Method Article

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

DOI:

10.3791/50541

⸱

August 15th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer and Inflammation Program, National Cancer Institute, 2Basic Science Program, SAIC-Frederick, Inc., 3Departments of Oncology and Radiation Medicine, Georgetown University Medical Center, 4Structural Biophysics Laboratory, National Cancer Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마이크로 thermophoresis (MST)은 널리 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 결합력 결정에 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 GFP 융합 단백질, 비 변성 조건에서 세포 용해 및 리간드의 농도를 변화의 존재 MST 신호의 검출 발현을 포함한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 상호 작용의 양적 특성은 특히 생명 과학, 신약 개발의 거의 모든 분야에서 필수적이다. K D 결정의 현재 사용 가능한 대부분의 방법은 시간과 비용이 많이 소모 될 수 있습니다 발생하는이자의 단백질을 정제에 대한 액세스를 필요로합니다. 우리는 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 마이크로 thermophoresis (MST)에 의한 결합력 결정을 허용하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 비 변성 조건에서 GFP 융합 단백질 및 세포 용해의 발현을 포함한다. STAT3-GFP의 방법의 응용 프로그램이 일시적 처음으로 다른 시퀀스 올리고 뉴클레오티드를 잘 공부 전사 인자의 유사성을 판별 할 수 HEK293 세포에서 발현. 프로토콜은 간단하고 작은 분자, 펩티드, DNA, RNA와 단백질의 상호 작용을 공부 응용 프로그램의 다양한있을 수 있습니다, 및 Proteins.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

분자간 상호 작용의 유사성의 양적 특성은 생물 의학 연구의 많은 분야에서 중요합니다. 결합 상수 (K D) 해리뿐만 아니라 신약 개발에 필수적인뿐만 아니라 모든 생물 시스템의 모든 바이너리 상호 작용의 특성에 중요한 매개 변수입니다. 이러한 면역 침전 효모 두 하이브리드 화면 등의 단백질 - 단백질 상호 작용의 검출에 사용되는 생화학 적 방법은 궁합이 특정 복잡한 생체 내에서 주어진 조건에 따라 존재 여부를 정의하는 동안 얼마나 긴밀한 이러한 상호 작용이있다 우리에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 약물 발견 과정에서 바인딩 분석 개발이 필요하고 자주 가장 시간이 많이 걸리는 단계 중 하나입니다. K D 결정의 가장 일반적으로 사용되는 방법은 형광 편광, 1 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술이 방사성 바인딩, 3 등온 적정 열량계, 4 equilibri을 포함음 투석 (ED), 5 한외 여과 (UF), 5 원심 (UC). 6 그들 모두는 표적 단백질을 정제 상당한 양을 필요로합니다. 마이크로 thermophoresis (MST)은 미세한 온도 변화에서 분자의 방향 움직임을 감지 급속히 발전 방법입니다....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 셀 해물의 준비

이 프로토콜은 모든 GFP 융합 단백질을 발현하는 세포 부착을위한 것입니다. 필요한 세포 수, 단백질 발현 수준에 따라 최저 많은 20의 x 10 6 세포 6 10에서 다를 수 있습니다. 예를 들어, HEK 세포에 과발현 GFP-STAT3의 해물는 1 ML의 용해 버퍼와 70 %에 가까운 자랄 때 10 ~ T75 플라스크에서 자란 세포를 처리하여 제조 하였다. 그러나이 해물는 MST의 실험 형광 최적의 수준을 제공하기 위해 150 배 희석했습니다. 세포 용해 프로토콜은 조사 대상의 속성과 단백질의 세포 내 국산화에 크게 의존한다. 세제를 사용하여 있기 때문에 단백질의 불안정성의 바람직하지 않은 경우, 초음파는 아래에 설명 된 최선의 선택이 될 수 있습니다. 다른 첨가물이 단백질 수정 반응을 방지하기 위해 용해 버퍼에 추가 할 수 있습니다 : EDTA는 인산화를 방지, 나트륨 바나 다트, 그래서 티로신 단백질 인산 가수 분해 효소를 억제DIUM 불화 빼앗아 / THR 인산의 억제제이다.

  1. 용해 버퍼를 준비합니다. 쉬운 추출 세포질 단백질에 대해 다음과 같은 구성은 잘 작동 : 25 MM 트리스 염산, 산도 8.0, 및 프로테아제 억제제 칵테일 2 개 mm AEBS....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

올리고 뉴클레오티드에 바인딩 비 인산화 STAT3 단백질의 유사성을 측정합니다.

STAT3-GFP를 발현 HEK293 세포는 DNA 결합 분석을위한 찬란 STAT3의 소스로 사용 하였다. 세포 용 해물은 RIPA 버퍼를 (20 × 10 6 세포 / ㎖)를 사용하여 제조 하였다. 결합 연구를 위해, 해물는 결합 반응 (20 NM)에서 형광 단백질의 최적 수준을 제공하기 위해 MST DNA-결합 버퍼 150X 희석 하였다. 비 형질 전환 HEK293 세포도 비 희석 해물에 비 검출 것으로 밝혀졌다 배경 형광을 평가하는 데 사용되었습니다. 그러나 배경 형광 다른 표현 시스템에서 더 중요 할 수 있으므로 모니터링 할 수 있습니다. 리간드없이 11 바인딩 혼합물 해물 샘플로 구성된 적정 시리즈가 준비되어있다. 각 샘플은 희석 세포 파쇄물의 15 μL 및 정광에 변화를 올리고 뉴클레오티드 솔루션 15 μl를 포함이온. 50 mM의 NaCl을;.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 발현 및 정제는, 그러나, 대부분의 현재 사용되는 방법으로 상호 작용 'K D의 결정에 필요한 노동력 및 비용 단계입니다. MST의 응용 프로그램은 크게 상호 작용의 정량적 특성을 단순화하고 가속화함으로써 단백질 정제를 방지 할 수 있습니다. 그런 막 단백질과 전사 인자로하기 어려운 표현하고 정화 단백질의 경우 특히 중요한 이점을 제공합니다.

MST의 주요 제한 사항 및 요구 사항은 녹색 형광 단백질과 융합으로 단백질을 표현하는 기능입니다. 그러나 GFP 융합 인간과 마우스 단백질의 대부분의 표현을위한 구조 상업적으로 사용할 수 있습니다. GFP 융합 단백질은 널리 인신 매매 및 분해 연구에 사용되며, 따라서 MST 연구와 조합 "이중 의무"를 제공 할 수 있습니다.

단백질 P의 필요성의 부족에 추가K D의 결정의 전통적인 방법에 비해 모든 시약 및 버퍼.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 이 책의 내용은 반드시 보건 복지부의 견해 나 정책을 반영하지 않으며, 상호, 상용 제품 또는 조직의 언급은 미국 정부의 보증을 의미하지는 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

에서 연방 기금, NCI와 도요 치료학 사이의 공동 연구 계약; OT에 미국 암 협회 기금 IRG 97-152-17이 작품은 부분적으로 NIH, 국립 암 연구소, 암 연구 센터의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다 계약 HHSN26120080001E에 따라 국립 암 연구소, NIH.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RIPA 버퍼Millipore20-188다른 제조업체의 버퍼도 작동합니다
프로테아제 억제제 칵테일Sigma-AldrichP2714
Monolith NT.115NanoTemper Technologies GmbHG008
Monolith NT.115 Capillary TrayNanoTemper Technologies GmbHT001
Monolith NT.115 Standard Treated CapillariesNanoTemper Technologies GmbHK002
NT 제어 소프트웨어NanoTemper Technologies GmbH2.0.2.29
NT 분석 소프트웨어NanoTemper Technologies GmbH1.4.27
탁상용 냉장 원심분리기Eppendorf5417R를 제공하는 기타 마이크로튜브 냉장 원심분리기
에펜도르프22431064
Protein LoBind Tube 0.5 ml

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microscale ThermophoresisBinding Affinity DeterminationProtein Purification free MethodGFP fused ProteinCell Lysate AnalysisLigand Dilution SeriesFluorescence MeasurementThermophoresis ExperimentSTAT3 GFP TransfectionOligonucleotide Binding Assay

Related Articles