방법 논문

문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

DOI:

10.3791/50487

⸱

2013년 9월 16일

 ,  , 
1Section of Endocrinology, Denver VA Medical Center, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver School of Medicine

이 논문에서

요약

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인간 neuroprogenitor 세포 (NPC들)은 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 neurotrophins과의 조합의 존재에 신경이 풍부한 문화로 분화되었다. 신경 세포 마커는 면역 형광 염색으로 검출되었다. 뉴런의 순수한 인구를 분리하기 위해,의 NPC는 PEN 막 슬라이드에 차별화 된 레이저 캡처 미세 절제를 행 하였다.

초록

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인간 태아의 뇌에서 분리 Neuroprogenitor 세포 (NPC들)는 표피 성장 인자 (EGF) 및 세포의 풍부한 공급을 제공하는 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)의 존재하에 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 신경 성장 인자 (NGF)의 새로운 조합의 존재하에 분화 된, 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), dibutyryl 캠프 (DBC) 및 폴리-L-라이신 및 마우스 라미닌 코팅 접시에 레티노 산은 신경 세포를 얻는 풍부한 문화. NPC들도 neurotrophins과의 부재, DBC 및 레티노 산 및 성상 세포가 풍부한 배양을 수득 모양체 신경 영양 인자 (CNTF)의 존재하에 분화되었다. 차별화의 NPC는 노이 앤, synapsin, 아세틸 콜린, 시납과 GAP43 등의 신경 세포 마커의 패널에 대한 면역 형광 염색을 특징으로했다. 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)와 STAT3, 성상 세포 마커는 차별화 된 NPC의 10 ~ 15 %가 검출되었다. 용이하게하기 위해셀 타입의 특정 분자 특성은 레이저 캡처 미세 절제는 폴리에틸렌 나 프탈레이트 (PEN) 막 슬라이드에서 배양 신경 세포를 분리 하였다. 이 연구에서 설명하는 방법은 신경 퇴행의 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해를 사전에 가치있는 도구를 제공합니다.

서론

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평생 신경은 측면 심실의 subventricular 영역과 성인 포유류의 뇌 (1)의 치아 이랑의 subgranular 층에서 발생하는 것으로 알려져 있습니다. Neuroprogenitor 세포 (NPC들)이이 지역에서 발생이 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포 (2)로 분화 할 수있는 다 능성 세포입니다. NPC들 때문에 파킨슨 병, 근 위축성 측삭 경화증, 뇌졸중, 알츠하이머 병 (AD) 3 등 다양한 퇴행성 신경 질환을 가진 환자에 이식 할 잠재력의 관심을 생성했다. 의 NPC와 연구는 일반적으로 이식 각도에 집중했지만 신경 퇴행의 메커니즘을 결정하는 세포 배양 모델로서 NPC 유래 신경의 전위는 충분히 이용되지 않았다. 그렇지 않은으로 이전 연구는 일반적으로 각 실험에 대한 격리 할 필요가 쥐의 뇌 조직에서 분리 된 후 유사 분열 신경을 사용했습니다자기 갱신. SH-SY5Y 및 SK-N-MC 세포를 포함한 인간 신경 아세포종 세포주는 확장 될 수 있지만, 그들은 차 신경의 특성이 없다. 그들은 여러 계대 확장 될 수 있고, 차 뉴런 4,5의 특성과 함께 세포 집단을 생성하기 위해 구별 될 수 있기 때문에 인간의 NPC는 반면에, 양쪽의 이점을 제공한다. 현재의 연구에서, 우리는 인간 태아의 뇌에서 분리 된 시판의 NPC에서 일관성있는 신경 세포의 풍부한 인구를 얻기 위해 새로운 분화 프로토콜을 설명합니다. 이러한 문화가 glial 세포의 작은 퍼센트를 포함 않기 때문에, 우리는 분자 특성에 대한 신경 세포의 순수한 인구를 분리하기 위해 추가적인 방법이 필요합니다. 레이저 캡처의 microdissection (LCM)는 조직 절편에서 세포의 동종 집단을 선택적으로 유전자 발현 분석 (6)에 대해 포착 될 수있는 새로운 기술이다. 뇌는 신경 세포, 아교 및 다른 세포 타이로 구성된 이종 조직이다PES. LCM은 신경 세포 특이 유전자의 발현을 결정하는 데 사용되었다 70-10을 분석한다. 우리는 이전에 구체적으로 해마의 신경 세포 11 감소 사이 클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질의 발현 (CREB)과 BDNF를 보여 AD (Tg2576) 마우스 뇌 섹션에서 해마의 뉴런의 LCM을 수행했습니다. 본 연구에서는 PEN 막 슬라이드에서 배양 된 신경 세포의 분리에 대한 인간의 NPC의 확장, 신경 세포의 분화, 신경 세포 마커에 대한 면역 형광 염색 및 LCM에 대한 절차를 설명합니다.

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프로토콜

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1. 인간의 NPC의 확장 (그림 1)

  1. 냉동 태아의 뇌 (론자, 워커, MD, USA) 및 확산 보충제, EGF (10 NG / ML)를 포함 neurobasal 매체 neurosphere를 (그림 1A)로 T-75 플라스크 현탁 배양을에서 인간의 NPC의 주식을 회복 FGF (10 NG / ㎖).
  2. 문화의 3 일 후에, 5 분 동안 500 rpm에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 neurosphere를 전송할 수 있습니다.
  3. 세포 펠렛 위 ~ 100 ㎕의 매체를 남겨두고 뜨는을 취소하고 에펜 도르프 튜브에 전송할 수 있습니다. 100 μL의 세포 펠렛은 2 T-75 플라스크로 분할 충분하다. neuroprogenitor 세포 얇은 분할면 증식 실패로 이하, 플라스크의 수를 줄이는 경우.
  4. 튜브의 바닥에 대하여 200 μL 팁을 유지하면서, 200 μL 팁 50X로 펠렛을 씹다. 똑같이 두 부분으로 세포 현탁액을 나누고 2 T-75 플라스크 (1-2 분할), 계속 하나에 추가차별화를위한 확장과 다른.
  5. neurosphere를이 300 ~ 500 μM의 원래 크기에 도달 할 때까지 모든 4~5일 매체를 변경하여 확장 (첫 번째 플라스크)에 대한 neuroprogenitor 세포의 문화를 계속합니다. (500 rpm으로, 5 분) 원심 분리하여 매체를 변경, 기존의 매체를 폐기하고 새로운 매체를 추가 할 수 있습니다.

2. 신경 풍부한 문화에 인간의 NPC의 분화 (그림 2)

  1. 신경 세포의 풍부한 문화에 neuroprogenitor 세포의 분화를 들어, 각 웰에 500 μl를 추가하여 폴리-L-라이신 100 μg / ㎖로 24 - 웰 플레이트와 코트의 각 웰에 하나의 커버 슬립을 배치합니다. RT에서 30 분 동안 접시를 품어.
  2. 폴리-L-라이신 솔루션을 기음과 멸균 물 접시를 씻어.
  3. 다음, 코트는 5 ㎍ / ㎖의 마우스 라미닌 500 μL와 접시의 우물과는 30 분 동안 품어. 배양 한 다음, PBS로 우물을 씻어.
  4. 사일 splitti 후세포 (단계 1.4) 겨, 24 웰 플레이트의 웰 당 ~ 500을 neurospheres의 밀도로 코팅 된 요리로 '차별화'라는 플라스크에있는 작은 neurosphere를 전송합니다.
  5. neurosphere를이 접시에 부착하면 6 시간 후, 증식 배지를 제거하고 neurobasal 매체로 구성된 차별화 매체를 추가, B27 보충제, NGF (20 NG / ML), BDNF (10 NG / ML), DBC (100 ㎜), 및 레티노 산 (2 μM).

3. 차별화의 NPC의 면역 형광 염색법 (그림 3)

  1. 두 주 동안 신경 세포 분화 배지에서 neuroprogenitor 세포의 문화에 따라, 신경 세포의 풍부한 문화를 얻을 수있다. 한 번 PBS에 신경을 씻어 다음 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 수정합니다. 고정되면, PBS로 세포를 세 번 씻어.
  2. 60 분 동안 RT에서 permeabilization 완충액 (5 %의 BSA와 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100)으로 세포를 배양한다.
  3. 4 ° C의 난에서 요리를 O / N을 품어NA의 다음 PBS에서 3 % BSA의 클론 및 단클론 항체의 조합으로 통 : 노이 앤 (1:250) 및 synapsin (1:250), 콜린 에스 테라 아세틸 (1:500) 및 시납 (1:250), BDNF (1 : 500) 및 GAP43 (1:250), STAT3 (1:500) 및 GFAP (1:1,000).
  4. PBS와 커버 슬립을 세 번 씻어 준 후 90 분 동안 실온의 어두운 곳에서 안티 - 토끼를 Cy3 및 안티 마우스 FITC 차 항체를 품어. 배양 한 다음, PBS로 커버 슬립을 세 번 씻는다.
  5. 집게로 배양 접시에서 커버 슬립을 꺼내 설치 매체에 거꾸로 배치, 유리 슬라이드에 장착 매체의 10 μl를 놓습니다. 부드럽게, 초과 설치 매체를 닦아 매니큐어와 가장자리를 밀봉.
  6. 형광 현미경의 면역 염색 신경을 검사합니다.

4. 뉴런의 레이저 캡처 미세 절제 (그림 4)

  1. PEN 막 슬라이드에 신경 세포의 풍부한 문화에 NPC의 차별화도 2에 대해 기술 된 절차에 따라 폴리-L-라이신 및 마우스 라미닌으로 코팅들.
  2. RNase가없는 상태에서 이후의 모든 단계를 수행합니다.
  3. 세포를 시각화하는 HistoGene 스테인 (악튜러스)를 사용하여 문화를 얼룩.
  4. 베리타스 LCM 시스템 전체 슬라이드의 도로지도 이미지를 사용하여 성상 세포의없는 순수한 신경 세포 인구의 영역을 찾을 수 있습니다. 그리기 도구를 사용하여 신경을 표시합니다.
  5. 이 단계 과정에서 컴퓨터 제어 정밀도 및 자동화를 사용하여 이러한 영역의 레이저 캡처를 수행한다. 첫째, IR (적외선)은 멤브레인 캡에 부착 얻기 위해 70 ㎿가 2,500 마이크로 초 펄스의 레이저 전원 설정으로 여러 장소에서 발생합니다. 다음으로, 표시 영역 (10)은 측정 값의 낮은 레벨 설정에서 UV 절삭 공구를 사용하여 절개된다.
  6. 이러한 프로세스의 결합을 선택적으로 CapSure LCM 매크로 모자에 PEN 막에서 표시된 영역을 캡처합니다. 상기 캡을 들어 올릴 때, n 인 멤브레인eurons 캡을 준수합니다.
  7. PicoPure RNA 분리 키트 (악튜러스)를 사용하여 LCM 샘플에서 총 RNA를 분리하고 DNA 분해 효소로 처리.
  8. 키트의 지시에 따라 RiboAMP RNA 증폭 키트를 사용하여 격리 된 RNA를 증폭.
  9. 인간의 신경 미세 섬유 중쇄 (hNFHc)을 감지하는의 TaqMan 프로브를 사용하여 실시간 RT-PCR 분석을 수행합니다.

약어 :

AD, 알츠하이머 병, BDNF, 뇌 유래 신경 영양 인자, CREB, 사이 클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질, DBC, Dibutyryl 사이 클릭 AMP, EGF, 표피 성장 인자, FGF, 섬유 아세포 성장 인자, GFAP, 아교 섬유 성 산성 단백질, LCM, 레이저 미세 절제를 캡처; NGF 신경 성장 인자; NPC, neuroprogenitor 셀; PEN, 폴리에틸렌 나 프탈레이트.

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결과

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NPC가 확대 (그림 1)

이 neurosphere를 저작하여 단일 세포 현탁액으로 세분화 할 때, 피펫 팁은 현탁액 상하 피펫 일부 저항이 존재하도록 튜브의 바닥을 터치 할 필요가있다. 분쇄 횟수는 개인과 현미경으로 얻어진 세포 현탁액을 검사하여 시행 착오에 의해 결정되어야 사이에서 변화 할 것이다. 의 NPC가 밀착되면 증식이 빠른 속도로있을 것이기 때문에, 그것은 세포 현탁액의 충분한 밀도를 제공하는 것이 중요하다. NPC가 성장하지 않는 경우에, 세포 밀도는 플라스크의 수를 감소시킴으로써 증가되어야한다. 우리는 최대 15 구절에 대한 neurosphere를 확장 할 수있게되었습니다. 인간의 NPC의 따라서 풍부한 공급 인간 태아 조직의 사용을 줄이고, 생성 될 수있다. NPC들과 신경 세포의 지속적인 공급의 경우, 이후 3 ~ 4 구절 처음을 확장하는 것이 바람직하고, NPC들 중 절반을 neurospheres로 확장 될 수 있으며, 나머지 절...

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토론

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우리는이 연구에서 자기 갱신 인간 neuroprogenitor 세포의 분화에 의해 신경 세포가 풍부한 세포 배양 모델과 레이저 캡처 미세 절제에 의해 신경 세포의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다. 우리는 NGF, BDNF, DBC와의 NPC의 신경 세포 분화 레티노 산의 조합을 사용했습니다. DBC는 CREB, 신경 (12)를 강화하는 전사 인자를 활성화하는 데 사용됩니다. 레티노 익산은 세포주기의 종료를 유도하고 아교 인구 (13)를 감소시킨다. 이 연구에서 설명하는 방법은 우리의 이전 보고서 14에 수정을 포함합니다. 우리는 이전에 단일 세포 현탁액을 neurospheres triturating 후 코팅 접시에 시딩하는 단계를 사용했다. 이 저밀도 (그림 2E)의 영역에서 비효율적 인 신경 세포의 분화로 이어질 수 있습니다. 우리는 지금 차이점이 사이의 연락처를 확인하기 위해 나흘 오래 된 작은 neurosphere를

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공개 사항

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선언에 관심 없음 충돌.

감사의 글

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이 작품은 (SP에) 재향 군인회에서 공로 검토 교부금 (NEUD-004-07F)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
신경전구세포(NPC) LonzaPT-2599
Neurocult NS-A 인간 기초 배지줄기세포 기술5750
Neurocult NS-A 증식 보충제줄기세포 기술5753
Neurocult NS-A 분화 보충제줄기세포 기술5754
B-27 보충제(50x) Invitrogen17504-044
인간 표피 성장 인자줄기 세포 기술2633
섬유 아세포 성장 인자 시그마F0291
뇌 유래 신경 영양 인자 세포 신호 전달3897S
신경 성장 인자 Invitrogen13257-019
디 부티 릴 고리 형 AMP시그마D-0627
poly-L-lysine SigmaP-5899
마우스 라미닌 SigmaL-2020
레티노산SigmaR-2625
STAT3 항체세포 신호9132
GFAP 항체세포 신호3670
GAP43 항체형질 도입 실험실612262
BDNF 항체MilliporeAB1534SP
Acetyl cholinesterase 항체 Santz cruzSc-11409
Synaptophysin 항체Abcamab18008-50
NeuN 항체ChemiconMAB377
Synapsin 항체NovusNB300-104
Anti mouse FITCJackson Immuno115-095-146
연구소
안티 토끼 Cy3잭슨 면역711-165-152
연구소
BSA시그마A1653
트리톤 -X 100아크로스21568-2500
파라 포름 알데hye 피셔4042
커버슬립 (빅 서클 커버 슬립)Fisherbrand12-545-102
마운팅 미디엄 (Prolong Gold)InvitrogenP36930
펜 멤브레인Applied biosystemsLCM0521
Histogene LCM 동결 절제 염색 키트Applied biosystemsKIT0401
RiboAmp RNA Amplification kitApplied biosystemsKIT0201
Picopure RNA 분리 키트Applied biosystemsKIT0202
CapsureMacro LCM capsApplied biosystemsLCM0211

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
  2. Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
  3. Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
  4. Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
  5. Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
  6. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  7. Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
  8. Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
  9. Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
  10. Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
  11. Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60(2011).
  12. Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
  13. Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
  14. Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
  15. Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).

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