순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을 가능하게 체외에서.
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이 논문에서
요약
초록
규제 T 세포 (Tregs의)는 자체뿐만 아니라 특정 외국 항원에 대한 면역 내성을 제공하기 위해 필수적입니다. Tregs의는 TGFβ와 IL-2의 존재 TCR과 공동 자극 체외 순진 CD4 T 세포에서 생성 할 수 있습니다. 이 미래의 치료를위한 엄청난 잠재력을지지하지만, 분자 신호 전달 경로 제어 차별은 대부분 알 수 있다고.
기본 T 세포는 자궁외 유전자 발현을 조작하지만, 일반적인 방법은 일차 항원 인식 이전에 T 세포의 가장 중요한 순진 상태를 대상으로 실패 할 수 있습니다. 여기, 우리는 Treg 분화를 유도하기 전에 체외에서 순진 CD4 T 세포의 이소성 유전자를 표현하는 프로토콜을 제공합니다. 그것은 복제 결핍 아데노 바이러스 전달을 적용하고 그 생성 및 생산을 설명합니다. 아데노 바이러스는 대량 삽입 (최대 7 KB) 걸릴 수 있습니다 및 높은 과도 overexp을 달성하기 위해 발기인을 장착 할 수 있습니다T 세포 ression. 그들은 형질 전환 콕 사키 아데노 바이러스 수용체 (CAR)을 표현하면 효과적으로 순진 마우스 T 세포를 transduces. 중요한 것은 감염 후 T 세포가 순진 유지 (CD44 낮은 CD62L 높은)과 휴식 (CD25 - CD69 -)과는 Tregs의에 감염되지 않은 세포와 유사한 활성화하고 차별화 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 처음부터 CD4의 T 세포 분화의 조작을 할 수 있습니다. 그것은 초기 TCR 자극의 초기 신호 이벤트가 결국 차별화를 Treg으로 이어질 세포 변화를 유도 할 때 자궁외 유전자 발현이 이미 보장합니다.
서론
Tregs의 면역 관용을 유지하고 지나친 면역 반응을 저해하는 중요합니다. Tregs의는 방관자 T 세포의 활성화를 억제합니다. 따라서, Tregs의의 제거가 활성화 된 T 세포 1에 의해 구동 치명적인자가 면역과 자기 파괴에 이르게한다. Tregs의는 CD4 단일 긍정적 인 전구체의 부정적인 선택시 흉선에서 개발하지만, 그들은 또한 차선의 공동 자극 1,2 낮은 복용량 항원의 자극에 따라 순진 CD4 T 세포에서 주변에 구별 할 수 있습니다. 주변 Tregs의이 용기 나 폐에 내성을 제공 연루되어있다 반면 흉선 Tregs의는 자기 항원에 대한 조직의자가 면역을 억제하는 것 같습니다. 이러한 유도 Tregs의이 유력 음식과 공기, 공생 세균 및 알레르기 3,4에서 환경 항원을 포함하여 점막 외국 항원을 인식 한 후 T 세포의 활성화를 방지합니다. 또한, Tregs의 태아 펩티드에 산모의 허용 오차 5를 구축하고 사전에 중요하다환기 이식편 대 숙주 질환 6. 동시에, Tregs의도 7,8 종양 세포의 면역 감시를 감쇠에 의해 원치 않는 효과를 중재. Tregs의의 특징 기능은 하위 - 지정하는 전사 인자 Foxp3의 필요와 기능 9,10 Treg 부여하기에....
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프로토콜
1. 입력 벡터에 관심 유전자의 클로닝
- 입력 벡터로 관심의 유전자를 복제합니다. 국소 이성화 효소 결합 벡터 (예 : pENTR / D-TOPO) 또는 제한 효소 중재 복제이 절차를 사용할 수 있습니다에 무딘 엔드 내고 다음 유전자의 PCR 증폭.
2. pCAGAdDu 대상 벡터에 관심있는 유전자를 전송
- LR 재조합 (예 : 게이트웨이 LR Clonase II 효소 믹스)하여 대상 벡터에 입력 벡터의 관심의 유전자를 전송합니다. 이 아데노 바이러스 발현 벡터 (그림 1)을 생성합니다.
- , PACI 제한 다이제스트에서 아데노 바이러스 발현 벡터의 10 μg을 선형화 DNA를 침전하고 100 μL 당 μg의 농도로 물에 resuspend을. 선형화 V의 복제 및 encapsidation에 필요한 바이러스 거꾸로 반복 (ITR)를 줘라바이러스 입자에 iral DNA.
3. 기본 바이러스 해물의 생성
- 시드 1 개 6 잘 플레이트 잘 하나 2 ㎖ 세포 배양액 10 5 HEK293A 세포 (DMEM 10 ....
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결과
바이러스 생산
높은 바이러스 역가의 생성의 경우, 기본 바이러스 생산 또는 바이러스 증폭 HEK293A 세포 수확의 타이밍이 중요합니다. 바이러스 생산의 시각적 징후와 대표 형광 및 위상 콘트라스트 이미지는 그림 3에 표시됩니다. CPE는 십일 삽입하지 않고 제어 pCAGAdDu 벡터 HEK293A 세포의 형질 전환 한 후 관찰 하였다. CPE는 감염 마커 GFP의 높은 발현을 분리하고 전시하기 시작 확대와 라운드 업 세포와 영역의 모양을 특징으로하고 있습니다. CPE의 범위는 효율적으로 바이러스 생성을 나타내는 것입니다. 세포 배양과 유사한 CPE는 24 시간 이내에 수확 할 수 있습니다 보여 플레이트 - 72 시간, 그리고 원시 바이러스 해물은 동결 및 융해에 의해 생성 될 수 있습니다. 바이러스 역가은 다음 (그림 4) MOI 같은과 감염의 비교를 할 수 있도록 바이러스 해물 용액을 희석하여 확인할 수 있습니다. 선.......
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토론
바이러스 생성 및 적정
최적의 형질 결과, 선형화 된 벡터의 질과 양이 가장 중요 나타납니다. 감염이 빠르게 번 효율적인 바이러스 생산이 발생 진행할 것이기 때문에 우리는 문화의 초기 전면에 자라 난의 기본 해물 생산에 부정적인 영향을 관찰하지 않았다. 그러나 HEK293A 세포에 의해 바이러스 생산 효율을 감소 긴 삽입에 의해 영향을받을 수 있습니다. 일부 오픈 읽기 프레임은 실제로 바이러스의 생산을 방해 발견되었다. 이 바이러스 주식은 일반적으로 증폭 여러 라운드를 통해 구조 될 수 있으며, 단 몇 오픈 읽기 프레임은 바이러스 제품과 호환되지 않는 것으로 밝혀졌다. 5 × 10 10 감염성 입자 / ML - 우리의 경험에서, 바이러스 증폭 감염 후 48 시간 이내에 CPE의 모양은 일반적으로 약 1 × 10 9 바이러스 해물을 얻을 것입니다.
나이브 T 세포의 아데노 바이러스 감염
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공개 사항
저자는 이익에 대한 갈등을 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자는 고정 프로토콜의 제공에 pCAGAdDU 벡터와 올리버 고르 카 구축을위한 Lirui 뒤 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pENTR/D-TOPO 클로닝 키트 | Invitrogen | K240020 | |
| Gateway LR Clonase II 효소 혼합물 | Invitrogen | 11791020 | |
| PacI | New England Biolabs | R057S | |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N | |
| HEK293A 세포주 | Invitrogen | R705-07 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| 6웰 플레이트 | BD Falcon | 353046 | |
| 14cm 조직 배양 접시 | Nunc | 168381 | |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ 1)1Jdgr | Taconic Farms | 모델 번호 4285 | |
| Naive CD4+ T 세포 분리 키트 II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 | |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E | |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E | |
| L-글루타민 | Invitrogen | 25030 | |
| HEPES 완충 용액 (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | |
| MEM 필수 비타민 혼합물 (100x) | Lonza | 13-607C | |
| 세포 확장 및 활성화를 위한 Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen | 114-56D | |
| 재조합 인간 TGF-beta 1 | R& D Systems | 240B | |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | ||
| LIVE/DEAD 고정식 블루 데드 셀 스테인 키트 | Invitrogen | L-23105 | |
| 마우스 BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 | |
| 안티-마우스/랫 Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA 분석 | Roche Applied Biosystems | ||
| LightCycler 480 프로브 마스터 | Roche Applied Biosystems | 04902343001 | |
| TaqMan MicroRNA 역전사 키트 | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
참고문헌
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H.
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재인쇄 및 허가
