방법 논문

종양 표적의 측정 성장과 유전자 발현 역학 S. 티피 뮤 리움 박테리아

DOI:

10.3791/50540

⸱

2013년 7월 6일

 ,  ,  , 
1Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego , 3Biocircuits Institute, University of California, San Diego , 4Molecular Biology Section, Division of Biological Science, University of California, San Diego , 5Broad Institute of Harvard and MIT, 6Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 7Electrical Engineering and Computer Science and David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 8Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 실험의 목적은 감쇠의 성장과 유전자 발현 역학 양적 시간 코스 데이터를 생성하는 것입니다 S. 티피 뮤 리움 세균성 식민지. 이 비디오는 종양 세포의 준비와 주입, 박테리아 준비 및 사출, 전체 - 동물 발광 이미징, 종양 절제 및 세균성 식민지 계산을 다룹니다.

초록

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이 실험의 목적은 감쇠 S.의 성장과 유전자 발현 역학 양적 시간 코스 데이터를 생성하는 것입니다 종양 내부 성장 티피 뮤 리움 박테리아 식민지.

우리는 인간의 난소 암 세포주의 피하 주사, OVCAR-8 (NCI DCTD 종양 저장소 프레 더릭, 메릴랜드).에 의해 생쥐 모델 이종 이식 종양을 생성

우리는 S.의 감쇠 균주를 형질 전환 시각화 2 플라스미드 구조적 표현 루시 페라 제 (luxCDABE)와 함께 : 티피 뮤 리움 균 (SL1344 phoPQ-1 ELH430). 마우스 1 본질적으로 비 독성을 유지하면서 이러한 긴장은 특히 종양을 식민지.

측정 종양이 설립되었다되면, 박테리아는 용량을 변화와 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사 하였다. 종양의 지역화, 박테리아 유전자 발현을 사용하여 60시간의 과정을 통해 실시간으로 측정 하였다생체 내 이미징 시스템 (IVIS)합니다. 각 시점에서, 종양은 균질화, 절제, 유전자 발현 데이터와 상관 관계 세균성 식민지를 정량을 도금했다.

함께,이 데이터는 종양 안에 성장 박테리아의 생체 성장과 유전자 발현 역학의 정량적 측정을 얻을 수 있습니다.

서론

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합성 생물학은 지난 십 년간 급속하게 진행되고 지금은 에너지와 건강에 중요한 문제에 영향을 배치됩니다. 그러나, 임상 분야 ​​진출은 안전 문제 및 생체 내 유전자 회로의 설계 기준을 개발 부재로 둔화되었다. 높은 충격 의료 애플리케이션을 가속화하여 의료 인프라, 제어 실험실 설정 이외의 기능 유전자 회로, 안전하고 임상 승인 미생물 호스트와 직접 인터페이스 방법을 활용해야합니다.

균주의 수는 종양에서 우선적으로 성장 할 수있는 능력으로 인해 암 치료에 조사되었다. 이들은 C.을 포함 novyi, E. 대장균, V. cholorae, B. longum의, 그리고 S. 티피 뮤 리움 3-8. S. 그들은 9-12 인간의 임상 실험의 숫자에 안전성과 내성을 전시 것처럼 티피 뮤 리움 특히 관심을 생성했습니다. 이 bacteri 처음에 숙주 면역 체계의 자극을 통해 암 세포의 신진 대사에 필요한 영양소의 결핍에 의한 항 종양 효과를 만들 보였다. 치료화물의 생산은 이후 유전자 변형을 통해 추가되었습니다. 이 연구는 종양 치료를위한 박테리아의 사용에 중요한 진보를 대표하는 동안, 기존의 노력의 대부분은 일반적으로 높은 복용량, 오프 대상 효과 및 호스트 저항 13-16 개발의 배달 결과 높은 수준의 표현에 의존 .

이제, 합성 생물학 고급 감지 및 배달 17-20을 수행 할 수 계산 설계 유전자 회로를 이용하여 프로그래밍화물의 생산을 추가 할 수 있습니다. 이 회로는 종양 특정 자극하고 필요한 자기 조절화물의 생산을 감지 배달 시스템으로 작동하도록 설계 할 수 있습니다. 그러나 생체 내에서 이러한 회로의 기능을 공부하는 것은 지금까지 도전하고있다.

플라스미드 합성 회로를위한 공통 프레임 워크입니다 ve_content "> 때문에, 우리는 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 플라스미드 기반의 유전자 발현의 역학을 특성화하는 방법을 설명합니다.이 방법은 시간 경과 발광 이미징 및 생체 분포의 정량적 측정을 사용합니다. 함께, 이러한 접근은 임상 응용을위한 생체 내에서 플라스미드 기반의 네트워크를 공부하기위한 프레임 워크를 제공합니다.

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프로토콜

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1. 세포의 준비

  1. 표준 세포 배양 기술을 사용하여 통과 세포주. 이 실험에서, 우리는 OVCAR-8 세포 (NCI DCTD 종양 저장소 프레 더릭, 메릴랜드)를 사용. - 100 % 80 자랄 대상으로 세포를 성장.
  2. 5 분 5 ML 트립신으로 세포를 배양 한 후 + FBS는 트립신을 비활성화하는 5 ML RPMI 매체를 추가합니다.
  3. 혈구에 수확 수를 셀. 5 × 10 7 세포 / ㎖, 또는 플라스크 당 200 μL의 목표 농도에서 페놀 레드없는 DMEM에 resuspend을.
  4. 15 % 감소 성장 인자 마트 리젤 (BD Biosciences의)를 추가 주입까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.

2. 종양 이식

  1. isoflurane을 3 %를 사용 사주 오래 된 여성 NCR / 뉴 쥐를 마취 깊은 마취를 보장하기 위해 약 5 분을 기다립니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
  2. 1 ML의 주사기에 세포 (종양 당 100 μL)을로드하고 27 연결 1/ 2 게이지 바늘.
  3. 두 양측 후방 측면 주사 부위의 각각에 대해 텐트를하고 기지에 세포를 주입하는 집게로 부드럽게 피부를 들어 올립니다. 혈액을 생산, 너무 깊이 침투하지 않도록주의하십시오. 가볍게 튀어없이 주사기를 제거하는 핀셋을 사용합니다.
  4. 2 종양의 직경까지 - 20 일 - 4mm에 도달 할 때 10 일간 종양의 성장을 모니터링 할 수 있습니다.

3. 박테리아 준비

  1. -80 C 냉동고 주식 또는 냉장 판에서 3 ML LB 미디어 + 암피실린 박테리아의 하룻밤 문화를 시작합니다. 이 실험에서, 우리는 S를 사용 티피 뮤 리움 균주 ELH430 (SL1344 PhoPQ - 로랑 -).
  2. 아침에 필터링 LB에 문화 1:100 희석 OD600 0.4로 증가 - 0.6.
  3. 스핀 다운 및 인산염에 3 회 세척 식염수 (PBS)는 버퍼와 0.1의 최종 OD600 (1 X 10 7 세포 / ML 약)에 resuspend을.

4. 박테리아 주입

  1. 동물을 마취꼬리가 지배적 인 손을 향해 가리키는 측면에서 D 위치. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
  2. 따뜻한 물이나 가열 램프를 사용하여 꼬리 정맥을 팽창.
  3. 1 ML의 주사기에서 박테리아 (마우스 당 100 μL)을로드하고 90도 이상 그냥 작은 팁을 구부립니다.
  4. 꼬리 정맥에 주사기 끝을 맞추고 얕은 깊이 (아무런 저항을 느끼지한다)에 침투하고, 박테리아를 주입. 성공적으로 주입 혈류 변위를 관찰합니다.

5. 마우스 이미지

  1. 유도 챔버에있는 동물을 마취 후 이미징 플랫폼에서 각 마우스를 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. 시점 사이의 정량적 인 결과를 보장하기 위해 정확한 위치를 유지합니다.
  2. IVIS 스펙트럼 이미징 시스템 (캘리퍼스 생명 과학)를 사용하여 이미지 동물. 그들 사이 영상 1 개 이상의 동물, 장소 라이트 배리어 간 ILLU을 방지하는 경우mination. 동물은 박테리아의 현지화를 확인하기 위해 복부 측면에 먼저 몇 군데해야합니다.
  3. 이미지 동물 dorsally 실험 (36 시간) 동안 IVIS마다 2 시간 사용. 특정 ROI에 대한 시간 경과를 생성합니다.

6. 세균 생체 분포를 정량화

  1. 흡수성 기저귀의 뒷면에 CO 2와 장소를 사용하여 동물을 안락사.
  2. 두 개의 뒷다리 측면 피하 종양을 노출하는 동물을 켭니다. 종양을 분리하고 제거하는 주변의 피부 조직을 잘라. 핀셋으로 종양을 잡고, 역 가위의 움직임을 사용하여 피부를 제거합니다. 피부의 대부분이 분리되었을 때, 완전히 핀셋을 사용하여 종양을 제거합니다.
  3. 미리 무게의 microcentrifuge 튜브에 기관을 배치합니다. 이 튜브의 질량이 크게 달라질 수 있기 때문에 정량적 인 결과를 미리 무게를하는 것이 중요합니다.

7. 세균 생체 분포를 정량화

  1. 각 시점, 소비세에 대한 그리고 종양의 무게.
  2. 500 μL PBS + 15 % 글리세롤을 추가하고 조직 Tearor (BioSpec)를 사용하여 균질화. 샘플 간의 에탄올로 균질화 3 번 씻어.
  3. 직렬 희석 및 세균성 식민지 계산을위한 격판 덮개를 생성합니다. 하나의 플레이트 사용 전 단면 플레이트에 플레이트 여러 희석한다.

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결과

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이 프로토콜을 사용하여, 우리는 종양 표적 박테리아의 생체 성장과 유전자 발현 역학에 데이터를 생성 할 수 있습니다. 전체적인 흐름은 그림 1에 요약되어 있습니다.

첫 번째 단계에서, 우리는 발광 (블루) 기자 등으로 유전자 발현을 측정하는 IVIS를 사용하여 동물을 박테리아를 주입 (녹색) 및 이미지.

그런 다음, 두 번째 단계에서, 우리 소비세는, 균질화, 그리고 식민지 카운트에 대한 플레이트 종양은 종양의 성장 박테리아의 수를 결정합니다.

균주에 의해 생성 된 생물 발광은 시각화하여 IVIS (그림 2)입니다. 5 × 10 5 정도의 최소 정착 용량 (그림 2A)를 주입 용량과 신호 증가. 모든 경우에, 감쇠 박테리아는 어느 특...

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토론

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이 절차를 사용하여, 우리는 종양을 식민지화 박테리아의 성장과 유전자 발현 역학 시간 코스를 생성 할 수 있습니다. 이러한 측정은 정기적으로 일괄 문화 나 마이크로 유체 장치에서 체외에서 수행하는 동안, 그들은 생체 내에서 수행하기가 훨씬 더 어렵습니다.

이러한 메서드에 적용 할 수있는 몇 가지 수정이 있습니다. 우리는 우리의 마우스 모델을 생성하는 OVCAR-8 세포주를 사용하면서, 다른 세포 라인의 수는 동등하게 사용할 수 있습니다. 예를 들어, luciferized 세포 라인은 종양 및 세균 루시퍼 채널 3D colocalization을 위해 허용하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 양자 뒷다리 측면 모델, 다른 번호와 주사 부위의 위치를​​ 사용하는 동안 또한, 서로 다른 현상을 연구하는 모델을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 종양의 크기가 중요한 변수이며, 세포의 시리얼 희석을 준비 할 수 있으며, 스말를 생성, 동시에 ...

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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우리는 원고의 중요한 읽기 및 편집 H. 플레밍 감사합니다. 이 작품은 Misrock 박사 학위 취득 후 친교 (TD) 및 NDSEG 졸업 교제 (AP)에 의해 지원되었다. SNB는 HHMI 탐정이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1ml 주사기BD Biosciences309602
3/10cc 인슐린 주사기BD Biosciences309301
PrecisionGlide Needle BD Biosciences301629
RPMI Medium 1640 (1X), 액체, L-글루타민Invitrogen11875-119
암피실린포함 Sigma AldrichA0166-5G
LB 한천 육수시그마 AldrichL2897
Luria-Bertani 육수BD Biosciences244610

참고문헌

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