에서 프로스타글란딘 추출 및 분석 Caenorhabditis의 엘레

프로스타글란딘은 (PG는) 광범위하게 조사하고 생물 ^12-14의 넓은 배열에 재생, 면역력, 개발을 규제에 연루되어 지질 호르몬의 중요한 클래스이다. 그들은 공통의 전구체 (들)에서 파생 된 지질의 시리즈를 포함하기 때문에 PG는 이상적으로 포괄적 인 시스템 생물학 분석에 적합합니다. 선충 C. 엘레 간스 유전학 및 시스템 생물학의 근본적인 문제를 해결하기 위해 가장 널리 사용되는 모델 생물 중 하나입니다.

우리는 증명 한 C. 엘레은 F-시리즈 PG는을 합성하는 난자 ^3,6,16에 운동성 정자 가이드. 각각 셋, 넷, 다섯 이중 결합, F1을 포함, F2, F3 및 클래스, 20 개의 탄소 된 PUFA에서 파생 된 F-시리즈 PG는이 ^3,16가 확인되었습니다. 이러한 PG는이 cyclooxygenase 효소의 독립적 인 합성, 아직 PGF _1α와 PGF _2α 입체는 여전히 GE있다있다nerated. C.의 정성 및 정량 분석을위한 엘레 PG는이 LC-MS/MS는 강력하고 중요한 분석 기술입니다. 이 분석을 수행하기 전에, 그것은 분석 프로세스의 성능이 크게 추출물의 품질에 의존하기 때문에 최적화 된 추출 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석법은 비 (M / Z)를 충전 할 것으로 예상 질량뿐만 아니라, PG 부모 이온의 바람직한 피크 모양과 체류 시간을 제공 할 수 있습니다. C.에있는 PG는 대사 프로파일 엘레 다양한 MS의 인수 전략을 필요로하는 어려운 작업입니다.

LC-MS 전체 검사 또는 조사 검사 (Q1 검사)는 대부분의 이온화 PG는이 질량 분석 응답을 생성 보장하는 장점이 있습니다. 설문 조사 검사는 야생형과 돌연변이 C.에 대해 PG는 총 프로파일에 대한 유용한 정보를 제공하는 반면 elegans의 사소한 PG는 검출 낮은 민감도로 인해 손상된다. 그러할이하, LC-MS 설문 조사 검색은 PG는의 글로벌 뷰를 제공하고 대형 PG 인구의 신진 대사에 영향을 미칠 것으로 예상 돌연변이 분석에 특히 유용 할 수 있습니다.

대사 산물 식별을 화학적으로 합성 된 PG 표준의 LC-MS/MS 분석은 첫 번째 참조 화합물로 그들의 제품 이온 스펙트럼을 얻기 위해 수행됩니다. 이 스펙트럼은 알 수없는 대사의 스펙트럼을 비교할 수 있습니다. 다중 반응 모니터링 (MRM) 모드는 향상된 민감도와 특이도 사용됩니다. MRM 실험은 화합물의 부모 이온 / 제품 이온 질량 전환을 지정하여 수행됩니다. 대상 분석 물질의 질량과 구조를 알면, 많은 알 수없는 대사에 대한 이론적 인 MRM 전환을 예상 할 수 있습니다.

C.의 이성체 PG는 프로파일에 최적화 된 LC-MS/MS 방법 엘레은보고되지 않았습니다. 여기에서 우리는 LC-MS와 구성된 추출 및 통합 질량 분석 방법을 설명 LC를검출, 정량화, 그리고 C. 조사를위한 MS / MS 방법 엘레 PG 대사. 이 방법은 다른 에이코 사 노이드에 적용 할 수 있습니다.

웜 문화, 프로스타글란딘 추출하고, 프로스타글란딘 분석 : 아래에 설명 된 프로토콜은 세 부분으로 나누어 져 있습니다. 언급 한 바와 같이 샘플이 일시적으로 -80 ° C 또는 -20 ° C.에 저장 될 수있는 경우, 여러 지점이있다

1. 웜 문화

우리는 포괄적 인 LC-MS/MS위한 혼합 단계 웜의 약 6g을 추천합니다. 이 검출 적어도 6 별도의 주사에 대한 충분한 자료를 제공해야한다. 단일 주입 또는 두 가지의 MRM으로 알려져 PG는 정량을 위해 1-2 G의 충분하다. 특정 단계로 구성 동기화 문화 추출물의 분석도 가능합니다. 최대 4 개의 균주를 동시에 재배 할 수 있습니다. 예를 들어, 야생형 제어 및 세 가지 돌연변이 균주.

1. 보충 수유 65 (16cm) X-대형 NGM 플레이트 및 농축 박테리아를 준비합니다. 시드 NA22 박테리아를 사용합니다. 보충 수유, 촉진제에 대한 집중 박테리아를 만들려면16-24 시간 동안 LB 배지에서 NA22의 w는 적어도 사리터. 스핀 다운, M9 버퍼 100 ㎖에 상층 액과를 Resuspend 박테리아를 제거합니다. 이 농축 된 박테리아 용액 200-400 ㎖의 각 웜 변형이 필요할 수 있습니다. 4 ° C.에 저장
2. 5 X-대형 플레이트에 웜 문화를 시작합니다. 플레이트가 임신하는 성인의 전체가 될 때까지 약 3에서 4 세대에 벌레를 성장. 농축 된 박테리아는 기아를 방지하기 위해 접시를 추가, 필요에 따라 (~ 1 ML / 플레이트와는 뚜껑을 교체하기 전에 완전히 건조 보자).해야한다
3. M9 버퍼와 함께 접시 떨어져 임신하는 자웅 동체를 세척하고 50 ML 원뿔 폴리 프로필렌 튜브 벌레를 수집합니다.
4. 임신하는 자웅 동체가 바닥 (보통 3-5 분에 대한)에 정착하도록 허용합니다. 세균, 계란 및 애벌레 단계 웜을 포함한 상층 액을 제거한다. 15 ML M9 버퍼에 resuspend을 부드럽게 섞는다.
5. 60 시드 NGM 플레이트의 각 웜 현탁액 200 μl를 전송합니다. 접시에 걸쳐 벌레를 분산. 웜 솔루션을 혼합 보관모두 잘 플레이트 때까지 벌레의 대략 동일한 번호를받을 수 있도록하기 위해 씨앗을 품고있다.
6. 기아를 방지하기 위해 필요한 (~ 1 ml/plate/12에 24 시간주기)로 농축 된 박테리아 보충합니다. 플레이트 뚜껑을 교체하기 전에 건조 공기 수 있습니다. 접시 임신하는 성인들로 가득 시드 벌레의 원래 숫자에 따라 2-4 세대를 위해 벌레를 성장, 또는 때까지.
7. 수확 웜 플레이트 한 번에 하나의 변형. M9 버퍼와 함께 접시 떨어져 벌레를 세척하고 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브 (예 : 6 관)에서 수집합니다. 접시를 씻어 M9 버퍼를 사용, 그 다음 판에 벌레 채워진 버퍼를 전송합니다. 번호판의 번호 (예. 10 ^일) 세척 한 후, 50 ML 튜브에 웜 채워진 버퍼를 전송합니다. M9 버퍼와 정상에 튜브를 채 웁니다. 판의 나머지 부분에 대한 세척을 반복합니다.
8. 임신하는 성인 5 ~ 6 분의 바닥에 정착, 상층 액을 (~ 35 ML)를 제거하고 하나 또는 두 개의 튜브에 통합 할 수 있습니다. FR와 50ml로 튜브를 기입ESH M9 버퍼는 3-5 분간 방치시키고, 상층 액을 떠나 임신하는 성인을 제거합니다. 3 회 반복하거나 상층 액이 투명해질 때까지.
9. 대구경 파스퇴르 피펫, 두 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브에 가능한 한 많은 웜과 같은 전송을 사용. 임상 원심 분리기에서 10 분 동안 1,000 RCF (CentraSL2에서 ~ 3,500 RPM)에서 스핀 다운. 상층 액을 제거하고 모든 벌레가 동일한 튜브에 옮겨 침전 될 때까지 반복합니다. -80 가능한 매장 웜과 같은 많은 상층 액으로 분리 ° C. 모든 균주에 대해이 단계를 반복합니다.

2. 프로스타글란딘 추출

추출에 필요한 시약은 다음과 같습니다. 방법은 Golovko와 머피 ^17의에서 수정 및 LC-MS/MS 감도를 향상 액체 - 액체 정화, 재생, 다음에 아세톤 추출이 포함되어 있습니다. 유사한 결과가 다운스의 균질화를 얻을 수 있지만 총알 블렌더 5 균질이 절차에 사용됩니다. 부틸 hydroxytolueNE (BHT)과 질소 하에서 증발 (N ₂₎ 가스는 산화를 방지하는 데 사용됩니다. 모든 유리는 지질 바인딩을 줄이기 위해 (Sigmacote) 실리콘 처리해야합니다. 유기 용매로 추출 화학 후드에서 수행되어야한다.

1. 50 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브의 무게. 6.5 ML 마크 근처 뜨거운 면도날로 튜브를 통해 절단하여 -80 ° C에서 보관 15 ML 원뿔 튜브에서 냉동 벌레 약 6.0 g을 전송합니다. 메탄올 청소 주걱은 튜브의 바닥에서 얼어 붙은 벌레 펠렛을 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 펠렛의 상단에서 하단, 적은 밀도 애벌레 웜 및 잔여 박테리아를 검색 할 수 펠릿을 절단하여 뒤에 남아 있습니다.
2. 미리 무게 50 ML 원뿔 튜브에 얼어 붙은 벌레를 전송합니다. 복수의 샘플을 처리하는 경우, 비교 연구 조직의 동일한 금액 (6.0 g)를 사용합니다. 붙여 넣기 벌레 해동으로, 원하는 질량을 얻기 위해 주걱 벌레를 추가하거나 제거합니다. 선택 사항 : 광고추출 효율에 대한 내부 통제 등의 PGF _2α-D4 규격의 D 1.00 NG.
3. 웜 서스펜션 0.005 %의 BHT와 얼음처럼 차가운 2시 1분 아세톤 / 식염수 12 mL를 추가로 소용돌이 잘 섞는다. 총알 블렌더에 사용 열두 5 ML 자립 플라스틱 튜브에 각각 웜 슬러리의 1.5 ML을 분배.
4. 0.5 mm의 0.7-0.8 ML을 추가 지름 세리아는 각각 5 ML 튜브에 산화 지르코늄 구슬을 안정화. 단단히 뚜껑을 닫고 총알 블렌더 5 균질로 12 튜브를로드합니다. 속도 8-9에서 3 분 동안 블렌더를 실행하고 얼음에 튜브를 놓습니다. 아주 단단히 뚜껑을 닫고하거나 내용이 쏟아 질 수 있는지 확인하십시오. 입체경을 사용하여 슬라이드에 하나의 튜브에서 균질의 10 μl를 확인합니다. 나머지 거의 그대로 웜이 있어야합니다. 필요한 경우, 다른 분 같은 속도로 반복합니다.
5. 균등 9 "파스퇴르 피펫을 사용하여 네 개의 10 ML 원뿔 유리 튜브에 균질을 전송합니다. 전송 ​​구슬을 피하십시오. 세 개의 튜브 seque에서 구슬을 씻으십시오ntially 1시 2분 아세톤 / 생리 식염수가 들어 BHT 1 ㎖​​와 함께. 모든 구슬이 세척 될 때까지 다른 튜브에 대해 반복합니다. 10 mL 유리 튜브에 남아있는 용액 (1 ~ 4 mL를) 전송하고 얼음에 배치합니다.
6. 4에서 10 mL 유리 튜브를 원심 분리기 ° C에서 10 분 동안 ~ 1,000 XG에서 임상 원심 분리기합니다. 각 튜브에서 깨끗한 10 ㎖ 유리 원뿔 튜브에 뜨는을 전송합니다.
7. 화학 후드에서 각 10 mL 유리 튜브에 헥산의 동일한 볼륨을 추가합니다. 예를 들어, 3.5 ML의 아세톤 / 생리 식염수에 3.5 ML의 헥산을 추가합니다. 30 초 동안 최대 속도로 소용돌이.
8. 4에서 10 mL 유리 튜브를 원심 분리기 ° C에서 10 분 동안 ~ 1,000 XG에서 임상 원심 분리기합니다. 헥산을 포함하는 상층과 중성 청구 지질을 폐기하십시오.
9. 2 M 개미의 산성을 (- 150 μL 약 100)을 사용하여 pH를 3.5로 낮은 위상을 산성화. 산도 스트립을 사용하여 테스트 산도.
10. 각 튜브에 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가합니다. 30 초 동안 최대 속도로 소용돌이와 4시에 튜브를 원심 분리기 ° C I10 분 ~ 1,000 XG에서 NA 임상 원심 분리기.
11. 제거하고 상단 수성 단계를 폐기하십시오. 계면을 피하고, 낮은 클로로포름 단계로 남아있는 우유 계면을 통해 피펫 팁을 삽입합니다. 깨끗한 15 ML 원뿔 유리 튜브 4 관에서 각각 하위 단계를 수집합니다. 적어도 24 시간 동안 -20 ° C에서 알을 품다. 이 시점에서, 추출물은 최대 2 주 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
12. 냉장고의 추출물을 가지고있는 경우, 남은 우유 수성 꼭대기 층을 버린다. 새로운 파스퇴르 피펫을 사용하여 테플론 일렬로 표시 ½-드람 유리 병에 클로로포름을 전송합니다. 화학 후드, N ₂ 가스의 완만 한 흐름에 따라 건조에 클로로포름 분획을 증발시킬 것. 건조 추출물은 최고 2 주까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. PG 추출 및 분석에 사용되는 전체 구조는 그림 1에 표시됩니다.

3. 프로스타글란딘 분석

1. 재고를 준비작업 솔루션을 얻기 위해 물 (8시 2분 V / V) : 같은 PGF _2α 나 PGF ₂ 메탄올에 _α-D4 (1 ㎍ / ㎖)로, 메탄올로 희석 개별 기준 프로스타글란딘의 솔루션을 제공합니다. 표준 곡선을 생성하기 위해 희석의 시리즈 (100, 10, 1, 0.1, 0.01 NG / ML)를 준비합니다.
2. 건조 C.에 물 (8시 2분 V / V) : 200 μL 메탄올 추가 엘레 지질 추출물 (들)과 잘 혼합. 물 해결책 : 웜 조직의 6 이하 g을 추출하는 경우, 건조 된 추출물은 메탄올의 적은 양에 재현 탁되어야한다.
3. 물에 0.1 % 포름산으로 구성된 이동 준비 단계 [A]와 0.1 % 포름산을 함유 아세토 니트릴 [B].
4. 4 ° C에서 자동 시료 주입기를 설정하고 70 카운트 1.5 ML 유리 병 랙에 샘플 튜브를 놓습니다.
5. 약 5 분 동안 0.2 ML / 분의 유속으로 0.1 % 포름산 시너지 수력 RP-C18 컬럼을 평형.
6. 열에 샘플 (20-50 μL)를 주입한다. 그라데이션 용출 시작을 수행ING 10 % B로하고 0-11 분 11-14 분 80~100%의 B에서 80 % B까지가는 ​​16 분에 10 % B로 반환. 총 실행 시간은 20 분입니다. 13 본격적인 표준의 유지 시간은 참고 ³ 표 1에 나타내었다.
7. 음이온 모드에서 ESI 인터페이스 운영 체제를 사용하여 질량 분석기로 유출 열을 소개합니다. 질소 분무기와 커튼 가스 (CUR = 10)로 사용됩니다. 충돌 가스, 충돌 에너지, 온도는 각각 10, -35 eV의 600 ° C로 설정됩니다. Declustering 전위 (DP), 충돌 에너지 (CE), 및 세포 출구 전위 (CXP)는 각각 -90, -35 및 -10에서 설정됩니다.
8. 설문 조사 검사 (Q1 스캔)의 경우, 대부분의 PG는 (그림 2)을위한 M / Z 315-360의 질량 범위에서 부정적인 이온 모드를 사용합니다. 범위는 그 화합물 (들)의 질량에 따라 변경 될 수 있습니다. LC-MS 이온 크로마토 그램의 총 이온 전류 (TIC)에서 이온을 추출하고 결정 extrac 여부테드 이온은 탈수 소화 또는 부가 물 이온에 해당하는, 또는 조각 이온.
9. MRM 실험, 대량 전환은 M / Z 311분의 355은 F1 클래스를 감지하는 데 사용됩니다, M / Z 193분의 353은 F2 클래스에 사용되며, M / Z 193분의 351 또는 191분의 351은 F3 클래스 사용 (그림 3). MRM은 내부 표준 (예를 들어, M / Z 197분의 357 PGF _2α-D4)를 감지하고 표준 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. PG 질량 전환 ^18에 대한 추가 정보는 머피 등을. 참조하십시오.
10. MS / MS 실험, F1 클래스, M / Z 353for F2 클래스 및 M / Z 351for F3 클래스 PG는을위한 M / Z 355을 사용합니다. C.는 F-시리즈 PG는 대한 elegans의 MS / MS 데이터는 그림 4와 표 2 ^3,16의 요금으로 이용 가능합니다. 포유류 에이코 사 노이드에 대한 MS / MS 데이터에서 사용할 수 있습니다 www.lipidmaps.org .
11. 분석가를 사용하여 분석 데이터를 처리t 소프트웨어 (버전 1.4.2 적용되는 생물계).

샘플 준비는 Golovko와 머피 17 일부터 적용 액체 - 액체 추출에 의해 실시되었다. 그것은 내부 표준 (PGF 2α-D4)의 뛰어난 복구를 제공했다. C.에서 PG 추출을위한 일반적인 계획 엘레는 그림 1에 표시됩니다. 크로마토 그래피 조건> 30 eicosanoid 기준 (표 1 13 표준을 보여줍니다)의 기본 분리를 제공하도록 최적화되었다. 0.1 % 포름산을 함유 물과 아세토 니트릴을 가진 하이드로-RP 컬럼 (250 X 2.0 mm ID)가 가장 분리와 감도를 제공. 야생 유형 및 지방 3 돌연변이 추출물의 조사 검사는 315-360 원자 질량 단위의 질량 범위에서 이온의 그림 2 문서 세계적인 수준의 그림. 지방 3 (WA22) 돌연변이는 대부분 20 탄소 된 PUFA 부족합니다. F3 클래스 PG가 강조 표시됩니다. 그림 3에서, 야생형 추출물의 MRM 분석 F1의 여러 PG 이성질체 (그림 3A를 표시 NG>), F2 (그림 3B), 및 F3 (그림 3C 및 3D) 클래스. F3 클래스는 두 개의 질량 전환 중 하나를 사용하여 검색 할 수 있으며, M / Z 193분의 351 또는 M / Z 191분의 351. CePGF2는 주로 PGF 2α의 거울상 이성질체로 구성되어 있습니다. CePGF1은 PGF 1α 또는 거울상 이성질체 될 가능성이 높습니다. 그림 4 CePGF2의 충돌 유발 분해 (RT = 11.8) PGF2 α 표준에 비해 (RT = 11.8)를 보여줍니다. 제품 이온의 사소한 차이는 가능성 추출물 낮은 CePGF2 풍부 공동 용출 화합물 때문이다.

그림 1. C.의 개략도 엘레 PG는 추출 및 LC-MS 분석. 모두 지질 산화를 최소화하기 위해 0.005 %의 BHT를 아세톤 / 염분 및 클로로포름합니다. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 야생형과 지방-3 (WA22) 돌연변이 추출물의 M / Z 315-360. 액체 크로마토 그래피 머무름 시간 (RT)의 조사 검색은 패널의 [A]로 표시됩니다. RT에서 추출 된 이온은 = 11.3 야생형 [B]와 지방 3 (WA22) [C] 추출물 표시됩니다. 질량 m / Z 351와 F3 클래스 PG가 강조 표시됩니다. CPS, 카운트 / 초, AMU, 원자 질량 단위입니다.

무화과URE 3. 야생형 추출물의 MRM 분석. F1 클래스 PG는이 질량 변화 M / Z 311분의 355 [A]로 감지됩니다. PG는 될 가능성이 여러 소수성 화합물 (RT> 14 분)이, 또한 이러한 변화로 감지되는 것을 알 수 있습니다. F2 클래스 PG는이 질량 변화로 감지하는 M / Z 193분의 353 [B]. F3 클래스 PG는이 두 질량 변화로 감지하는 M / Z 193분의 351 [C] 또는 M / Z 191분의 351 [D]. 추출물은 각 클래스의 여러 PG 이성질체를 포함하는 것을 알 수 있습니다. 번호는 표 2에 나타내 PG는에 해당합니다. CePGF2의 농도는 1.8 NG / ML입니다. RT, 체류 시간, CPS, 카운트 / 초.

그림 4. 화학적 신디사이저의 충돌 유발 분해PGF 2α 및 CePGF2을 esized. 패널의 화살표를 [A] PGF 2α 및 CePGF2 (RT = 11.8) 사이에 공유 제품 또는 조각 이온을 나타냅니다. M / Z 309 m / Z 193에서 제품 이온이 표시 구조에 해당하는 지시 분열 사이트 (a와 b 강조)에서 생성 및 F-시리즈 PG는의 특징 인 [B]. 있습니다 CPS, 카운트 / 초. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

표 1. 유지 시간과 LC-MS/MS 방법 3에서 13 eicosanoid 표준의 주요 제품 이온. 30 표준 LC-MS/MS 프로그램을 개발하는 데 사용되었습니다. 크로마토 그래피 유지 시간 (RTS)는도 매우 유사 PG는 사이 다릅니다. 예외는 PGF 1α와 PGF 2α입니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 PG는이 D입니다(- M / Z [MH])과 충돌 유발 분해 스펙트럼 (MS / MS) 부모 이온 질량에 의해 istinguished.

표 2. 몇 가지 주요 C.에 대한 충돌 유발 분해 제품 이온 엘레 F1, F2, F3와의 PG는 그림 3에서와 같이. 다른 덜 풍부한 이성질체의 MS / MS는 표시되지 않습니다. 이러한 데이터는 여러 분석에서이고 모든 제품 이온은 주어진 실행에 볼 수 있습니다. 추출물의 복잡성을 감안할 때, 일부 덜 풍부한 제품 이온 간섭 유사한 유지 시간이나 결과를 다른 부모 이온에서 파생 될 수 있습니다. 최대 2 가능성 CePGF1의 입체이며, 최대 4 가능성이 CePGF2의 입체 이성질체이다. 추가 자료 3 에드먼즈, 외. (2010)를 참조하십시오.

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