Method Article

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

DOI:

10.3791/50529

⸱

August 15th, 2013

 , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이분자 형광 보완의 유세포 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법을 제공합니다. 이 방법은 매핑 단백질 결합 부위와 단백질 - 단백질 상호 작용을 조절하는 요인을 선별 적용 할 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 내부의 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 방법 중, 이분자 형광 보완 (BiFC)은 비교적 간단하고 민감합니다. BiFC는 형광 단백질의 두 가지 비 형광 조각을 (금성, 노란색 형광 단백질의 변형은, 여기에 사용되는)를 사용하여 형광의 생산을 기반으로합니다. 비 형광 비너스 조각은 (VN 및 VC) 때문에 VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 상호 작용과 기능 형광 단백질의 형성에 형광 항복, 두 개의 상호 작용하는 단백질 (이 경우, AKAP-LBC 및 PDE4D3)에 융합 세포 내부.

BiFC 단백질 복합체의 세포 내 형광 강도에 따라 단백질 상호 작용의 강도에 대한 정보를 제공합니다. 그러나 단백질 - 단백질 상호 작용의 강도를 정량화하기 위해 현미경을 사용하여 BiFC 분석은 시간과 단백질 발현 및 상호 작용의 이질성으로 인해 다소 주관적이다. 유세포 흐름을 결합하여BiFC 방법론과 분석은 형광 BiFC 단백질 - 단백질 상호 작용 신호는 정확하게 짧은 시간에 세포의 대량을 위해 측정 할 수 있습니다. 여기, 우리는 AKAP-LBC와의 상호 작용에 필요한 PDE4D3의 영역을 매핑하기 위해이 방법의 응용 프로그램을 보여줍니다. 이러한 높은 처리량 방법은 단백질 - 단백질 상호 작용을 조절 심사 요소에 적용 할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

650,000 단백질 - 단백질 상호 작용은 정상 세포의 기능 1,2을 유지하는 중요한 역할을 놀고, 인간 interactome에 존재하는 것으로 추정된다. 공동 immunoprecipitation의 외에 (CO-IP), 금 표준 (PCA) 세포 안쪽으로 단백질 - 단백질 상호 작용 검출의 감도를 개선하기 위해 개발되었습니다, 세포 파쇄물에서 여러 단백질 조각 보완 분석 실험 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구한다. 기술은 포스터 공명 에너지 전달 (FRET), 생물 발광 공명 에너지 전달 (브렛) 및 이분자 형광 보완 (BiFC) 4,5 (가) 있습니다. 각각의 잠재적 인 상호 작용 단백질 파트너 (이 예에서 우리는 AKAP-LBC 및 PDE4D3 사용)에 융합되어, BiFC는 형광 단백질의 두 조각 (YFP 변형 여기에서 우리는 비너스를 사용한다)의 촉진 협회를 기반으로합니다. F로 시각화 할 수 있습니다 기능 형광 세포 결과 안에 관심의 두 단백질의 상호 작용라이브 또는 고정 세포 6,7,8 중 하나를 사용하여 luorescence 현미경. 다른 PCA는 비교 BiFC는 살아있는 세포에서 세포 지방화를 공부하는 잠재력에 민감하고 덜 기술적 도전이다. 이 기술의 주요 단점은 있지만 한 번 형성된 형광 단백질 복합체가 반전 될 수 있다는 것입니다. 따라서 동적 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 좋은 방법은 아닙니다. 본 논문에서, 우리는 금성의 형광 강도를 모니터링하여 AKAP-LBC와 PDE4D3의 상호 작용 사이트를 매핑하는 BiFC 사용합니다. (자동 높은 처리량 기계를 사용하여 수행되지 않은 경우) 시간과 노동 집약적 형광 현미경을 사용하여 기존 분석에 비해 유동 세포 계측법은 짧은 시간 9을 통해 이기종 인구 세포의 수천의 간단한 정량 분석을 제공합니다 10. 여기 유세포-BiFC 분석 및 공동 IP 전통의 나란히 비교를 실시함으로써, 우리는 보여 그 이methods는 비교 데이터를 제공하지만, 유세포 BiFC 분석은 시간을 덜 소모하고 그 세포가 제한 될 때 더 유용 할 수 있습니다 적은 재료를 사용하고 있습니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 세포 형질

  1. 형질 전에 플레이트 세포는 하루 면역에 대한 적은 세포를 도금.
    1. 면역 경우 : 6 잘 플레이트, 코팅 유리 커버 전표에서 (1도 기준) 적어도 4 시간 동안 37 ° C에서 0.02 % 젤라틴으로, 중간에 한 번 씻고, 각 웰에 대한 접시, 1 × 10 5 HEK 293T 2 ㎖ 완전한 성장 배지에서 세포 [Dulbecco의 수정 이글의 미디어 (DMEM)에 10 % FBS].
    2. 유세포 및 서양 얼룩 분석을위한 : 판 1.2 5 HEK 293T 세포 / 잘 6 잘 플레이트 (24 - 웰 플레이트에 잘 당 0.5 ML 전체 성장 매체에서 0.3 X 10 5 HEK 293T 세포에 2 ㎖ 전체 성장 매체에서 x 10 ).
  2. 제조의 프로토콜에 따라 형질에 대한 DNA를 준비 Effectene는 (Qiagen의) 면역에 사용됩니다. 대중 교통 LT1 (마이 러스)는 유세포과 서양 얼룩 분석에 사용됩니다. 사용되는 DNA의 양이 아래에 나열되어 있습니다.
    24 - 웰 플레이트 (NG) 6 잘 플레이트 (NG)
    CFP - 벡터 10 50
    VN N-AKAP-LBC 200 1000
    VC N-PDE4D3-FL (전체 길이 PDE4D3) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 100
    VC N-PDE4D3-UCR1 (UCR1 도메인을 포함하는 PDE4D3 N-말단 단편) 100
    VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (UCR2 및 촉매 도메인을 포함하는 PDE4D3 C-말단 단편) 100
    형질 Effectene (6 자)를 사용하여 :
    1. 상온에서 5 분 동안 표시된 플라스미드 DNA의 양을 + 4 μL 향상제 100 μL 버퍼 EC로, 혼합 및 부화를 추가합니다.
    2. 10 분 동안 5 μL Effectene, 혼합과 부화를 추가실내 온도. 추가 셀에 드롭 현명.
    : 대중 교통 LT1 (6-well/24-well)를 사용하여 형질 전환
    1. 멸균 튜브 옵티-MEM I 혈청이없는 배지 250 μl/50 μL에 플라스미드 DNA의 지정된 금액을 추가합니다.
    2. 희석 된 DNA 혼합물에 대중 교통 LT1 시약을 추가하고 섞어 부드럽게 피펫. (대중 교통 LT1 시약 : DNA 비율은 DNA 1 μg 당 대중 교통 LT1 시약 3 μL)입니다.
    3. 실온에서 30 분 동안 배양 및 세포 드롭 현명한 추가 할 수 있습니다.

2. 유동 세포 계측법, 서쪽 오점, 그리고 면역 형광에 대한 세포의 준비

  1. 24 시간 게시물 형질 세포를 수확하기 전에 epifluorescence에 현미경으로 형광을 확인합니다.
  2. 유세포 분석을위한 세포의 준비 :
    1. 24-well/6-well 플레이트 0.5 ML / 2 ML 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 씻으십시오.
    2. 50 μl/250 μL 0.05 % 트립신을 사용하여 세포를 분리합니다.
    3. 200 μL / 1 ML DMEM 매체와 트립신을 중화.
    4. 공동5 분 500 XG에서 원심 분리하여 llect 250 μl의 세포 (모두 24 잘 6 잘 플레이트), 웨스턴 블롯 분석을위한 나머지 셀 (1 ML)을 사용합니다.
    5. 250 μL FACS 버퍼에 세포를 resuspend을 [PBS + 0.5 % (W / V) BSA + 2 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)] 유세포 분석을위한 얼음, 저장. 유동 세포 계측법 분석을 즉시하지 않을 경우 전지도 (PBS)에 1 % 파라 포름 알데히드에 고정 할 수 있습니다.
  3. 서양 얼룩 분석을위한 세포의 준비 : 유동 세포 계측법 분석을위한 세포의 준비와 병행 실시했다.
    1. 2 ML 얼음처럼 차가운 PBS와 1X 세포를 씻으, 세포 용해 버퍼 100 μL [10 MM 나트륨 인산염 완충액, pH가 6.95, 150 mM의 NaCl을 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5 mM의 EGTA, 1 % 트리톤 X-100]을 추가하여 세포를 용해 .
    2. 4에서 21,000 XG에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포 파쇄물을 수집 ° C.
    3. , 브래드 포드 단백질 분석에 의해 단백질 농도를 정량화 SDS-PAGE 레인 당 단백질의 동등한 양을로드하고 immunoblotting을위한 니트로 셀룰로오스로 전송할 수 있습니다.
  4. 면역에 대한 세포의 준비.
    1. 2 ML PBS로 3 배 세포를 씻어 상온에서 10 분 동안 3.7 % 파라 포름 알데히드 (PBS)에 1 ㎖의 세포를 수정 후, 5 분 동안 2 ML PBS로 3 배 씻는다.
    2. 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 슬립 커버 장착합니다. 필요한 경우 매니큐어를 사용하여 coverslip에 가장자리를 밀봉.
    3. 시험에 ° C 이전 4시에 슬라이드를 저장합니다.

3. 유동 세포 계측법 및 면역 형광 현미경

  1. 유동 세포 계측법은 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 시안 488 nm의 장착 ADP, 405 nm의 및 642 nm의 고체 레이저를 사용하여 수행됩니다. 정상 회담 소프트웨어는 수집 및 분석에 사용됩니다.
    1. 표준 구슬을 사용하여 흐름 cytometer에를 보정합니다.
    2. 게이트 라이브 셀 인구 리니어 스케일에 플롯 앞으로 분산 형 (FSC) / 옆으로 분산 (SSC).
    3. 게이트 집계되지 않은 살아있는 세포 인구 플롯 전압 / FSC 펄스 폭.
    4. 플롯 count/FL6 (CFP fluorescenc게이팅 비 집계 라이브 CFP-양성 세포에 대한 로그 스케일 E, 405 NM).
    5. BiFC 강도에 대한 로그 스케일로 플롯 count/FL1 (YFP 형광, 488 nm의).
    6. FSC, SSC, FL1과 FL6 사진 배율 튜브 (PMT) 각 신호에 대한 임계 값을 설정하는 전압을 조정, YFP - CFP 더블 부정적인 샘플을 실행합니다.
    7. 실행 (두 YFP +와 CFP +)에 대한 샘플 향후 오프라인 보상을 양성 하나
    8. 분석을위한 최소 10,000 게이트 이벤트 (비 집계 라이브 CFP + 세포) 취득.
  2. . 면역 형광 현미경 자이스 혈구 LSM 510 공 촛점 현미경 참고를 사용하여 수행됩니다 : 그것은 모든 설정을 사이에 일관성 (예 : 줌, 핀홀, 검출기 이득 증폭기 오프셋, 프레임 크기, 스캔 속도, 스캔 평균 및 레이저 파워)를 유지하는 것이 중요합니다 모든 데이터의 적절한 비교를위한 샘플입니다.

4. 데이터 분석 (정상 소프트웨어를 사용하여 수행)

  1. acquisit에 대한 것과 비슷한 분석 프로토콜을 설정적절한 게이팅 이온 :
    살아있는 세포에 대한 FSC / SSC 도트 플롯 문 1.
    집계되지 않은 살아있는 세포에 대한 게이트 1 FSC / 펄스 폭 문 2.
    비 집계 CFP + 라이브 세포 게이트 3 수 / CFP의 문 3.
  2. YFP와 YFP +와 CFP + 싱글 양성 세포를 사용하여 CFP 신호를 보상한다.
  3. CFP / YFP 양성 세포를 다시 확인 커트 오프 라인.
  4. 수출 YFP는 CFP의 형광 강도 (MFI) + 데이터 플롯 Excel로 세포를 의미한다.
  5. AKAP-LBC, PDE4D3의 발현에 YFP MFI을 정상화하고, 서양 얼룩에 의해 결정, α-tubulin에 컨트롤을로드.

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Results

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AKAP-LBC 및 PDE4D3 구조 (그림 1B)는 각각 VN 및 VC 조각에 융합되었다. AKAP-LBC 및 기능 YFP 형광 (그림 1A)의 PDE4D3 결과의 상호 작용. 여기에서 우리는 PDE4D3의지도 AKAP-LBC-결합 부위에 BiFC 메서드를 사용합니다. 상류 보전 지역 1 (UCR1), 상류 보전 지역이 (UCR2)와 촉매 영역 (CAT) PDE4D3의 바인딩 사이트를 선별​​ 사용 하였다 따라서 전체 길이 (FL), UCR1 및 UCR2 플러스 CAT, PDE4 가족 단백질 사이에 보존됩니다 AKAP-LBC합니다. 다른 강도 (그림 1C)와 함께 VN-AKAP-LBC 및 형광 HEK 293T 세포 결과에 VC-PDE4D3 - 단편 식입니다. BiFC는 UCR1과 UCR2 모두 + CAT AKAP-LBC와 PDE4D3의 상호 작용에 기여하는 것을 나타냅니다. AKAP-LBC-UCR1 상호 작용으로 인한 큰 형광 강도는 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BiFC 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 간단하고 민감한 방법입니다. 이 방법은 새로운 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별하는 데 사용할 수 없습니다, 그러나, 그것은 세포 내부의 단백질 - 단백질 상호 작용을 확인하고 기능적 특성을 연구하는 것이 특히 편리하다; 같은 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트의 매핑 단백질 복합체의 세포 내, 등, 그리고 단백질 - 단백질 상호 작용을 조절 수있는 작은 분자 / 펩타이드의 선별합니다. VN 및 VC 조각이 아닌 형광 때문에, 배경 형광 따라서이 분석의 감도를 돕고, 낮은 것입니다. 시간이 VN-단백질 VC-단백질 상호 작용을 성숙 / 안정하는 데 필요한, ​​따라서 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화하는 지연이, 최적의 시간 점 따라서 경험적으로 결정해야 할 수도 있습니다. 그것은 VN-단백질 VC-단백질 상호 작용은 되돌릴 수 없습니다 것 또한 주목해야한다, 그러므로 유감스럽게도 현재의 금성 BiFC으로이 분석은 t 적합하지 않습니다 생성단백질 - 단백질 상호 작용의 오 ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 중요한 실험 평가와 토론을 UIC에서 오브라이언 실험실 감사합니다. 임상 및 번역 과학 그랜트 UL1TR000050에 대한 UIC 센터 -이 작품은 번역 과학의 발전에 대한 GKC 및 국립 센터 미국 심장 협회 부여 11SDG5230003에 의해 지원되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Dulbecco’ s 수정된 독수리’ s media (DMEM)Invitrogen11965-092
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100xInvitrogen15070-063
Fetal Bovine Serum (FBS)Invitrogen16000-044
Anti-Flag 항체SigmaM2, F1804
Anti-HA 항체Covance16B12, MMS-101R
α-tubulinSigmaDM1A, T9026
Anti-GFP 항체Clontech632569
세포 배양 플레이트, 6-웰 조직 배양 처리된Thermo Fisher Scientific130184
HEK 293T 세포ATCCCRL-11268
Maxiprep 플라스미드 정제 키트, 고속Qiagen12663
Dulbecco’ s 인산염 완충 식염수(DPBS), 멸균 1xInvitrogen14190-144
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v)Gibco25300
폴리스티렌 원형 바닥 튜브FACS 염색 BD Biosciences352052
파라포름알데히드Fisher ScientificS74337MF
InvitrogenP-36931로 금 퇴색 방지 시약 연장
Superfrost plus 현미경 슬라이드Fisher Scientific12-550-15
Fisherfinest 프리미엄 커버 유리Fisher Scientific12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 에어 재킷 인큐베이터NuAIR DH 자동 흐름
컨포칼 현미경 LSM510 METACarl Zeiss, Inc
전기영동 및 전송 장치Biorad
Cyan ADP 유세포 분석기Beckman Coulter
DAPI

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
  4. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
  5. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
  6. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  7. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
  8. Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643(2011).
  9. Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
  10. Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429(2010).
  11. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11(2008).
  12. Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
  13. Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).

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