방법 논문

Caenorhabditis의 엘레 모델 시스템

DOI:

10.3791/50435

⸱

2013년 5월 17일

 , 
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Robert Wood Johnson Medical School, University of Medicine and Dentistry of New Jersey

이 논문에서

요약

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우리는 벌레에 amylopathies의 양상을 연구하는 방법을 설명 C. 엘레. 우리는 인간의 Aβ 표현 벌레를 구성하는 방법을 보여줍니다 42 뉴런에서 어떻게 행동 분석에서의 기능을 테스트합니다. 우리는 더 이상 약물 테스트에 사용할 수있는 기본의 연결을 문화를 획득하는 방법을 보여줍니다.

초록

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Amylopathy 시간과 조직에서 아밀로이드 베타의 비정상적인 합성과 축적을 (Aβ)에 대해 설명하는 용어입니다. Aβ는 알츠하이머 병 (AD)의 특징과 Lewy 바디 치매, 봉입체 근염의 대뇌 아밀로이드 angiopathy 1-4에서 찾을 수 있습니다. Amylopathies 점차적으로 시간 개발할 수 있습니다. 이러한 이유로 짧은 수명과 간단한 유기체는이 조건의 분자 측면을 명료하게하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기, 우리는 웜 Caenorhabditis의 elegans의를 사용하여 Aβ 매개 신경 변성을 연구하는 실험 프로토콜을 설명합니다. 따라서, 우리는 어른 자웅 동체의 세포 융합 생식선에 DNA 인코딩 인간의 Aβ에게 42 주입하여 유전자 변형 벌레를 구축합니다. 형질 전환 라인은 돌연변이에 의한 통합에 의해 안정화된다. 선충이 알을 수집 및 시드에 의해 동기화 시대입니다. Aβ 42을 표현 뉴런의 기능은 (좋은 기회 행동 분석에서 테스트 화성 분석들). 배아에서 얻은 기본의 연결을 문화는 행동 데이터를 보완하고 항 세포 사멸 화합물의 신경 효과를 테스트하는 데 사용됩니다.

서론

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아밀로이드 베타 (Aβ) β 및 γ의 secretases 1에 의한 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 연속 절단 한 후 형성되는 36-43 아미노산 펩티드이다. γ의 secretase에는 Aβ 펩타이드의 C-말단을 처리하고 그 변수 길이 5에 대한 책임이 있습니다. Aβ의 가장 일반적인 형태는 Aβ 40 Aβ 42, 더 일반적으로 같은 AD 5와 같은 병적 상태에 관련되는 후자입니다. 높은 농도의 Aβ 양식 β-시트에있는 아밀로이드 원 섬유는 6을 형성 집계. 섬유 보증금 신경을 둘러싸고있는 치매 plaques의 주요 구성 요소입니다. 플라크와 확산 성, 비 플라크 Aβ 올리고머, 모두 Aβ의 기본 병원성 양식을 구성하는 것으로 생각되고 있습니다.

신경 amylopathies의 실험실 연구는 시간이이 조건이 진행 사실에 의해 복잡합니다. 따라서 importan입니다마우스 - 짧은 수명에 모델을 보완하는 유전자 다루기 쉬운 동물을 개발하는 t. 이러한 모델은 amylopathies - 일반적으로 세포 및 분자 및 그 단순 덕택으로, 문제의 본질을 포착하는 데 도움의 특정 측면을 명료하게 할 수 있습니다. 웜 Caenorhabditis의 엘레 가을이 범주입니다. 그것은 짧은 수명을 가지고 ~ 20의 일 유전자 발현, 단백질 밀매, 신경 연결, 시냅스, 세포 신호, 죽음의 규제 등뿐만 아니라 기본적인 세포 과정에서 포유류 7과 비슷합니다. 웜의 독특한 특징은 강력한 유전 독립적으로 혈관 손상 신경 손상을 연구 할 수있는 혈관 시스템의 부족이 (가) 있습니다. 반면에, 뇌의 부족 C.의 사용을 제한 신경 변성의 여러 측면을 연구하는 엘레 간스. 또한, 병변의 해부학 적 분포의 재생 및 식별이 유기체에서 수행 할 수 없습니다. 다른 제한관리 포인트는 유전자 발현 프로파일과 복잡한 행동과 메모리 기능의 장애 모두에서 차이를 평가하는 어려움이 있습니다. 여기에서 우리는 C를 생성하는 방법을 설명 amylopathies의 elegans의 모델.

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프로토콜

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1. 형질 전환 웜 건설

  1. 변환.
    1. 사출 패드를 준비합니다. 유리 coverslip에 위에 물에 용해 뜨거운, 2 % 아가로 오스의 드롭 놓습니다. 신속하게 드롭 번째 coverslip을 배치하고 가볍게 누릅니다. 아가로 오스가 떨어져 슬라이드의 coverslips에게 응고, 그리고 80 진공 오븐에서 coverslip에 패드 ° CO / N. 구워 후
    2. 피펫을 잡아 당깁니다. 우리는 1/0.5 mm 필라멘트와 OD / ID 붕 규산염 모세 혈관을 당겨 셔터 P-97 풀러를 사용합니다. 피펫은 나중 단계에서 열려 깨진 닫힘 끝으로 위조된다.
    3. 사출 믹스를 준비합니다. μL / 150 NG의 최종 농도에 관심 DNA (구조 20 NG / μL)와 빈 플라스미드 DNA를 포함하는 주입 혼합물을 확인합니다. 모든 오염 물질을 제거하는 사출 혼합물을 원심 분리기. 오염 물질 변환 효율을 줄일 수 있기 때문에이 단계는 중요합니다. B에 신선한 튜브에 상위 5 μL를 (이물질 및 기타 오염 물질이 바닥에 수집) 전송전자 주입에 사용됩니다.
    4. 모세관 현상에 의해 주입 혼합을로드합니다. 피펫의 바닥은 사출 믹스에 몰두하고 있습니다. 일반적으로 0.5 μL 100 벌레를 주입하기에 충분합니다.
    5. 주입 피펫을로드합니다. micromanipulator에의 홀더에 피펫을 삽입하고 아가로 오스 패드에 파편에 유리 슬라이드 또는 양자 택일로 장착 된 커버 슬립의 가장자리에 그 끝을 문질러서이 열려 휴식. 이 너무 큰 팁을 손상 웜으로 중요한 단계입니다 너무 작은 팁은 쉽게 막혀 있습니다. 깨진 팁의 질은 유량에 의해 가장 중요한 형상에 의해 판단 할 수 있습니다. 유량은 분사 압력의 질문에 답변 할로 카본 700 기름 한 방울에 몰두 열린 끝에서 흐르는 거품의 크기에 의해 평가 될 수있다.
    6. 사출 패드에 웜을 전송합니다. 주입 패드 700 할로 카본 오일 한 방울을 배치하고 기름 (초보자를위한 1 또는 2) 여러 벌레를 전송할 수 있습니다. 때까지 패드에 벌레를 밀어 선택 웜을 사용y는 아가을 준수합니다. 웜은 같은 방향으로 향하게하는 복부 측면과 행 지향적이어야한다. 웜의 머리를 만지지 마십시오. 벌레가 패드에 준수하지 않는 여러 시도 후 경우, 신선한 패드로 교체하거나 아가로 오스의 두께 및 / 또는 농도를 증가시킨다.
    7. 웜에 피펫을 삽입합니다. 스테이지를 이동하여, 피펫에서 벌레를 배치합니다. 의 세포질 많은 생식 세포 핵에 의해 공유되기 때문에 생식선의 중앙 코어 피펫을 놓습니다. 이것은 많은 자손을 주입 DNA를 제공 할 가능성이 높아집니다. 피펫 웜 (~ 15 ° -25 ° 각도)에 거의 평행하게 놓여 있어야합니다. 피부가 침체 될 때까지 수직으로 웜의 몸 아래로 피펫의 팁을 누르십시오. 그런 다음 부드럽게 끝의 삽입을 유도하는 조작에 누릅니다. 최상의 결과를 모두 생식선을 주입.
    8. DNA 용액을 주입. 생식선 부풀 때까지 피펫에 압력을 적용합니다. 흐름을 중지하고 피펫 떨어져 벌레를 잡아 당깁니다. 이동 한 후 흐름 바늘을 테스트하고다음 웜과 반복 주입 단계.
    9. 벌레를 복구 : 웜에 대한 복구 버퍼의 드롭 (~ 10 μL)을 추가하고 벌레가 수영을 시작할 때까지 배양한다. 솔루션은 대부분 M9 때까지 벌레가 수영을 다시 시작하고 여러 번 반복 될 때까지 M9의 동일한 볼륨을 추가 기다립니다. 개별 시드 플레이트에 벌레를 전송할 수 있습니다.
  2. 통합.
    1. 신선한 플레이트로 40 건강하고 먹이, L4 벌레를 배치
    2. 40 분 동안 4,000 라드와 γ-선 조사. 신선한, OP50 시드 플레이트 (4 웜 / 플레이트)에 조사 웜 (P0)를 전송합니다. 웜 또는 300 J / 평방 미터 UV를의 선량을 조사 할 수 있습니다.
    3. 개인 접시에 각 플레이트 10-20 F1 형질 전환을 전송, 해당 P0 원점 번호판을 레이블을 지정합니다.
    4. 별도의 플레이트에 각 F1 2-4 F2 형질 중 하나. 변환 마커의 100 % 전송을위한 F3 자손을 확인합니다. 일반적으로, 조사 웜 줘야에서 자손의 1-3%난 통합 이벤트가 있습니다.
    5. 세 개 이상의 독립적 인 형질 전환 라인의 주식을합니다.

2. 행동 분석 실험

  1. 나이 동기화.
    1. 표준 10cm NGM 플레이트 + OP50 E.에있는 벌레를 성장 임신하는 성인의 많은 인구까지 대장균 (3-5 일)에 도달합니다.
    2. 1 ML M9 버퍼에서 그들을 정지 50 ML 팔콘 튜브에 벌레를 수집합니다.
    3. 3 분 450 XG에서 5 ML M9 버퍼와 원심 분리기를 추가합니다. 상층 액을 버린다. 3 배 반복합니다.
    4. 마지막으로 원심 분리의 끝에서, 상층 액을 제거하고 침전 웜 기본 차아 염소산 용액 (0.5 M NaOH를 갓 혼합 1 % 차아 염소산)의 10 볼륨을 추가합니다. ~ 10 분 동안 RT에서 품어. 용해 반응은 coverslip에의 용해 반응의 저하를 배치하고 현미경으로 벌레를 검사하여 모니터링 할 수 있습니다. 벌레의 약 80 %가 파손되면 반응을 중지해야합니다.
    5. 추가 기능에 의해 용해 반응을 정지살균 계란 버퍼의 G는 같은 볼륨.
    6. 5 분 450 XG에서 원심 분리하여 계란 (그리고 시체)를 수집합니다.
    7. 살균 계란 버퍼 2 배와 계란을 씻으십시오.
    8. M9 버퍼와 씨앗들을 표준 NGM 플레이트에있는 계란 O / N를 품어.
  2. 화성 분석.
    1. 한천 약 0.5x0.5x0.5 cm의 여러 조각을 준비합니다. 우리는 10 cm 플레이트 한천을 입금하고 우리는 거기에서 한천 덩어리를 잘라.
    2. 2 시간에 원하는 유인을 (포화에 가까운 포화 농도)를 포함하는 용액에 한천 덩어리를 적시십시오. 일반적인 유인 라이신 (0.5 M), 비오틴 (0.2 M)입니다.
    3. 시험 장소의 위치와 제어 지점 (그림 1A)로 표시되어있는 10 센티미터 테스트 플레이트 한천 덩어리를 입금. 평형 및 그라데이션 O / N (그림 1B)의 형성을 허용합니다. 한 실험 5 접시를 준비합니다.
    4. 이전 실험은 20 mM의 NaN의 3 (네스트의 10 μl를 추가각 장소에) hetic.
    5. 접시의 중앙에 20 나이 동기화 벌레를 놓습니다. 20 ℃에서 인큐베이터에있는 접시를 놓습니다
    6. 1 시간 후, 테스트 / 제어 장소에서 동물을 계산하고 다음과 같이 화성 지수 (CI)를 계산 : figure-protocol-1 N, N 테스트 및 N Cnt 필드는., 동물의 총 수, 시험 현장에서 동물의 수와 제어 지점에있는 동물의 수를 표시 함.

3. 기본 배아 세포 배양

  1. 나이 동기화에 설명 된대로 벌레를 용해.
  2. 5 분 450 XG에서 살균 계란 버퍼와 원심 분리기의 동일한 볼륨을 추가하여 용해 반응을 중지합니다. 부드럽게 펠렛 계란을 잃게하지 않도록주의하면서 상층 액을 버린다. 2 배 반복하거나 뜨는 선명해질 때까지.
  3. 펠렛 달걀 (그리고 시체를 Resuspend) 2 ㎖ 멸균 계란 버퍼와 계란 버퍼에 멸균 60 %의 자당 2 ML를 추가합니다. 계란이 완전히 손으로 또는 텍싱하여 (그들은 원심 분리에 따라 덩어리를 형성하는 경향) 현탁 될 때까지이 솔루션을 섞는다.
  4. 15 분 450 XG에 원심 분리기.
  5. 조심스럽게 멸균 튜브에 뜨는를 (계란 포함) 전송합니다. 시체와 용해의 제품으로 다른 포함 된 펠렛을 폐기하십시오.
  6. 계란 버퍼에 계란을 현탁 5 분 XG 450 원심 분리하여 잔류 자당을 제거합니다. 부드럽게 수집하고 상층 액을 버린다. 배 반복합니다.
  7. 층류 후드 아래에 달걀 껍질을 소화하기 위해 RT에서 1 U / ㎖ 키티 나제를 포함하는 살균 계란 버퍼에 펠렛 계란을 resuspend을. 30 분 반응 (거꾸로 세포 배양 현미경)를 모니터링하기 시작하면. 키티 나제의 각 배치는 약간 다른 활동이있다. 일반적으로 소화는 1 시간에 완료됩니다.
  8. 약 70-80%의 달걀 껍질은 키티 나제 CM-15 추가 (L-15 세포 배양 의대에 의해 소화 될 때IUM은 10 % 태아 소 혈청, 50 U / ML 페니실린, 50 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신)를 포함. 27 게이지 주사기를 사용하여 세포를 떼어 놓다. 그대로 배아를 제거하는 필터 5.0 μm의, 세포와 유생의 대단히 짧은 시간에 세포 현탁액을 필터링합니다.
  9. 펠릿은 450 원심 분리하여 해리 된 세포 현탁액은 15 분 동안 XG. 상층 액을 제거하고 CM-15 세포 배양 배지에서 펠렛을 resuspend을.
  10. . 유리 커버 플레이트에 해리 세포는 이전에 물 주에 용해 땅콩 렉틴 (0.1 밀리그램 / ML)로 코팅 미끄러 져 : 세포가 분화하기 위해 기판을 준수해야합니다.
  11. 세포는 2 주 이상 공기 RT (16-20 ° C)로 유지 될 수 있습니다.

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결과

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우리의 프로토콜로 우리는 신경 기능 8 인간의 Aβ 42 올리고머의 효과를 연구한다. 조각 인코딩 인간의 Aβ 42 화재 벡터 pPD50.52의 인공 신호 펩타이드 코딩 순서는 끝 스몰 1 제한 효소 사이트를 소개 프라이머를 사용하여 구조 PCL12 9에서 증폭되었다. 조각은 그 독특한 스몰 1 사이트 10 ~ pPD95.75 화재 벡터의 2,481-BP FLP-6 프로모터 서열을 포함하는 구조에 삽입되었다. 프로토콜 1에 설명 된 변환 기술을 사용하여 우리는 ASE 뉴런 (FDX (ses25) 변형) 8 Aβ 42을 표현하는 유전자 변형 벌레를 구축. 긍정적 인 형질을 표시하기 위해 우리는 특히 ASE 오른쪽 (ASER) 신경 세포의 11 GFP 발현을 구동 P GCY-5 :: GFP 기자를 사용했습니다. 건조한 아가가...

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토론

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여기에서 우리는 C를 사용하여 amylopathies의 세포 및 분자 측면을 연구하기 위해, 결합 방법을 설명 엘레 간스. 이 방법의 장점은 다음과 같습니다. 1) 저렴한 비용으로 C.elegans는 상온에서, 박테리아 파종 일반 페트리 접시에 유지됩니다. 2) 강력한 유전학. 형질 전환 동물은 몇 개월 만에 얻은 프로모터 서열의 다양한 특정 뉴런에서 원하는 유전자의 발현을 유도 할 수있다 할 수 있습니다. 3) 단순, 잘 특성화, 신경계. C. 엘레은 매우 간단 신경계 (302 뉴런)를 보유하고있다. 이 단순 세포 혈통, 각 신경 세포의 특정 기능 / 역할과 시냅스 연결을 포함하여 벌레의 신경계의 광범위한 특성을 여유했다. C.의 한계 엘레은 면역 표준 생화학 기술의 응용 프로그램과 노를 격리한다 두꺼운 피부 (표피)을 방해하는 세포의 작은 크기를 포함RONS은 외부 환경을 형성한다. 따라서 약물 접근법 C로 제한...

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공개 사항

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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우리는 원고의 중요한 읽기 박사 슈앙 리우 감사합니다. PCL12 구조는 선물 폼 박사 크리스토퍼 D. 연결했다. 이 작품은 두 개의 국립 과학 재단 보조금 (0842708 및 1026958)와 FS에 AHA 부여 (09GRNT2250529)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1입니다. NGM
Sodium ChlorideSigma-AldrichS58863 g
Bacteriological AgarAMRESCOJ63717 g
Bacto-peptoneAMRESCOJ6362.5 g
Distilled Water975 ml
고압멸균으로 살균한 다음 다음 항목을 추가하고 잘 섞습니다.
황산마그네슘Sigma-AldrichM26431 ml 1 M 주식
염화칼슘Sigma-AldrichC56701 ml 1 M
주식 콜레스테롤Sigma-AldrichC30455 mg/ml 주식 1 ml(에탄올)
인산칼륨 완충액1M 주식 25 ml
2. 인산칼륨 완충액
인산칼륨 일염기Sigma-AldrichP5655108.3 g
인산칼륨 이염기성Sigma-AldrichP378635.6 g
증류수1 L
고압멸균으로 살균
3. M9 완충액 < / 강>
인산 칼륨 일 염기성시그마 -알드리치P56553g
인산 나트륨 이염기성 시그마 -알드리치S51366g
염화나트륨시그마 알드리치S58865g
황산 마그네슘그마-알드리치M26431M 스톡 1ml
증류수1L로 가져 오기
고압멸
4. 난자 완충액(pH 7.3, 340mOsm)
염화나트륨Sigma-AldrichS5886118mM
염화칼Sigma-AldrichP540548mM
염화칼슘Sigma-AldrichC56702mM
염화마그네슘Sigma-AldrichM48802mM
HEPESFisher ScientificBP31025mM
증류수를1 L
오토클레이브로 살균됨
5. CM-15
L-15 배양 배지Gibco11415450 ml
소 태아 혈청Gibco10437-02850 ml
페니실린Gibco1514050 units/ml
스트렙토마이신Gibco1514050 g/ml
자당으로 340 mOsm으로 조정한 다음 멸균 필터를 오토클레이브 병에 넣고 4°C에서 보관합니다. C
6입니다. 기타 시약
Halocarbon 700 oilHalocarbon Products9002-83-9
5 μ m Acrodisc 주사기 필터PALL Co.4199
키티나제시그마-알드리치C6137-5UN
렉틴(땅콩)시그마-알드리치L0881-10MG
수산화나트륨피셔 사이언티픽S320
라이신시그마-알드리치L5501
비오틴시그마-알드리치B4639
차아염소산나트륨 용액시그마-알드리치425044
아지드화나트륨시그마-알드리치71289
자당그마-알드리치S0389
로 가져오세요성 됨 시균으로 살균됨륨 로 가져옵니다 시

참고문헌

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