우리는 벌레에 amylopathies의 양상을 연구하는 방법을 설명 C. 엘레. 우리는 인간의 Aβ 표현 벌레를 구성하는 방법을 보여줍니다 42 뉴런에서 어떻게 행동 분석에서의 기능을 테스트합니다. 우리는 더 이상 약물 테스트에 사용할 수있는 기본의 연결을 문화를 획득하는 방법을 보여줍니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
Amylopathy 시간과 조직에서 아밀로이드 베타의 비정상적인 합성과 축적을 (Aβ)에 대해 설명하는 용어입니다. Aβ는 알츠하이머 병 (AD)의 특징과 Lewy 바디 치매, 봉입체 근염의 대뇌 아밀로이드 angiopathy 1-4에서 찾을 수 있습니다. Amylopathies 점차적으로 시간 개발할 수 있습니다. 이러한 이유로 짧은 수명과 간단한 유기체는이 조건의 분자 측면을 명료하게하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기, 우리는 웜 Caenorhabditis의 elegans의를 사용하여 Aβ 매개 신경 변성을 연구하는 실험 프로토콜을 설명합니다. 따라서, 우리는 어른 자웅 동체의 세포 융합 생식선에 DNA 인코딩 인간의 Aβ에게 42 주입하여 유전자 변형 벌레를 구축합니다. 형질 전환 라인은 돌연변이에 의한 통합에 의해 안정화된다. 선충이 알을 수집 및 시드에 의해 동기화 시대입니다. Aβ 42을 표현 뉴런의 기능은 (좋은 기회 행동 분석에서 테스트 화성 분석들). 배아에서 얻은 기본의 연결을 문화는 행동 데이터를 보완하고 항 세포 사멸 화합물의 신경 효과를 테스트하는 데 사용됩니다.
서론
아밀로이드 베타 (Aβ) β 및 γ의 secretases 1에 의한 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 연속 절단 한 후 형성되는 36-43 아미노산 펩티드이다. γ의 secretase에는 Aβ 펩타이드의 C-말단을 처리하고 그 변수 길이 5에 대한 책임이 있습니다. Aβ의 가장 일반적인 형태는 Aβ 40 Aβ 42, 더 일반적으로 같은 AD 5와 같은 병적 상태에 관련되는 후자입니다. 높은 농도의 Aβ 양식 β-시트에있는 아밀로이드 원 섬유는 6을 형성 집계. 섬유 보증금 신경을 둘러싸고있는 치매 plaques의 주요 구성 요소입니다. 플라크와 확산 성, 비 플라크 Aβ 올리고머, 모두 Aβ의 기본 병원성 양식을 구성하는 것으로 생각되고 있습니다.
신경 amylopathies의 실험실 연구는 시간이이 조건이 진행 사실에 의해 복잡합니다. 따라서 importan입니다마우스 - 짧은 수명에 모델을 보완하는 유전자 다루기 쉬운 동물을 개발하는 t. 이러한 모델은 amylopathies - 일반적으로 세포 및 분자 및 그 단순 덕택으로, 문제의 본질을 포착하는 데 도움의 특정 측면을 명료하게 할 수 있습니다. ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 형질 전환 웜 건설
- 변환.
- 사출 패드를 준비합니다. 유리 coverslip에 위에 물에 용해 뜨거운, 2 % 아가로 오스의 드롭 놓습니다. 신속하게 드롭 번째 coverslip을 배치하고 가볍게 누릅니다. 아가로 오스가 떨어져 슬라이드의 coverslips에게 응고, 그리고 80 진공 오븐에서 coverslip에 패드 ° CO / N. 구워 후
- 피펫을 잡아 당깁니다. 우리는 1/0.5 mm 필라멘트와 OD / ID 붕 규산염 모세 혈관을 당겨 셔터 P-97 풀러를 사용합니다. 피펫은 나중 단계에서 열려 깨진 닫힘 끝으로 위조된다.
- 사출 믹스를 준비합니다. μL / 150 NG의 최종 농도에 관심 DNA (구조 20 NG / μL)와 빈 플라스미드 DNA를 포함하는 주입 혼합물을 확인합니다. 모든 오염 물질을 제거하는 사출 혼합물을 원심 분리기. 오염 물질 변환 효율을 줄일 수 있기 때문에이 단계는 중요합니다. B에 신선한 튜브에 상위 5 μL를 (이물질 및 기타 오염 물질이 바닥에 수집) 전송전자 주입에 사용됩니다.
- 모세관 현상에 의해 주입 혼합을로드합니다. 피펫의 바닥은 사출 믹스에 몰두하고 있습니다. 일반적으로 0.5 μL 100 벌레를 주입하기에 충분합니다.
- 주입 피펫을로드....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
우리의 프로토콜로 우리는 신경 기능 8 인간의 Aβ 42 올리고머의 효과를 연구한다. 조각 인코딩 인간의 Aβ 42 화재 벡터 pPD50.52의 인공 신호 펩타이드 코딩 순서는 끝 스몰 1 제한 효소 사이트를 소개 프라이머를 사용하여 구조 PCL12 9에서 증폭되었다. 조각은 그 독특한 스몰 1 사이트 10 ~ pPD95.75 화재 벡터의 2,481-BP FLP-6 프로모터 서열을 포함하는 구조에 삽입되었다. 프로토콜 1에 설명 된 변환 기술을 사용하여 우리는 ASE 뉴런 (FDX (ses25) 변형) 8 Aβ 42을 표현하는 유전자 변형 벌레를 구축. 긍정적 인 형질을 표시하기 위해 우리는 특히 ASE 오른쪽 (ASER) 신경 세포의 11 GFP 발현을 구동 P GCY-5 :: GFP 기자를 사용했습니다. 건조한 아가가.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에서 우리는 C를 사용하여 amylopathies의 세포 및 분자 측면을 연구하기 위해, 결합 방법을 설명 엘레 간스. 이 방법의 장점은 다음과 같습니다. 1) 저렴한 비용으로 C.elegans는 상온에서, 박테리아 파종 일반 페트리 접시에 유지됩니다. 2) 강력한 유전학. 형질 전환 동물은 몇 개월 만에 얻은 프로모터 서열의 다양한 특정 뉴런에서 원하는 유전자의 발현을 유도 할 수있다 할 수 있습니다. 3) 단순, 잘 특성화, 신경계. C. 엘레은 매우 간단 신경계 (302 뉴런)를 보유하고있다. 이 단순 세포 혈통, 각 신경 세포의 특정 기능 / 역할과 시냅스 연결을 포함하여 벌레의 신경계의 광범위한 특성을 여유했다. C.의 한계 엘레은 면역 표준 생화학 기술의 응용 프로그램과 노를 격리한다 두꺼운 피부 (표피)을 방해하는 세포의 작은 크기를 포함RONS은 외부 환경을 형성한다. 따라서 약물 접근법 C로 제한.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
우리는 원고의 중요한 읽기 박사 슈앙 리우 감사합니다. PCL12 구조는 선물 폼 박사 크리스토퍼 D. 연결했다. 이 작품은 두 개의 국립 과학 재단 보조금 (0842708 및 1026958)와 FS에 AHA 부여 (09GRNT2250529)에 의해 지원되었다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1입니다. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological Agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | 975 ml | ||
| 고압멸균으로 살균한 다음 다음 항목을 추가하고 잘 섞습니다. | |||
| 황산 | 마그네슘Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml 1 M 주식 |
| 염화칼슘 | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml 1 M |
| 주식 콜레스테롤 | Sigma-Aldrich | C3045 | 5 mg/ml 주식 1 ml(에탄올) |
| 인산칼륨 완충액 | 1M 주식 25 ml | ||
| 2. 인산칼륨 완충액 | |||
| 인산칼륨 일염기 | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| 인산칼륨 이염기성 | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| 증류수 | 1 L | ||
| 고압멸균으로 살균 | |||
| 3. M9 완충액 < / 강> | |||
| 인산 칼륨 일 염기성 | 시그마 -알드리치 | P5655 | 3g |
| 인산 나트륨 이염기 | 성 시그마 -알드리치 | S5136 | 6g |
| 염화나트륨 | 시그마 알드리치 | S5886 | 5g |
| 황산 마그네슘 | 그마-알드리치 | M2643 | 1M 스톡 1ml |
| 증류수 | 1L로 가져 오기 | ||
| 고압멸 | |||
| 4. 난자 완충액(pH 7.3, 340mOsm) | |||
| 염화나트륨 | Sigma-Aldrich | S5886 | 118mM |
| 염화칼 | Sigma-Aldrich | P5405 | 48mM |
| 염화칼슘 | Sigma-Aldrich | C5670 | 2mM |
| 염화마그네슘 | Sigma-Aldrich | M4880 | 2mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25mM |
| 증류수를 | 1 L | ||
| 오토클레이브로 살균됨 | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 배양 배지 | Gibco | 11415 | 450 ml |
| 소 태아 혈청 | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| 페니실린 | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| 스트렙토마이신 | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| 자당으로 340 mOsm으로 조정한 다음 멸균 필터를 오토클레이브 병에 넣고 4°C에서 보관합니다. C | |||
| 6입니다. 기타 시약 | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μ m Acrodisc 주사기 필터 | PALL Co. | 4199 | |
| 키티나제 | 시그마-알드리치 | C6137-5UN | |
| 렉틴(땅콩) | 시그마-알드리치 | L0881-10MG | |
| 수산화나트륨 | 피셔 사이언티픽 | S320 | |
| 라이신 | 시그마-알드리치 | L5501 | |
| 비오틴 | 시그마-알드리치 | B4639 | |
| 차아염소산나트륨 용액 | 시그마-알드리치 | 425044 | |
| 아지드화나트륨 | 시그마-알드리치 | 71289 | |
| 자당 | 그마-알드리치 | S0389 | |
참고문헌
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer's di....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
