의 적색 염료와 경쟁합니다. 공막에서 큰 포스포몰리브딕/포스포텅스텐 산 분자는 작은 분자에만 침투할 수 있는 조밀한 근육 섬유와 달리 느슨한 결합 조직을 관통할 수 있습니다. 그런 다음 아닐린 블루 염료를 적용하여 콜라겐 섬유의 산을 대체하여 파란색으로 염색된 공막을 생성합니다. 망막 단면에서 이러한 염색을 최적화하기 위해 Biebrich scarlet-acid fuchsin 염료로 염색하는 기간을 줄여 파란색 염료와 빨간색 염료 사이의 균형을 만들었습니다. 또한 Davidson의 고정제를 사용하면 콜라겐에서 적색 염료를 제거하기 위해 분화 시간이 연장되어야 했습니다. 5분, 6분, 8분, 10분에 차별화를 시험해 보았고, 6분에 최적의 결과가 나왔습니다. 분화는 또한 매끄러운 부분의 두께와 절단에 따라 다르며 6분 이상의 분화가 필요할 수 있습니다.

    Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) 항체

    Polyclonal, 숙주 종은 토끼, 분자량은 50kDa입니다. GFAP 항원은 세포질(성상세포와 Mü의 세포질; 망막의 ller 세포), 항원은 428 아미노산에서 만들어지며 분자량은 49512 Da.

    Neurofilament-200 항체

    Monoclonal, 숙주 종은 마우스, 클론 N52, 동형 IgG1, 분자량이 200kDa인 무거운 신경 필라멘트의 인산화 및 비인산화 형태를 인식합니다. 항체는 신경필라멘트의 꼬리 영역에 있는 항원결정기에 결합합니다. 항체는 신경 perikarya, 수상돌기 및 축삭의 신경 필라멘트를 염색합니다.

    Glutamine Synthetase (GS) 항체

    Monoclonal, 클론 GS-6, 숙주 종은 마우스이며 분자량은 45kDa이고 항체 동형은 IgG2a입니다. GS 항원은 세포 세포질(Mü의 세포질; 망막의 ller 세포)는 항원이 373개의 아미노산과 42,064 Da.

References

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