방법 논문

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

DOI:

10.3791/50425

⸱

2016년 11월 14일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 2Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

이 논문에서

요약

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여기에서는 포르말린 고정, 파라핀 포매 쥐 중추신경계(CNS) 및 말초 림프절(LN) 조직 절편에서 이중 면역 염색을 위한 최적화되고 상세한 프로토콜을 제시합니다.

초록

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면역 조직 화학 (IHC)이 높은 특정 안정적이고 매력적인 단백질의 시각화를 제공합니다. IHC 기반의 빛깔 표지의 정확한 성능과 해석은 중추 신경계 (CNS) 등의 지방 함량이 높은 조직에서 목적 단백질 사이의 상호 관계를 평가하기 위해 사용될 때 특히 도전적이다.

우리의 프로토콜은 특히 쥐 CNS와 신경 염증에 의해 영향을받는 주변 림프절 (LN) 모두 구조 및 가용성 단백질의 검출을 위해 조정 된 표준 immunolabeling 기술의 정교화를 나타냅니다. 그럼에도 불구하고, 추가 수정하거나하지 않고, 우리의 프로토콜 가능성도 여기에 제시된 것보다 다른 기관과 종, 기타 관련 단백질 표적의 탐지를 위해 사용될 수있다.

서론

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methylome, 사체 또는 프로테옴 수준에서 수행 분석 고급 높은 처리량의 사용에도 불구하고, 면역 염색은 조직 샘플, 세포 배양에 직접 단백질 검출 또는 세포 도말 검사의 황금 표준 남아있다. 지역화 / 배광 패턴을 계시하여 면역 조직 화학 (IHC)의 상대적인 비율과 목표 단백질의 지형적 상호 관계를 평가하고, 그들의 생물학적 활성을 나타낼 수있다. 따라서, IHC 널리 임상 연구 및 진단 목적, 예를 들면, 치료 평가 질병 메커니즘 동물 모델에서 기능적 표현형 변화 등의 연구에 활용

본질적 조직학, 병리학, 생화학 및 면역학을 포함 IHC 크게 형광 표지 된 항체는 감염된 조직 1 폐렴 구균 항원을 식별하기 위해 처음에 사용 된 1941 년 이후로 진행되었다. V휴대 제품과 IHC에 의해 구성 요소의 isualization은 특정 항원은 (Ag)에 대한 항체 (ABS)의 결합을 기반으로합니다. 형광 태그 된 항체를 사용하는 외에, 면역 반응은 2,3- 옥시다아제 또는 알칼리 포스 파타 아제와 같은 효소 (4)을 이용하여 가시화 될 수있다. 방사능 라벨자가 방사선 시각화하는 동안 또한, 콜로이드 금 항체 태그 (5)는 광학 및 전자 현미경 모두에 의해 특정 항원 항체 반응을 검출하기 위해 사용된다.

용 Ag-Ab의의 면역 직접 및 간접적 인 방법을 통해 검출 할 수있다. 직접적인 방법은 직접 차 애비 6 레이블 사용하기 때문에, 본질적으로 빠르고 간단합니다. 그러나, 감도 부족으로 심각한 간접 방법이 직접 사람에게 바람직하다. 두 단계 간접 검출 방법은 상기 제 7 층과 같은 기본 복근 향한 이차 복근 첫번째로, 표지되지 않은 기본 복근 및 표지 필요로한다.신호 증폭을 더 포함함으로써 달성 될 수 있으며, 효소 - 결합 급 순이 (세 단계 간접법) 보조 AB와 결합하는 것이다. 일반적으로 사용되는 간접 검출 방법은 아비딘 - 비오틴과 퍼 옥시 다제 - antiperoxidase (PAP)입니다. 대안 적으로, 알칼리성 포스파타제 antialkaline 포스파타제 (APAAP) 복합체 대신 PAP 방법을 사용할 수있다. 특히, 알칼리성 포스파타제 (AP) 방법은 immunoperoxidase 방법 4보다 더 민감한 것으로 나타납니다. 아비딘 - 비오틴 복합체 (ABC) 방법은 표지 아비딘 - 비오틴 복합체 (LAB) 중 하나와 함께 바이오틴 차 순이를 사용, 또는 스트렙 타비 딘 - 비오틴 복합체 (SLAB) 표지. 검출 감도는 상기 퍼 옥시다아제 또는 알칼리 포스 파타 아제 표지 아비딘 (8)를 포함함으로써 증가 될 수있다. 사용의 다른 검출 방법은 고분자 라벨, 타이 라민 증폭 및 면역 구름 원 9입니다. 특히, 다른 검출 방법은 동일한 조직에 다수의 Ag 검출을 위해 결합 될 수있다여기에 제시된 1978 4. 동시 이중 면역 염색에 처음보고 된 샘플은 각각, 퍼 옥시 다제 - 결합 및 AP 접합 이차 항체를 이용하여 포르말린 고정 된 파라핀 포매 쥐 CNS 및 LN 조직 절편에서 수행 하였다. 신호는 각각 (FB) APAAP 복잡한 3,3'- diaminobencidine (DAB) 색 원체 및 패스트 블루를 사용하여 시각화 하였다.

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프로토콜

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윤리 정책
본 연구는 실험 동물에 대한 스웨덴 국립 이사회와 유럽 공동체위원회 지침의 지침에 따라 수행되는 윤리적 허가에 따라 (6백9분의 86 / EEC)는 N338 / 09, N15 / 10 N65 / 10에 의해 승인 된 북한 스톡홀름 동물 윤리위원회.

1. 조직 준비

  1. 관류 및 고정
    1. 좌심실을 통하여 관류 transcardial 수행 이소 플루 란 동물을 마취. 0.1 M PBS (PFA)에 4 % 파라 포름 알데히드 다음 혈액 성분을 제거하기 위해 인산 완충 식염수 (PBS)와 혈관의 헹굼을 시작합니다.
    2. PFA에 침지하여 해부 뇌, 척수 및 말초 LN 조직을 흥분시키는. 4 ° C에서 24 시간 후, 추가 처리 할 때까지 4 ° C에서 PBS에 PFA에서 조직과 상점을 전송합니다. 또는 상업적 PBS에, 250 ml의의 S &에 9g의 NaCl을 용해# 246; rensen은 버퍼 750 ml의를 탈 이온수를 추가 (DH 2 O); 2.5 L의 DH 2 O.에서 HPO 2 PO 4 X 2H 2 O를 4 × 상반기 2 O 및 71.2 g 2 나 0.2 M 소렌슨 완충액 (pH 7.4) 용해 13.8 g의 NaH를 준비합니다
  2. 탈수 및 삽입
    1. 면도날을 사용하여 약 5 ㎜의 두께 부분으로 조직을 잘라.
    2. 크실렌 최종적 파라핀 (표 1) 다음에 조직 테크 VIP 진공 침투 프로세서 (에탄올의 농도 상승에 침수에 기초한 표준 절차를 사용하여 티슈 경화 처리 (탈수)을 시작합니다.
    3. 금형에 조직을 올려 놓고 "파라핀 블록"을 형성하기 위해 샘플 주위 유동 파라핀에 붓는다. 장기 보관은 실온 (RT)가 필요합니다. 그러나, 절편하기 전에, 하룻밤, 예를 들어, 4 ℃에서 (O / N) 블록을 냉각하기를 권장합니다.

2. 단면

  1. 칼에 걸쳐 앞뒤로 이동할 수 썰매 마이크로톰의 고정 홀더로 파라핀 블록을 배치합니다. 블록 및 마이크로톰 나이프 (즉, 칼의 형상에 따라, 또한 절단 속도 및 기법) 사이에 최적의 각도를 조정한다.
  2. 파라핀 블록에서 5 μm의 두께 단면 - 3 컷.
  3. 물 용기에 바로 절단 부분을 전송하고 유리 슬라이드에 물에서 연속적으로 마운트.
  4. 잔류 물과 잠재적 인 기포를 제거하기 위해 종이 타월에 대해 조심스럽게 장착 섹션을 누릅니다. 상업적으로 미리 접착 코팅 된 유리 슬라이드를 추천한다.
  5. 60 °의 C - 드라이 (50)에 난로에서 두 시간 동안 슬라이드를 장착.

3. 탈 파라핀 (재수 및 차단 내생 퍼 옥시 다제)

  1. 슬라이드는 자일 렌으로 2 배 빠져 (또는 자일 렌 대체XEM-200), 각 시간 15-20 '.
  2. 99 % 에탄올로 씻어.
  3. 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 차단하기 위해, 0.25 %의 과산화수소를 함유하는 메탄올 용액 30 '에 대한 섹션을 배양한다.
  4. 수분 함량 (99 %, 70 % 증가하고, 증류수에서 끝나는 에탄올을 사용하여 재수 화를 계속한다.
  5. 커버 장착 될 때까지이 시점에서 섹션을 촉촉하게 유지해야 할 전표.

4. 항원 검색

  1. 작업을 준비하는 단계; 60 '(이 경우에는 EDTA의 pH 8.5 완충액) 항원 검색 용액 슬라이드 비등하는 찜통을 사용 (EDTA 완충액 원액 DH 2 O 50 ㎖에 용해시킨 1.21 g 트리스 및 0.37 g의 EDTA를 포함 47.5 ml의 DH 2 O) 용액의 희석 2.5ml를의 EDTA 원액.
  2. 약에 대한 RT에 슬라이드를 냉각. 1 시간 후, 3 린스 - 트리스와 배는 생리 식염수 (TBS, 사용 대안 PBS)를 0.05 M 트리스 0.15 M의 NaCl로 구성된 완충; pH를 7.5으로 조정 위스콘신일 염산. 또는 상업적 TBS를 사용합니다.

5. 비특이적 결합 부위를 차단

  1. , 비특이적 백그라운드 반응을 피하기 10 % 소 태아 혈청 (FCS) 및 90 % DAKO 완충액을 함유하는 차단 용액에 '30 RT에서 섹션을 배양.

6. 두 번 Immunolabeling : 기본 애비와 동시 배양

  1. 차단 솔루션 차 항체의 필요한 양을 희석 및 O / n를 4 ° C에서 품어. (1 ED1 : 1000) α-Cd68 또는 α-Iba1 (Aif1, 1 : 1000) 또는 α-Cd8α (황소 8; 1 : 200); 이중 면역 염색에 대한 α-에오 탁신 (300 일 Ccl11)를 ​​결합 .
  2. 슬라이드는 TBS 완충액으로 3 ~ 5 배 린스 (또는 10 배 희석 DAKO 버퍼를 사용한다).
  3. 차단 솔루션과 RT에 1 시간을 품어 : 이차 항체의 필요량 (200 바이오틴 안티 염소와 AP-복합 항 - 마우스, 모두 1) 희석.
  4. (우리를 TBS 버퍼와 5 배 - 슬라이드 3을 씻어대안 예 10 배) DAKO 버퍼를 희석시켰다.
  5. RT에서 1 시간 동안 블로킹 용액으로 희석하고 아비딘 - 고추 냉이 퍼 옥시 다제 착체 (HRP)와 함께 인큐베이션 슬라이드.
  6. 슬라이드 3 린스 - TBS 버퍼 (또는 10 배 희석 DAKO 버퍼를 사용)으로 5 배.

7. 시각화

  1. 바운드 AP 표지 이차 항체의 시각화
    1. 1 L의 DH 2 O 12.1 g의 트리스 용해시켜 0.1 M 트리스 HCl 완충액을 준비하고 염산을 이용하여 pH를 조절한다. 레바 미솔 1 M 용액을 제조하기 위해 동일한 트리스 -HCl 버퍼를 사용한다. DH 2 O.에서 갓 4 %에 NaNO 2 용액을 제조
    2. (37 (하나의 표준 유리 큐벳에 필요한 볼륨) 빠른 블루 (FB) 기판 유리 튜브 312.5 μL의 DMF에 6.25 mg의 나프톨-AS-MX-인산을 용해 및 사전 예열 50 ㎖로 저어 50 ㎖를 얻으려면 ° C) 트리스 - 염산 완충액. 312.5 ㎕의 2 N 염산 12.5 mg의 FB RR 소금을 용해하는 것은 처리장 이전의 312.5 μl를 추가4 %에 NaNO 2 용액은 적색 및 예열 트리스 - 염산 완충액 동일한 50 ㎖로 혼합 교반한다. 노란 액체가 분명해질 때까지 가볍게 흔들어 마지막으로 이전에 제조 된 1 M의 levamisole 용액 77 μl를 추가합니다. 여액의 혼합물을 수득하고, 유리 큐벳에 넣고 슬라이드 위에 붓는다.
    3. 37 ° C에서 배양을 시작하고 약 광학 현미경 하에서 공정을 개발하고 제어 할 수 있습니다. 매 15-30 분. 퍼지 온 경우, 새로운 혼합물로 FB 솔루션을 교체합니다.
    4. PBS 버퍼에이어서 TBS 버퍼 및 전송에 5 배 - 슬라이드 3을 씻어.
  2. 결합 된 바이오틴 이차 항체의 시각화
    1. DAB는 / H 2 O 2 49 ml의 PBS 1 ml의 DAB 원액 (1 ml의 PBS 당 25 mg을 DAB)을 희석하여 솔루션을 개발 준비합니다. 쏟아져 이전 섹션에 16.5 μL의 H 2 O 2 및 여과 액을 추가합니다.
    2. 침전 이마에 발색의 DAB의 전환n 개의 안료는 즉시 할 수 있습니다. (높은 배경을 높이고 특정 신호를 마스크 수 초 이상 배양에도 몇) 광 현미경 개발 프로세스를 제어 할 수 있습니다.
    3. 갈색 안료 석출물의 강도는 대안 적으로 '5 2 % 황산구리 및 0.9 % 염화나트륨 용액으로 이루어진 배양을 향상시킬 수있다.
    4. 슬라이드 3 린스 - PBS로 5 배 그리고 마지막으로 DH 2 O와 함께, 또는 수돗물을 사용합니다.
    5. 커버 수성 GelTol 설치 매체를 사용하여 물에서 직접 전표와 슬라이드를 탑재합니다. 공기 방울을 생성하지 마십시오.
    6. 설치 매체의 완전한 건조, 예를 들어, O / N에서 4 ℃로 할 수 있습니다. 스토어 RT에 슬라이드를 건조.
1. % 에탄올 20 ' 40 ° C
2. % 에탄올 60# 39; 40 ° C
삼. % 에탄올 90 ' 40 ° C
4. % 에탄올 60 ' 40 ° C
5. % 에탄올 90 ' 40 ° C
6. % 에탄올 60 ' 40 ° C
7. % 에탄올 90 ' 40 ° C
8. % 에탄올 120 ' 40 ° C
9. 크 실롤 30 ' 40 ° C
10. 크 실롤 60 ' 40 ° C
11. 파라핀 60 ' 60 ° C
12. 파라핀 60 ' 60 ° C
1삼. 파라핀 60 ' 60 ° C
14. 파라핀 120 ' 60 ° C

조직 테크 VIP 진공 침투 프로세서에 의해 표 1. 조직 처리.

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결과

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더블 immunostainings (공동의 염색)는 포르말린 고정 파라핀 포함 된 쥐 CNS 및 LN 절에서 수행되었다. 3-5 μm의 두께 조직 슬라이스 사전 코팅 접착 유리 슬라이드에 연속적으로 설치 이전에 10,11,12 설명으로 처리, 썰매 마이크로톰을 사용하여 절단 하였다. 간단히 deparaffinizing, 조직 재수 내생 퍼 옥시 다제 불 활성화 한 후, 절편을 비특이적 결합 부위를 제거하는 단계를 차단 한 다음, 항원 검색 과정을 실시한다. 공동의 염색은 다음의 조합으로 수행되었다 : ⅰ) Ccl11 / 년 Iba-1, II) Ccl11 / ED1 및 ⅲ) Ccl11 / CD8. 각 공동 염색에 사용되는 주요 애비는 자신의 동시 배양을 사용할 수 두 개의 서로 다른 종 (각각 염소 및 마우스)에 제기되었다. 이바-1 ED1과 CD8은 청색 AP 신호 시각화 동안 Ccl11는 갈색 퍼 옥시 다제 반응 생성물에 의해 가시화 하였다.

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토론

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표준 IHC 절차는 종종 일반적으로 폭 넓은 경험뿐만 아니라 "시행 착오"접근 방식을 의미 최적의 결과를 얻기 위해 특정 조정을 필요로한다. 티슈 제조에서 대상 가시화 될 때까지 상기 프로토콜 거의 각 단계는 개별적으로 최종 결과를 개선하기 위해 수정 설계를 실시 할 수있다. 여기에 제시된 이중 염색 프로토콜은 특히 신경 염증에 영향을 포르말린 고정 파라핀 포매 쥐 CNS 및 LN 조직 섹션에서 우리 관심 대상 단백질 사이의 상호 관계를 평가하기위한 조정 대상 IHC 계 단백질을 예시한다. 이와 같이,이뿐만 아니라 고급 시험 영감의 근원으로, IHC의 방법을 배우기위한 가이드로서 사용될 수있다. 그러나, 유념해야 / 또는 여기에서 최적의 결과를 생성 할 수있다 표시 이외의 조직 및 다른 단백질을 대상으로 본 프로토콜의 단순한 재생.

Ccl11이 congenic 쥐 스트레인 (10)의 CNS에서 각각의 mRNA 수준의 상향 조절...

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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한스 라스만(Hans Lassmann)과 얀 바우어(Jan Bauer)의 지도와 지원에 감사드립니다. 또한 탁월한 기술 지원을 해준 Katalin Benedek과 비판적이고 언어적인 평가를 해준 Caroline Westerlund에게 감사드립니다.

이 연구는 Biogen Idec, Wenner-Gren Foundation, Swedish Research Council, Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, EU 6TH Framework EURATools(LSHG-CT-2005-019015) 및 Neuropromise(LSHM-CT-2005-018637)의 보조금으로 지원되었습니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약
Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O)Baxter1001936060눈 조사. 아마도 생식력에 영향을 미치고 자궁 내 아기를 손상시킬 수 있습니다. 적절한 장비를 갖춘 마취 환경에서만 투여하십시오.
염화나트륨(NaCl)Merck1.0604
인산염 완충액 식염수(PBS), 정제시그마-알드리치P4417
파라포름알데히드(OH(CH2O)nH(n = 8 - 100)), 1x PBSApl pharma34 24 28건강 위험에서 4%. 부식성의. 가끔씩. 급성 독성.
에탄올 ≥ 99.5%, 절대 (CH3CH2OH)Sigma-Aldrich459844-1LFlamable.
크실렌(크실렌, 조직학적 등급; C6H4(CH3)2 시그마-알드리치534056Flamable. 급성 독성.
Histo-Comp 파라핀 왁스Tissue-TekV0-5-1001
접착 현미경 슬라이드StarfrostMIC-1040-W
Xylol 대체품 XEM-200 Vogel GmbHND-HS-200호흡기 감작. 발암 성.
α-CD8 (Ox-8) 마우스 anti-rat, 1차 항체AbD SerotecMCA48G
α-Iba1 (AIF1) 마우스 anti-rat, 1차 항체MilliporeMABN92
α-CD68 (ED1) 마우스 anti-rat, 1차 항체AbD SerotecMCA341R
α-eotaxin C-19 (CCL11) 염소 anti-rat, 1차 항체Santa Cruz BTSC-6181
알칼리성 포스파타제(AP)-접합 2차 항체Dakopatts, 덴마크D0314
비오틴화 2차 항체Amersham BiotechRPN1025
Avidin-horseradish peroxidase complex (HRP) Sigma-AldrichA3151
Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P)시그마-알드리치N4875-1G급성 독성.
패스트 블루 RR 솔트, 아조익 디아조 No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)Sigma-AldrichFBS25
레바미솔 염산염(C11H13ClN2S)Sigma-Aldrich31742급성 독성.
3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB 크로모겐)DAKOS3000고인화성. 유독.
황산구리(CuSO4)Merck1.02791급성 독성. 환경 위험.
GelTol 수성 장착 매체Thermo Electron Corporation230100
과산화수소, 30%(H2O2)Merck107210급성 독성.
메탄올 (CH3OH)Fluka65543급성 독성. 호흡기 감작. 발암 성. 가연성.
트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄, 트리스 베이스(C4H11NO3 )AppliChemA1379피부 및 눈 자극.
Tris Buffered Saline (TBS), 정제Sigma-AldrichT5030
Di- 인산수소나트륨 이수화물(Na2HPO4 x 2H2O)Merck1.0658
인산이수소나트륨(NaH2PO4 x 1H2O) Merck1.06346
태아 종아리 세럼 (FCS) Cambrex BioScienceDE-14-802F
DAKO cytomation 세척 버퍼 10x DAKOS30062-8°C에서 보관해야 합니다; C는 박테리아 성장을 억제합니다. 거품을 피하십시오.
N, N-디메틸포름아미드; DMF (C3H7NO)Fluka40250가연성. 급성 독성.
유리 커버슬립 24 x 36 mm Menzel-Glä serBB024036A1
염산, conc. (HCl)Sigma-Aldrich30721부식성, 자극성, 투과제. 폐 감작제(산성 미스트). 유독.
염산 용액 부피, 2 M HCl (2 N)Fluka71826부식성, 자극성, 투과제. 폐 감작제(산성 미스트). 유독.
나트륨 아질산염, ReagentPlus, ≥ 99.0 % (NaNO 2 < / sub>)시그마 - 알드리치S2252산화제. 유독. 환경에 위험합니다.
에틸렌디니트릴로테트라아세트산이나트륨염 이수화물(EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)Merck1.08454경구 노출은 생식 및 발달 효과를 유발할 수 있습니다.
Equipment
Tissue-TekV.I.P 진공 침투 프로세서Sakura5902 VIP Jr. 115V, 60Hz
Hacker-Bright 8000 시리즈 기본 썰매 Microtome 해커 기기
가정용 식품 기선 BraunMultiGourmet FS 20
광학 현미경 Leica Polyvar 2

참고문헌

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