우리는 해양 바다 토끼 신경계의 해부를 설명 군소 마취 후, 단기 - 조직 문화에 대한 신경과 패치 클램프 기법을 통해 단일 셀 이온 전류의 녹음 격리.
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이 논문에서
요약
초록
해양 복족류 연체 동물 군소 californica는 학습과 기억의 연구에서 특히 의미와 신경계 기능의 모델로 오래된 역사를 가지고 있습니다. 이러한 연구의 일반적인 준비는 감각과의 motoneurons은 최소한의 해부 동물에 그대로 유지 또는 개별 감각과의 motoneurons의 기술적 정교한 신경 세포 공동 배양되는 것입니다. 덜 일반적인 명목상 동종 신경의 작은 클러스터 단기 문화에 하나의 세포로 해리되는 격리 된 신경 세포의 준비입니다. 이러한 고립 된 세포 패치 클램프 기법, 이러한 컨덕턴스의 대상으로 변조를 사용하여 이온 전류의 생물 물리학 적 특성에 유용합니다. 이러한 문화를 준비하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 프로토콜은 흉막과 구강 신경절 쉽게 식별 글루타메이트 감각 뉴런을 활용하고, 그들의 분리와 최소한의 유지 보수를 설명 I혈청없이 며칠 동안 N 문화.
서론
해양 opistobranch 연체 동물, 군소은 수십 년 동안 유용하게 신경 생물학 모델이다. 그것은 가장 이니와 고전적 조건 7, 8의 모델로 알려져 있습니다. 이 모델의 학습과 기억에 대한 연구는 그가 Arvid Carlsson의 폴 Greengard 10과 공유 상에 에릭 칸델 Eric R. Kandel을 위해 2000 년에 생리학 또는 의학에 노벨상을 수상했다. 감소 준비에서 전기 녹음과 관련된 연구는, 어떤이 무척추 동물의 신경계의 요소는 신경과 동물에서 해부와 근육이 부착 군소의 개별 뉴런의 역할을 명료 도움이 떠났다. 군소 학습 구성 정확한 분자 메커니즘의 식별하지만, 종종 개별 기증자 동물의 하나 하나를 얻은 또 다른 기술, 장기 감각 신경 세포의 공동 문화와 motoneuron을 고용하고 배양 접시 21 시냅스를 형성 할 수 .
우리는 다른 사람 1, 3, 6, 14, 15, 16 신경이 명목상으로 균일 한 뉴런의 클러스터 해리 단기 문화를 만들기 위해 장기 실험에서뿐만 아니라 자신의 인내로이 모델에서 타겟팅 할 수 있습니다 발견되는 용이성을 악용 한 하는 우리는 패치 클램프 구성에서 전압 클램프에....
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프로토콜
1. 세포의 준비
- 1 일에, 무게와 동물을 마취.
- 30 G-1kg 동물의 무게. 등장 MgCl : 1시 1분 해수의 5-10 동물의 볼륨을 마취. 이러한 연결 airstone와 전기 수족관 공기 펌프로 통기와 함께 1 시간 동안 6H 2 0.
- 해부 용품을 준비합니다.
- 같은 패브릭 핀으로 스테인레스 스틸 직선 핀, 깨끗 해부 트레이를 조립합니다. + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S). 여러 배양 인공 해수를 포함하는 요리 (표 1 및 3 참조 ASW)을 조립
- 준비 저전력 현미경이있다. 깨끗한 절개 악기와 같은 늑골이있는 코와 미세 수술 집게로 준비하고, 정밀하고 큰 수술 가위있다. 사용하기 전에 70 % isopropol 알코올과 악기를 스프레이하고 건조 할 수 있습니다.
- 절개 트레이에 위치 동물입니다.
- 절개 트레이에 위치 동물의 복부 측면 아래로. 핀 동물신체 벽 parapodial 테두리 만 등의 표면을 노출, 꼬리와 머리를 방지하고 성기 홈의 가장자리를 통해
- 실행 속도가 느린 차가운 수돗물 등의 표면을 씻어. 성기 홈을 따라 ....
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결과
이 프로토콜에서 대상으로하는 신경에서 감각 신경의 위치는, BSC 및 PVC 뉴런은 그림 1에 표시됩니다. BSC의 뉴런은 구강 신경절, 그대로 신경절 (그림 1A)에서 구강 질량에서 멀리 얼굴 표면의 복부 측면에 2 대칭 타원형 클러스터에 있습니다. PVC 뉴런은 중앙 축 (그림 1B)쪽으로 흉막 신경의 등쪽 표면의 주위에 래핑하는 양측, V-모양의 클러스터를 형성합니다. 오른쪽 또는 왼쪽 클러스터 사건의 약 1 %에서 개별 동물에 누락되어 있지만, 이러한 감각 뉴런은 신경 내의 박힌 위치의 장점이 있습니다. BSC와 PVC 신경 세포 클러스터는 세포막의 다크 오렌지 색상과 그림 1A의 큰 원형 개요에 나와 근처의 세포에 비해 상대적으로 작은 크기로 식별됩니다.
문화, 이러한뉴런은 공정하지 않고 종종 도금 다음날 (그림 2A)이며,
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토론
분리 기술은 아교 및 기타 미확인 세포의 작은 숫자와 함께 산재 50-100 고립 된 뉴런을 포함하는 감각 신경 세포의 배양을 얻을 여기에 설명. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 신경 효소 용액에 남아있는 시간이며, 개별 세포로 클러스터를 분열하는 소화 세포 클러스터의 분리를 가볍게 치는. 효소 소화 (단계 1.8) 사용 가능 온도에서 최적화해야합니다. 23 천천히 흔들어 ° C, 13 시간은 BSC 클러스터 while15 시간은 PVC 클러스터에 대한 최적의 소화에 충분하다. 배양 접시에서 낮은 세포 수율은 효소 시간이 부족에 기인하거나, 하나의 셀 전송 단계 (1.11 1.12) 중 또는 플릭 단계 (1.13) 동안 너무 기계적 중단. 할 수 있습니다 문화 기판 아래로 붙어 세포의 실패뿐만 아니라, 문화의 짧은 생존은 일반적으로 너무 많은 기계적인 방해로 인해 발생합니다. 막 오염뚜가 발생할 수 있으며, 최고의 마취 동물이 잘 해부 계기가 깨끗한 지, 세척 및 관심 신경절은 ASW의 여러 린스 + P / S. 겪어야하는 것.......
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
NIH P40 OD010952, Korein 재단, SLC 마이애미 원정대의 대학과 공격력 MAYTAG 휄로우 십. 저자는 기꺼이 군소뿐만 아니라, 로렌 Simonitis과 그림에 대한 현미경을 제공 한나 펙을위한 국가 자원의 직원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 인공 해수 ASW | 시그마-알드리치 | 모듬 | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2(6H2O), 15 Hepes-NaOH, pH 7.6 |
| 세포 내 용액 | 시그마 | 모듬 | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA 및 40 Hepes-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 페니실린/스트렙토마이신이 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc | 17-603E | 5,000 단위/ml 페니실린 플러스 5,000 mg/ml 스트렙토마이신 |
| 중성 분포 II | Roche 진단 | 10165859001 | |
| 히알루로니다제 | 시그마-알드리치 | H4272 | |
| 콜라겐분해효소 XI형 | 시그마-알드리치 | C9407 | |
| L-글루타메이트 (L-Glu) | 시그마-알드리치 | 49601-100G | |
| D-아스파르테이트 (D-ASP) | 시그마-알드리치 | 11200-10G | |
| N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA) | 바이오몰 | 100002-268 | |
| L-ASP | 시그마 | A6683-25G | |
| 알파-아미노-3-하이드록실-5-메틸-4-이소옥사졸-프로피온 산 (AMPA) | Sigma | A6816-5MG& | nbsp; |
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| 세밀한 해부 핀 | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| 모세관 | Kimble 71900-100 | 분젠 버너 불꽃에서 불 연마 및 U자형으로 만들어졌으며 ECS | |
| 모델링 점토 | 공예품 상점에서 | ||
| 격리된 지상 욕조 | 맞춤형 | ||
| 제조 파스퇴르 피펫 | VWRSP | 14672-412 | |
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| 두꺼운 벽의 1.5 mm 직경 보로실리케이트 필라멘트 유리 | WPI | 1B150F-3 | |
| 고순도 질소 실린더 및 분기 레귤레이터 | |||
표 1-3. 시약, 재료 및 장비 목록. |
참고문헌
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R.
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재인쇄 및 허가
