적외선 신경 자극은 청각 시스템과 관련된 포함 신경 유형의 범위 내에서 전기 자극에 대한 대안으로 제시되었다. 이 프로토콜은 기본 청각 신경의 문화 적외선 신경 자극의 메커니즘을 연구 패치 클램프 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
그것은 펄스, 적외선 레이저 빛이 표적 조직의 추가 수정에 관계없이, 신경 조직에 전기 반응을 유도하는 데 사용할 수 있습니다 최근 몇 년 동안 입증되었습니다. 적외선 신경 자극은 청각 신경의 신경 자극에 표시된 특정 관심, 생체 내 말초 감각 신경 조직의 다양한보고되었다. INS는 이러한 설정에서 작업 표시하고있는 동안 그러나, 적외선 빛은 신경 자극의 원인이되는 메커니즘 (또는 메커니즘)은 현재 잘 이해되지 않습니다. 여기에 제시 프로토콜은 배양 기본 청각 신경에있는 적외선 신경 자극의 조사를 용이하게하기 위해 설계된 전체 세포 패치 클램프 방법을 설명합니다. 철저하게 통제 된 조건 하에서 체외에서 적외선 레이저 조명에 이들 세포의 반응을 특성화함으로써, 기본적인 physica에의 향상된 이해를 얻을 수있을 수 있습니다L, 생화학 적 과정은 적외선 신경 자극을 기본.
서론
신경 생리학 및 의학 생체 공학의 분야는 신경 조직에 전기 반응의 제어 자극 할 수 있도록 기술에 크게 의존하고 있습니다. 전기 자극은 신경 자극의 황금 표준 남아있는 동안 신경 반응 및 조직 1 주변에 현재의 확산으로 인해 자극 특이성의 부족을 녹음 할 때, 그것은 이러한 자극 유물의 존재와 같은 단점의 숫자에서 겪고있다.
지난 수십 년간 광학 매개 자극 기술 2의 개발을 보았다. 이러한 기술 중 일부는 특정 분자의 추가 (예 갇힌 분자) 3 연구 설정 밖에서 쉽게 적용 할 수있다 어느 것도 유전자 조작의 일부 형태 (예를 들어 optogenetics 4)를 통해, 표적 조직의 수정이 필요합니다. 특히 관심을 따라서 적외선 신경 자극 (INS), whereb는Y 신경 조직은 펄스 적외선 레이저 빛에 의해 흥분됩니다. INS는 신경 조직 2의 매우 구체적인, 비 접촉 자극을 가능하게하여 전기 자극의 많은 단점을 극복 할 수있는 잠재력이있다. INS가 성공적으로 생체 내에서 다양한 설정에서 설명하고있는 동안 그러나, 여기의 정확한 메커니즘은 불확실 남아있다.
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프로토콜
1. 나선 신경절 신경 세포의 배양
- 오토 클레이브의 작은 원형 (예를 들어 10mm 직경) 유리 coverslips는과 곡선 집게를 소독. 소독 집게를 사용하여 멸균 4-링 35mm 페트리 접시 또는 4 - 웰 플레이트의 각 우물에 살균 coverslips를 전송합니다. 최대 48 시간에 대한 배양기에서 coverslip을과 장소의 표면 (37 ° C)에 폴리-L-오르니 틴 (500 ㎍ / ㎖) 및 마우스 라미닌 (0.01 밀리그램 / ML) 150 μl를 적용합니다. coverslips를이 우물의 바닥에서 멀리 떠하지 않도록 확인하십시오.
- 47.5 ML neurobasal, 0.5 ML N 2 보충, 1 ML B27 보충제, 0.5 ML의 L-글루타민, 0.5 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신 : 각 신경의 문화에 대한 50 ML 멸균 Neurobasal 미디어 (NBM)를 준비합니다. 참고 : 보조 식품을 냉동 할 수 -20 ° C에 저장하고 필요한 날에 미디어에 추가됩니다.
- 이전에 20,21 설명 된대로 출생 후 하루 4-7 쥐 새끼에서 나선 신경절 신경 세포를 떼어 놓다, 우리효소 (0.025 % 트립신 0.001 % DNase의 I) 및 기계 기술을 모두 ING. Whit....
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결과
나선 신경절 신경 세포는 전압 클램프 전류 클램프 녹음 구성 모두에서 반복 파형과 레이저 조명에 응답합니다. 그림 3A는 2.5 밀리, 0.8 mJ의 레이저 펄스 (6 일부터 평균 응답에 대한 응답으로 세포막을 통해 현재의 흐름의 전형적인 변화를 보여줍니다 -70 MV, -60 MV -50 MV에서 개최 막 잠재력을 가진 1 초 간격)으로 반복 레이저 펄스. NET 안쪽으로 전류가 지속적으로 조명 중지 한 후 초기 값으로 반환 레이저 펄스에 대한 응답으로 유발된다. 레이저 유도 전류의 모양은 INS를 기본 프로세스의 완전한 이해를 얻기 위해 개최 가능성의 범위에서 실험을 수행하는 것이 중요 할 수 있음을 나타내는 막 잠재력이 변경 될 때 다양하게 볼 수 있습니다. 이러한 실험은 현재 프로토콜의 사소한 수정을 실시하고 충전 전압과 전통 기술 (QV) 분석을 사용하여 분석 할 수 있습니다 (SE체외에서 INS에서 얻은 QV 곡선의 예)에 대한 전자 참고 7.
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토론
이 문서에 설명 된 프로토콜을 사용하면 추출 문화 나선 신경절 신경 세포 및 전체 세포 패치 클램프 실험을 수행하여 레이저 유발 전기적 활동을 조사 할 수 있습니다. 체외에서 사용할 경우, 패치 클램프 기술은 생체 내에서 달성 할 수없는 실험 매개 변수의 제어 수준을 제공합니다. 같은 파장, 펄스 에너지, 펄스 길이, 펄스 모양과 펄스 반복 시퀀스로 레이저 자극 매개 변수는 재생 환경에서 공부하실 수 있습니다. 또한, 신경이 유지되는 환경 (예 : 용액의 온도, 화학 요소)은 가능한 막 특성을 연구하고, 따라서 적외선 신경 자극을 기본 메커니즘을 만드는 체계적으로 변화 될 수있다. 전기 및 광 자극 양식 사이의 상호 작용은 제어 된 방식으로 조사 할 수 있습니다. 이러한 기초 연구는 층을 도입하여 더욱 고급 수 있습니다uorescent 프로브는 이온 농도 또는 열 충격 단백질의 발현과 같은 추가 매개 변수를 모니터링 할 수 있습니다. 이러한 다양한 매개 변수의 명확한 이해는 현상.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 작품은 연계 프로젝트 부여 LP120100264 아래의 호주 연구위원회에 의해 지원되었다.
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재료
Table 4. 레이저 장비.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포 배양 재료 및 장비 | |||
| 유리 커버슬립 | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-링 세포 배양 접시 | VWR International | 82050-542 | |
| 폴리-L-오르니틴 용액 | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 곡선 겸자 | WPI | 14101 | Dumont #5 핀셋(45°C; 각도 팁) |
| CO2 인큐베이터 | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| 표 1. 세포 배양 재료 및 장비. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 무혈청 보충제 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-글루타민 | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | 시그마-알드리치 | A2383 | |
| MgATP | 시그마-알드리치 | A9187 | |
| NaGTP | 시그마-알드리치 | G8877 | |
| 수산화칼 | LabServ | BSPPL738.500 | |
| 자당 | 시그마-알드리치 | S8501 | |
| <강> 세포 외 용액 < / 강> | |||
| 염화나트륨 | 시그마 - 알드리치 | 310166 | |
| 염화 칼륨 | 시그마 - 알드리치 | P4504 | |
| HEPES | 시그마 - 알드리치 | H4034 | |
| 염화칼슘 | 시그마 알드리치 | 383147 | |
| 염화 마그네슘 | 시그마 - 알드리치 | M8266 | |
| D- 글루코스 | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 수산화나트륨 | LabServ | BSPSL740.500 | |
| 자당 | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| 표 2. 세포 배양 및 패치 클램프를 위한 솔루션. a) Neurobasal media. b) 세포 내 용액. c) 세포외 용액. | |||
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참고문헌
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003(2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical rad....
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