만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.
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이 논문에서
요약
초록
심장 개발을 운전 사건을 조사하고, 인간의 심근 질환에 이르는 분자 메커니즘을 결정하기 위해 기능적 인간의 심근 (CMS)를 생성하는 첫 번째 필수입니다. 약물 발견 및 독성학 연구에서 이러한 세포의 사용은 또한 인간의 기원 세포 사전 임상 적 유효성을 검사 할 심장 질환의 치료를위한 새로운 약물 분자를 허용, 매우 도움이 될 것입니다. CMS를 수있는 소스, 유도 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포들이 쉽게 접근 환자의 조직에서 직접 파생 될 수있는, 가장 유망한 사이이며, 본체 (1)의 모든 세포 유형을 야기 할 수있는 고유의 능력을 가지고있다. 여러 가지 방법이 화학적으로 정의 된 프로토콜 2,3에 고전 배아 체에서 (사채) 집계 방식에 이르기까지, CM을에 IPS 세포 차별화를 위해 제안되었다. 이 문서에서 우리는 사채 기반 프로토콜을 제안하고 보여주는 방법이 METHOD를 효율적으로 장치가없는 IPS 세포의 기능 CM과 같은 세포를 생성하기 위해 사용 할 수 있습니다.
서론
역사적으로, 인간 발달과 질병을 운전 유전 및 분자 메커니즘 연구는 유전자 변형 동물 모델의 생성에 기초하고있다. 그러나 수많은 인간의 표현형이 성공적으로 주로하기 때문에 두 종족 사이에 존재하는 생물학적 차이, 생쥐 복제에 실패합니다. 반면에, 인간의 조직에 대한 액세스를 제한 할 수 있으며, 자주 자료가 심도있는 실험 연구를 취득 할 수 없습니다. 심장 혈관 생물학 분야는 이러한 제한을 모두 앓고 : 인간의 마음의 생리는 마우스의 그것과 크게 다르고, 심장 조직의 상당한 수량은 사후 또는 심장 수술 동안 액세스 할 수 있습니다. 기능 인간의 CMS 분화 최적의 소스를 찾기 때문에 심장 혈관 생물학의 중심 화제가되고 있으며, 많은 노력이 문제를 해결하기 위해 만들어졌다. 다양한 세포 유형은 내가 제안되었다ncluding 골격 근모, 지역 심장 줄기 세포, 골수 단핵 세포, 내피 전구 세포와 중간 엽 줄기 세포. 그러나 데이터는 4 일치되지 않은 이러한 세포를 사용하여 얻었다.
인간 배아 줄기 세포 (ESC)의 유도는 처음 5 야마나카와 톰슨 6,7에 의해 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포의 획기적인 발견은 나중에 솔루션을 제공 할 듯 : 이러한 세포주기 위하여....
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프로토콜
1. 인간의 IPS 세포 라인 피더 무료 유지 보수 및과 Passaging
- 마트 리젤 코팅 접시를 준비합니다. 해동 한 한 시간 얼음에 인간의 ESC 자격을 갖춘 매트릭스의 유리 병 25 ML DMEM-F12 배지에 희석. 얼음에 모든 것을 유지하고 모든 접시와 튜브 사전 냉각되도록 각 35mm 플레이트 (또는 다른 접시를 사용할 경우 면적 당 상응하는 금액)에 1 ML을 추가합니다. 알루미늄 호일로 접시를 커버.
참고 : Matrigel의 재고 농도 배치에 따라 다릅니다. 희석 지침은 데이터 시트에 표시됩니다.
- 밤새 얼음 접시를 유지하고 다음날 얼음 제거합니다. 플레이트는 사용하기 전에 1 주일 냉장고에 보관하실 수 있습니다.
- mTESR1 완전 배지 (또는 Nutristem 매체의 병을 해동) 아래 표에 따라 H-ESM을 (인간의 ESC 매체)를 준비.
H- ESM 최종 CONC 50....
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결과
우리의 연구에서 우리는 몇 가지 만능 줄기 세포 라인에서 CM을 생성. 이 라인은 처음 MEF 피더 레이어에서 생성되었지만 바로 정의 매체 (mTESR1 또는 Nutristem 중 하나)을 사용하여 리겔에 배치했다. 다양한 분석은 형태 학적 특성, 만능 세포의 일반적인 마커의 발현 (10 월 4 SSEA4 및 TRA1-60)과 유전체의 안정성 (그림 1)의 유지를 확인하는 데 사용되었다.
심장 계통에 유도는 사채 및 혈청 AA (그림 2A와 2B)의 특정 유형의 면전에서 문화로 유도 만능 줄기 세포의 응집에 의해 실행되었다. 계약 영역 (그림 2C와 영화 1) 사용되는 세포주에 따라 총 20~35%을 나타낸다. 계약 소화 효소 (동영상 2)에 의해이 지역에서 분리 된 CMS는 일반적으로 심근 구조 단백질 (심장 트로포 닌 & ALPH 표현, - sa.......
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토론
pluripotent 줄기 세포 라인 사이에 낮은 효율과 높은 변동성이기는하지만, CM을에 자발적으로 분화 할 수있는 잠재력이있다. 새로운 유도 방법의 개발은 따라서 프로세스의 효율성을 개선하고 더 많은 정의 된 프로토콜을 향해 이동에 초점을 맞추고있다. 그러나, 이러한 새로운 차별화 방법의 대부분은 정교한 배양 조건, 타이밍 및 시약의 농도의 미세 조정, 고가의 사이토 카인과 성장 인자 치료를 필요로하는, 매우 복잡하다. 또한, 다양한 만능 줄기 세포 라인의 내인성 사이토 카인 신호 레벨의 차이가 어렵 종종 각각의 세포 라인에 대한 적절한 수준으로 조정해야합니다 사이토 카인의 농도를 표준화 렌더링합니다.
얻어진 IPS-파생 CMS를 성숙은 질병 모델링 및 약물 발견 응용 프로그램의 IPS 세포의 심장 차별화를 시도 할 때 고려해야 할 중요한 측면을 나타냅니다. differentiat인간 줄이고 ESCs 및 IPS 세포의 이온은 일반적으로 완전히 성숙 구조없이 태아의 .......
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공개 사항
공개 할 재정적 이해하지 않습니다.
감사의 글
BS는 밀라노 비 코카 여름 학생 연구 교육 프로그램의 대학에 의해 지원되었다; 연구는 건강와 이탈리아 교육부의 대학 및 GC에 대한 연구 폰다 치오 Humanitas의 이탈리아 정부의 자금 지원, 우리는 비판적를 읽는 마이클 VG Latronico 감사 원고.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Media and Reagents | |||
| Human ESC 인증 Matrix | BD Biosciences | 354277 | 5ml 병을 4°C에서 해동; 얼음 위에 C O/N, 데이터 시트 희석 지침에 따라 얼음 위의 미리 냉각된 극저온 튜브에 부분 표본을 넣고 -20°C에 보관하십시오. 씨 . |
| 피브로넥틴, 인간 혈장에서, 0.1% 용액 | 시그마 | F0896-2MG | 작업 농도: 5 μ g/cm2 |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | 작업 농도: 5 & g/cm2 |
| PBS(Mg 및 Ca 없음), 10X | Lonza | BE17-515F | |
| PBS(mg 및 Ca 포함), 10X | Bio Sera | XC-S2067/500 | |
| Dispase II, 중성 프로테아제, 등급 II | Roche | 4942078001 | 재고: -20°C에서 DMEM-F12에서 10mg/ml; C, 작업 용액 : PBS (Mg / Ca 없음) |
| 트립신 / EDTA, 0.5 % | 시그마 | T3924 | |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| 녹아웃 DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| 함께 PBS에서 480 U / ml (><예 : < / em> 1.6 mg / ml)로 희석 | |||
| 교체 (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | 4 °에서 해동; C, 부분 표본 및 -20 °에 저장; C |
| F– tal Bovine Serum (원산지 남미) | Invitrogen | 10270-106 | 배치는 심인성 가능성을 테스트해야 합니다. 4 °에서 해동; C, 56 °에서 열 비활성화; C 30분 동안 분취 및 -20°C에서 보관; C |
| PenStrep, 페니실린-스트렙토마이신, 100X | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMAX, 100X | Life Technologies | 35050-038 | |
| MEM NEAA, 100X | Invitrogen | 11140-135 | |
| N2 보충제, 100X | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 보충제, 50X | Life Technologies | 12587-010 | |
| 2-메르캡트– 돼지 | Invitrogen | 31350-010 | |
| 젤라틴 | 물에 있는 1%에 주식을 만들고, -20°C에 저장하십시오. PBS에서 0.1%에 묽게 하고 4°C에 유지하십시오; C | ||
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | Supplement 5X를 염기성 배지와 결합하고 분취 및 -20°C에서 보관합니다. 완전한 매체를 4°C로 유지하지 마십시오. C 1 주 이상 |
| 영양 줄기 hESC XF | Stemgent Biological Industries | 05-100-1A | 4 °에서 해동; C O/N, 부분 표본 및 -20 °에 저장; C를 사용할 때까지. 부분 표본은 4 °로 유지 될 수 있습니다. C는 일주일 이상 지속되지 않습니다. |
| mFreSR | Stem Cell Technologies | 5853 | |
| 아스코르브산 | Sigma | A4544-25G | 물에 10mg/ml로 재고를 준비합니다. 부분 표본을 -20 °에 저장하십시오. 어둠 속에서 C. 최종 농도(500X) |
| Plasticware | |||
| 35 mm 배양 접시 | Becton Dickinson | 353001 | |
| Cell scraper | Corning Incorporated | 3008 | |
| 12웰 플레이트 | Becton Dickinson | 353043 | |
| Permanox 2웰 챔버 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | 177437 | |
| 유리 2웰 챔버 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | 177380 | |
| 6웰 플레이트, 초저 부착 표면 | Corning Incorporated | 3471 | |
| 18G 니들 | Becton Dickinson | 304622 | |
| 유리 파스퇴르 피펫, 230mm | VWR International | 612-1702 | |
| 2.5ml 주사기 | Becton Dickinson | 300188 | |
| Equipments | |||
| IVF 워크스테이션 | KSystem, by Nikon | ||
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon |
참고문헌
- Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function. Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. N....
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재인쇄 및 허가
