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방법 논문

장기 상승 작용으로 매우 안정하고 재현성 기록을위한 향상된 준비 및 해마 마우스 조각의 보존

27K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50483

⸱

2013년 6월 26일

 , 
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences, University of Mons

이 논문에서

요약

이 논문은 준비하고 유지하는 완벽한 방법을 제공합니다 체외에서 급성 해마 조각. 이 프로토콜은 95 %의 성공률로 8 시간 이상 아주 안정되어 오래 지속되는 장기 potentiation (LTP)의 녹음을 할 수 있습니다.

초록

장기 상승 작용 (LTP)는 시냅스 강도의 증가에 의해 특징 시냅스 가소성의 한 종류이며 메모리 인코딩에 관련된 것으로 믿었다. LTP는 광범위하게 연구되어왔다 급성 해마 슬라이스의 CA1 지역에 이끌려. 그러나이 현상의 유지 보수 단계의 기초가되는 분자 메커니즘은 여전히​​ 제대로 이해하고 있습니다. 이 서로 다른 실험실에서 사용하는 다양한 실험 조건에 부분적으로 인해 수 있습니다. 사실, LTP의 유지 보수 단계는 산소, 온도 및 습도 등 외부 변수에 크게 의존한다. 또한 절개 후 슬라이스 평면과 조각 생존의 방향이 같은 내부 파라미터에 따라 달라집니다.

이러한 모든 매개 변수의 최적화는 매우 재현성이 매우 안정적인 장기 상승 작용을 유도 할 수 있습니다. 이 방법은 더 안정적인 증가에 관련된 분자 메커니즘을 탐구 할 수있는 가능성을 제공합니다해마 슬라이스 시냅스 강도를합니다. 또한 신경 생리 학적 현상의 체외 조사에서의 실험 조건의 중요성을 강조한다.

서론

요즘 복잡한 메모리를 저장하고 신경 회로 수준에서 호출하는 방법의 제한으로 이해가있다. 그러나 메모리 스토리지의 통합 가설이 가능하고 광범위하게 허용됩니다 : 메모리는 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 연결의 강도의 변화로 저장됩니다. 자신에 시냅스 가소성에 대한 연구는 크게 두 가지 획기적인 발견의 혜택을 받았다. (1)에서 그대로 마취 토끼를 사용하여 정액 실험, 행복과 로모 1, 짧은 높은 주파수 (1 초, 100 Hz에서) 해마의 perforant 경로에 자극의 전달이 오랫동안 (몇을 일으키는 원인 발견 시간) 관련 시냅스 연결의 증가. 이 매혹적인 현상 1975 2 더글러스 고다드에 의해 "장기 상승 작용"또는 LTP를 불렀습니다. (2) 나중에, 그것은 유사한 현상 (0.4 mm) 뇌 조각에서 트리거 될 수있는 것으로 나타났습니다 인위적으로 체외에서 살아 유지 . 가장 널리 연구 LTP는 소위 CA1 영역의 피라미드 신경 세포에서 유발의 결과 필드 흥분성 시냅스 전위를 기록하는 동안 축삭 (소위 샤퍼의 담보)의 번들로 하나 또는 여러 tetani에 전달하여 체외에서 관찰되었다. LTP 유도의 메커니즘은 크게 공개되었다. AMPA 수용체의 인산화 (효율성 증가)과 시냅스 막 3 여분의 AMPA 수용체의 결합 : 기본적으로, NMDA 수용체를 통한 칼슘 2 + 유입은 두 가지 결과를 초래 효소를 활성화합니다. 이 실험적으로 훨씬 더 어려운 30 ~ 60 분보다 몇 시간 동안 건강한 슬라이스를 유지하는 것입니다 특히 때문에 대조적으로, LTP의 유지 보수 단계의 메커니즘은 대부분 알 수 있습니다.

연구의 많은 LTP 메커니즘과 흥미로운 이론의 이해에 전념 한이 년 4-11에 정교하고있다. 그러나 유엔틸 지금, 시냅스 강도 안정적인 증가를 기본 정확한 분자 메커니즘이 밝혀되지 않았습니다. 이 준비를 위해 서로 다른 기술을 사용하여 서로 다른 실험실에서 이전 결과를 재현하는 어려움과 해마 슬라이스의 유지에 부분적으로 인해 수 있습니다. 자신의 방법론 논문에서는 Sajikumar 등. 12 쥐의 해마 슬라이스와 안정 LTP의 기록의 준비를 위해 실험 조건의 중요성을 강조했다. 이 비디오에서 우리는 쥐 해마 슬라이스에 매우 안정적인 LTP를 기록 할 수 년 동안 우리 실험실에서 개발 된 모든 최적화 단계를 제시한다.

이 최적화는 쥐 13 쥐 11 LTP 메커니즘을 연구 다른 실험실에서 개발하고 성공적으로 사용되는 프로토콜에서 변경되었습니다. 그것은 경험이 풍부한 연구자 유도하고 성공의 높은 속도를 가진 성인 마우스에서 매우 오래 지속 LTP를 기록 할 수 있습니다. P유도 된 LTP의 hysiological 기준은주의 깊게 검사하고 14 증명되었다. 이 방법론의 논문에서, 우리는 해부 절차 깊이 슬라이스 흥분을 수정할 수 있지만 온도 나 산소와 같은 실험 조건의 수정, LTP 유지에 지대한 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다. 또한 이러한 모든 매개 변수의 정밀 제어가 초보 학생들을위한 몇 개월의 교육을 필요로하는 강조해야합니다.

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프로토콜

모든 동물의 절차는 연구에 동물의 관리 및 사용에 대한 보건 규정의 국립 연구소에 따라 그리고 지역 윤리위원회의 계약을 수행 하였다.

1. 인공 세리 - 척수의 준비

동일한 매체가, 해부 잘라 휴식 기간 전기 생리학 녹음하는 동안 조각 (1 ML / 분) 붓는다하는 데 사용됩니다. 이 매체는 124 mM의 NaCl을 4.4 mM의 KCl을 26 mM의 NaHCO3를, 1 ㎜의 NaH 2 PO 4, 2.5 MM의 염화칼슘, 1.3 mM의 황산 마그네슘 및 10 MM D-포도당으로 구성되어 있습니다.

  1. (1 M) 용액에 이미 황산 마그네슘을 제외한 ACSF 2 L에 대해 서로 다른 구성 요소를 무게. 분말 황산 마그네슘이 높은 흡습성 + 때문에 표준 용액을 사용하여 마그네슘 2의 정확한 농도를 확인 할 수 있습니다. 칼슘 2 + : 마그네슘 2 + 비율이 크게 LTP 유도 및 유지에 영향을14 따라서 ​​그들의 비율은 항상 존중되어야합니다.
  2. 유리에 염화칼슘을 제외한 모든 구성 요소를 넣어 실린더를 졸업하고 증류수 H 2 O 2 L에 가져다
  3. 적극적으로 약동하십시오. 모든 것을 녹일 때, 탱크 (95 % O 2, 5 % CO 2)에 부착 된 수족관 버블과 튜브를 통해 carbogen을 추가합니다. 몇 분 기다린 후 pH를 중탄산염 버퍼의 작용에 의해 7.4로 고정되어 염화칼슘을 추가합니다.
  4. 냉장 사각 유리 접시에 600 mL를 유지하고 ° C 접시 주위에 얼음을 4로 냉각. 이 매체는 해마 해부에 사용됩니다.
  5. 나머지 1,400 mL를 필터링하고 삼각 플라스크에 유의하십시오.

2. 전기 생리 조작과 뇌 슬라이스 녹음 챔버의 준비

관류 회로는 2 연동 펌프, 예비 탱크에서 신선한 액체를 펌핑 하나 t에서 다른 펌핑 사용되는 액체로 만든다그는 빈에 챔버를 기록. 신선한 유체는 다시 산소와 중력 (그림 1A)에 의해 인터페이스 녹음 챔버에 도달하기 전에 따뜻하게 집에서 만든 관류 시스템에 추가됩니다. 인터페이스 녹음 챔버는 FST (파인 과학 도구, 밴쿠버, 캐나다, 그림 1B)에 의해 설계되었습니다. 조직 슬라이스는 이동식 잘 링에 부착하고 지속적으로 잘 바늘 흡인의 높이를 조정하여 인터페이스 상태에서 유지 될 수 짠 그물 필터에 배치됩니다. 그 말과 (0.5 mm) 옆 구멍에서 차단 집에서 만든 플라스틱 관은 챔버 수준의 안정성을 높이기 위해 흡입 바늘로 고정됩니다. 기록 헤드는 기록 헤드 (물방울 형성​​을 감소하는)의 편향 포트를 통해 습한 공기를 전달하여 습한 환경을 유지하는 데 도움 가스 분산 돌을 포함하는 물을 욕조에 장착됩니다. 목욕 및 중간 온도는 지속적으로 DC 전류 일의 수준을 변화시킴으로써 제어거친 실리콘 고무가 내장 된 수조에 히터 요소입니다. 물 목욕 및 녹음 우물 서미스터 챔버 온도는이 사이트에 설정하고 정확하게 모니터링 할 수 있습니다.

실의 난방 시스템은 전체 장비의 온도를 제어하는​​ 글로벌 난방 시스템에 의해 완료됩니다. 에든버러 대학 (연구자에 의해 개발 된 소프트웨어 www.etcsystem.com는 ) 산소 공기의 온도, 뇌 슬라이스, 전극 및 장기 레코딩 (그림 1C)를위한 안정적인 환경을 제공하는 나머지 장비를 모니터링하고 이퀄라이제이션 . 마우스 해마 슬라이스에 사용되는 온도는 28 ° C.이다

  1. 20 분의 최소 증류수 H 2 O와 모든 관류 회로를 헹구고 난방 시스템을 시작합니다.
  2. 회로의 carbogen 버블 링을 시작합니다. Carbogen f를 통해 집에서 만든 관류 관에 도착ilter 초 및 기록 챔버 아래에 목욕한다. 물 목욕 유량은 유량계에 의해 제어됩니다. 흐름 속도가 너무 느린 경우, 조직 저산소증 될 수 있습니다. 유량이 너무 높으면 반대로, 가스는 충분히 따뜻하게하고 조직의 건조로 이어지는 습기를하지 않을 수 있습니다. 높은 가스 유량은 삼투 충격을 선도 아래에 목욕에서 조직에 살포 물의 가능성을 높일 수 있습니다. 이 편향 포트의 출구 나일론 메쉬 비트 (100 μM)을 첨가하여 방지 할 수 있습니다.
  3. 회로를 배수하고 필터링 ACSF와 입력하십시오.
  4. 보유 챔버에서 슬라이스를 지원하는 반지를 넣어. 500 ~ 750 μm의에 이르기까지 메쉬 개구부 짠 그물 필터는 두 부분 에폭시 수지 접착제로 뻗어 고리에 연결되어 있습니다. 짠 그물 필터는 87 % 폴리 아미드와 13 % 스판덱스 (팬티 15 덴)로 만든다. 접착제 린의 표면 릴리프의 형성을 피하기 위해 신중하게 적용해야g.
  5. 회로에서 모든 공기 방울을 조심스럽게 제거합니다.
  6. 흡입 바늘의 나사를 기록 챔버에서 ACSF의 레벨을 조정합니다. 연동 펌프의 속도는 유입 펌프 1 ML / 분에 5 ML / 콘센트 펌프 분으로 조정됩니다.

관류 시스템은 엄격한 내진 테이블에 배치하고 패러데이 케이지에 의해 둘러싸여 있습니다.

3. 해부 영역의 준비

수술기구 : # 11 블레이드 스탠다드 해부 가위, 봄, 가위, 곡선 포셉, 두 HEIDEMANN spatulae와 숟가락 메스.

보충 자료 : 단두대,있는 underpad, 면도날 맥일 웨인 조직 헬기, 필터 종이, 고무 젖꼭지와 유리 파스퇴르 피펫, 2 플라스틱 파스퇴르는 넓은 입, 페트리 접시의 금속 실린더 중 하나를 피펫 7mm 직경 (그림 2A).

    차가운 ACSF (단계 1에서 제조) 가득 해부 접시에 필터 종이에 싸서 염색 접시에서 냉장 유리 뚜껑을 담그지. 조심스럽게 수족관 버블 (그림 2A)를 통해 기포 및 산소 ACSF를 제거합니다.
  1. 사용 순으로 악기를 배치. 조직 헬기 플레이트와 증류수와 에테르 (그림 2B)로 세척 새로운 면도날에 필터 종이의 세 가지 레이어를 추가합니다. 이 종이에 닿을 때 면도날은 수평이어야한다. 블레이드 힘은 최대 값의 약 삼분에 최대 값과 속도의 절반으로 조정됩니다.
  2. 당신이 나중에 시간이 없기 때문에 모든 (악기, 온도 ...) 준비가되어 있는지주의 깊게 확인합니다.
  3. 차가운 ACSF 가득 파스퇴르 피펫과 절개를 살포 사람을 부탁드립니다.
  4. 잘린 전에 Nembutal IP (100 ㎎ / ㎏)로 마우스를 마취. 할로 탄 마취도 사용할 수 있습니다. 우리는 방법과 obta을 모두 비교 한동일한 결과를 ined. 잘린 마취하에 수행해야하지만 자궁 경부 전위도 사용할 수 있습니다. 그러나 자궁 경부 전위 동물의 고통을 피하기 위해 매우 좋은 연습이 필요합니다.
  5. 추운 ACSF 연속에서 샤워 가능한 한 빨리있는 underpad에 해부.

4. 뇌 제거

  1. 총구에 한 손의 검지 손가락과 엄지 손가락으로 여전히 머리를 들고있는 동안, 단두대 컷의 가장자리에서 시작하여 정면 뼈 rostrally 실행하는 머리의 상단 중앙을 따라 해부 가위로 절개를 .
  2. 완전히 두개골 판을 노출하고 머리의 꼬리 측에 근육을 제거하는 머리의 각 측면에 피부 근육을 잘라.
  3. 해부 가위, 각 측면에 측두근 근육을 잘라 측두근 판을 따라, 그 횡단, 중앙에 정면 플레이트를 잘라. 그런 다음 두 개의 PL 사이의 후두 뼈에 약간의 상처를 만들ATES.
  4. 각 측면에 대해, 후두 격판 덮개의 꼬리 기지에서 잘라.
  5. 스프링 가위로 시상 봉합을 따라 잘라.
  6. 포셉, 서로를 멀리 확산에 의해 두개골 반쪽을 제거합니다.
  7. 메스, 단지 후각 망울 후 횡단 잘라 소뇌는 차가운 ACSF과 해부 접시에 추출 된 뇌 자녀들의 나이를 직전.

5. 해마 해부

  1. 뇌 해부 접시에 immerged되면​​, 중간에 삽입 메스 서로의 두 반구를 절단.
  2. 해마의 박리는 양안 수술 현미경 (X25, 그림 2A)를 통해 시각적으로 제어 spatulae으로 수행됩니다. 하나의 반구에 신중 측면 뇌실을 볼 구조를 확산. 뇌간과 간뇌를 제거합니다. 이 한 쪽 전두엽 피질에 spatulae을 적용하고에 간뇌에 이루어집니다다른 측면. spatulae와 해마를 만지지하고 조직 절편 동안 그것을 스트레칭하지 않도록주의하십시오.
  3. 원개 다음 부드럽게 뇌실에 주걱을 삽입하여 피질 (굴러)의 해마를 밀어 절단.
  4. 해마가 추출 될 때, 과도한 피질 조직과 남아있는 혈관을 제거합니다.

6. 조각의 절단

  1. 넓은 입 플라스틱 파스퇴르 피펫으로, 그 알 비어 표면 위쪽 (볼록면)와 숟가락 해마를 전송합니다.
  2. 표준 플라스틱 파스퇴르 피펫과 초과 액체를 제거합니다.
  3. 수직으로 거의 헬기의 필터 용지 (그림 2B)를 터치 숟가락을 기울 빠르게 필터 종이를 만져, 숟가락 해마 내려 다음 숟가락을 다시 이동합니다.
  4. 해마의 방향 및 (hippocam의 방향에 대한 그림 2C를 참조 헬기와 400 μm의 횡단을 슬라이스면도날을 기준으로 고름). 가능한 한 빨리 역할을합니다.
  5. 슬라이스 해마와 필터 용지를 제거하고 조각 조금을 확산하기 위해 금속 실린더 주위를 감 쌉니다. 그런 다음, 무료 표준 플라스틱 파스퇴르 피펫과 차가운 ACSF 가득 페트리 접시에 그들을 수집을 사용하여 ACSF의 스프레이 조각.

7. 인터페이스의 조각의 배양

  1. 표준 플라스틱 파스퇴르 피펫 조각을 선택하고 빠르게 녹음 챔버에 배치합니다. 조각은 28에서 인터페이스에서 직접 녹음 챔버 해부 외상 복구 ° C.
  2. 슬라이스는 대부분 싱크됩니다. 슬라이스 수준에 도달하기 위해 유체 수준을 낮 춥니 다하고 그것을 떠 있도록 할 올립니다.
  3. 레벨을 낮추면서 올바른 위치에 조각을 켭니다. 조각 CA1 영역에서 전극의 위치 (2 자극 한 기록 전극)을 용이하게하기 위해 같은 방법으로 항상 지향합니다.
  4. 시 정지유체 인터페이스입니다. 슬라이스 주위 매체의 "초승달은"매체의 충분한 수준을 나타내는 것입니다. 넷 필터는 미디어 포화는하지만, 완전히 침수되지해야합니다.
  5. 구멍 뚜껑 위에 배치 여과지로 덮여 챔버를 유지합니다.
  6. 28 적어도 1.5 시간 동안 슬라이스 나머지를하자 ° C.

8. 시냅틱 응답의 기록

  1. 전극 기록 : ACSF 가득 할 때 유리 모세관 MΩ 2-5의 팁 저항을 얻기 위해 뽑아됩니다. 필터 종이의 작은 조각은 전극의 끝 부분 주위에 배치되어 뼈 왁스 응축을 줄이기 위해 말단에 적용됩니다. 자극 전극 : 12.5 μm의 직경 백금 - 이리듐 바이폴라 클러스터 전극 FHC (USA)에서 구입. 적절한 치료와 함께, 각 전극은 최소 30 시간 (그림 1B)를 사용할 수 있습니다.
  2. CA1 지역의 지층 radiatum에 전극을 놓고, 모든 전극 지어최대 (그림 3A). 전극은 Narishige의 미세 조작기와 조각의 표면 아래 75-150 μm의 하향 조정됩니다. 두 자극 전극은 샤퍼 담보의 두 가지 번들을 자극하는 배치됩니다. 전극 슬라이스로 내려 할 때, 여과지주의 깊게 챔버를 닫 모든 주위에 배치됩니다.
  3. 바이 페이 자극 (반 파장 당 0.08 밀리 초 펄스 지속 시간) SIU-V 절연 장치에 연결된 잔디 자극과 일정한 전압에서 수행됩니다. 최대 응답은 12 V. 필드 EPSPS는 WPI ISO-80 앰프와 1000 배 증폭, 10 Hz에서 10 kHz에서 필터링 최대 2 V에서 자극 강도를 증가에 의해 확인된다. 신호는 국립 악기 A / D 변환기를 통해 PC로 전송됩니다. 자극, 데이터 수집 및 분석 WinLTP 프로그램 (사용하여 수행됩니다 www.winltp.com을 ). 필드 EPSPS는 입력 아웃에서 얻은 최대 진폭의 40 %에 기록됩니다곡선을 넣어. 각 조각, fEPSP 슬로프는 LTP 유도 앞에 30 분 동안의 평균 기울기에 대한 정규화됩니다.
  4. LTP는 두 번째 경로는 제어 역할을하면서 하나의 통로에 테스트 강도 자극 한 열차 (100 Hz에서)을 적용하여 트리거됩니다.

9. 설치 청소

  1. 적어도 10 분 동안 과산화수소 (H 2 O 2)의 3 % 용액으로 모든 회로를 씻어 후, 드레인. 회로는 조심스럽게 실험을 시작하기 전에 증류수로 세척한다. 다른 실험실 청소 만 증류수를 사용하지만 물을 사용할 때 우리는 튜브 시스템의 어두운 잔류의 증착을 발견했습니다로서 H 2 O 2를 사용 절대적으로 필요하지 않습니다.
  2. 녹음 챔버 아래의 물을 욕조에 물을 교체합니다.
  3. 5 분 알코올 목욕은 자극 전극 팁.

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결과

이 방법은 성인 C57BL/6J 마우스 (잰 비어 SAS, 프랑스)의 14에서 급성 해마 슬라이스에 유도 오래 지속되는 장기 상승 작용의 특성을 분석하는 데 사용되었습니다. 놀랍게도, 실험 조건의 개선은 LTP를 바라 보는 새로운 방식을 주도하고있다. 우리는 시냅스 강도의 지속적인 증가는 새로운 단백질의 합성을 요구하지 않은 것으로 나타났다.

여기, 우리는 LTP 유도가 슬라이스 생존과 흥분에 따라 달라집니다 것을 보여줍니다. 해마의 절개가 너무 느리거나 너무 유해한, 슬라이스 흥분이 증가하고 polysynaptic 응답 (그림 3B) LTP 유도 한 후 관찰 할 수있다. 이 경우, LTP 유도가 훨씬 덜 효과​​적이었고, 상승 작용이 유지되지 않았습니다.

우리는 하나에 의해 유도도 조각에 분명히 건강, 기술적 조건은 LTP의 기간에 큰 영향을 가지고 있다는 사실을 강조하고 ...

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토론

우리는 우리의 실험실에서 개발 LTP 녹음 11,17에 큰 전문 지식을 가진 다른 실험실에서 사용되는 방법의 조합에 따른 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 성인 쥐 해마에 적응하고 모든 연령 및 배경 유전자형의 동물에 사용할 수 있습니다. 또한 알츠하이머 병 18,19 같은 neurodegenerative 질병을 개발하는 형질 전환 생쥐에서 LTP의 분석을 할 수 있습니다.

쥐의 해마 슬라이스에 대해이 프로토콜의 활용 몇 가지 적응을 필요로 할 수 있습니다. 예를 들어, 쥐에서 수행 된 연구의 대부분은 32 ° C 대신 28 ° C.의 온도를 사용 마티스 등. 20 노화 생쥐 나 쥐에서 해마 슬라이스의 준비를 위해 다른 방법을 제안 하였다.

재료 및 방법

잰 비어 SAS (프랑스)하지만 동일한 결과에...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

우리는 기술 지원 버나드 Foucart 감사합니다. 이 작품은 과학 연구를위한 벨기에 기금 (FRS-FNRS)에 의해 의료 연구를위한 엘리자베스 여왕 기금에 의해 지원되었다. 아녜스 빌러는 과학 연구를위한 벨기에 기금의 연구원입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약/재료
NaCl시그마 - AldrichS7653
NaHCO3Sigma - AldrichS8875
KCl시그마 - AldrichP9333
D-포도시그마 - AldrichG7528
NaH2PO4 시그마 - AldrichS9638
MgSO4 1M시그마 - Aldrich63126
CaCl2Sigma - AldrichC4901
CarbogenAir Liquide (벨기에)
CapillariesWPI, Inc. (영국)TW150-4
자극 전극FHC (미국)CE2B30
수술 도구FST (독일)
여과지 84g/m2SartoriusFT-3-105-110
메쉬라이크라15 덴
접착제UHU플러스 endfest300
Instrument
AmplifierWPI, Inc. (영국)ISO-80
인터페이스 레코딩 챔버FST (독일)
연동 펌프Gilson (미국)Minipuls 3
온도 컨트롤러University of Edinburghwww.etcsystem.com
Tissue ChopperMcllwain
자극기Grass (USA)S88X + SIU-V
프로그램 분석WinLTPwww.winltp.com
MicromanipulatorsNarishigeMM-3 및 MMO-220A
수술용 현미경Leica Microsystem
A/D 컨버터National InstrumentsNIPCI-6229 M 시리즈
당

참고문헌

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