멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법과 세포의 현지화 및 탄소 나노 튜브의 상대 정량

지난 수십 년 동안 나노 입자의 위치는 광범위한 응용 분야에서 중요해졌습니다. 특히, 탄소 나노튜브(CNT)는 다양한 진단 및 치료 응용을 위한 나노 도구로 점점 더 탐구되고 있습니다. CNT는 특정 전기적, 열적 및 분광 특성 덕분에 다양한 약물 또는 조영제의 전달 매개체 역할을 하거나 조직 공학¹에 관여할 수도 있습니다.

그러나, 그런 nanomaterials의 잠재적인 독성에 관하여 관심사는 유기체에 있는 CNTs의 운명이 아주 논란의 여지가 남아 있기 때문에 주로, 아직도 토론의 밑에 있습니다. 예를 들어, 라만 분광법, 광음향 및 근적외선 광발광 이미징과 같은 기술이 제안되었지만 각 방법은 나노튜브의 유형 및/또는 환경에 따라 한계를 보입니다^2-8.

여기서 제안된 방법은 세포 내 나노 입자의 검출 및 정량화에 적용할 수 있습니다. 이는 유세포 분석과 고해상도 이미징을 결합한 장치인 ImageStream을 사용하여 가능했습니다. 많은 세포를 획득할 수 있는 장점(최대 5000 events/sec)과 통계 데이터와 각 세포의 고해상도 이미지를 동시에 얻을 수 있는 이점(0.5μm 공간 해상도)을 결합합니다. 일반적으로 이미지는 CCD 카메라를 사용하여 수집되며 세포의 2차원 그레이 스케일 표현입니다. 빛은 이미지의 각 픽셀에 대해 정량화되고 형광 또는 세포 내 크기(예: BF)를 가진 구성 요소의 강도와 위치를 모두 식별하므로 세포의 모양에 따라 세포를 구별할 수 있는 강력한 기능을 제공합니다^9,10.

목표는 세포에서 CNT의 분포 및 거동을 정량적으로 평가할 수 있는 나노 계측 방법을 설계하는 것이었습니다. 특히, 이 방법은 세포에 의한 CNT의 세포 흡수, 처리 및 외세포작용(exocytosis)을 연구하기 위해 개발되었습니다. 우리는 첫째로 CNTs의 복잡한 세포질 수송을 입증하고 둘째로 세포 사이 이 nanomaterials의 이동을 입증했다: 세포 internalized CNTs는 압박을 받을 때 그들의 숙주 세포를 탈출하고, extracellular 공간에서 해외로 퍼지고 naive 세포에 의해, homotypic 또는 heterotypic¹¹

입니다.

이전 연구는 CNT 기능화 및 응집 상태¹²에 따라 능동 또는 수동적 인 세포 흡수의 다른 메커니즘이 발생할 수 있음을 보여주었습니다. 여기에서 다중벽 CNTs는 1,3-dipolar cycloaddition 및 amidation을 통해 기능화되고 그 후에 형광 프로브로 유도체화되었으며, 이소티오시아네이트(FITC)에 형광을 발했습니다. 투과 전자 현미경에서, 이들은 세포질 국소화를 통해 개별적으로 또는 다발로 세포에 의해 내재화되는 것으로 보이며, 대부분 엔도솜 및 리소좀 구획에서 발견됩니다¹¹. ImageStream에서 클러스터링된 CNT는 BF의 어두운 점과 DF의 밝은 점으로 높은 상관관계를 나타내므로 CNT 표지 세포와 대조 세포를 명확하게 구분할 수 있습니다. 다른 한편으로는, CNTs로 기능화된 형광 마커에 의해 방출되는 형광 신호의 분포는 잘 공동 국소화되지 않았다: 실제로, 아마도 담금질 현상으로 인해, 녹색 형광 반점이 BF 및 DF의 반점과 반드시 일치하지는 않는다. 이는 첫째, 형광 프로브가 ImageStream을 사용한 CNT 검출에 필수가 아니며, 둘째, 포르티오리(fortiori)가 CNT의 정량화 및 국소화 모두에 대해 완전히 대표되지 않음을 나타냅니다.

nanoparticles의 통계적인 관계되는 정량화를 주는 저쪽에, 이 방법은 또한 세포에 있는 CNTs의 국소화에 관하여 정보를 제공한다, 예를 들면, 세포의 내부에 CNTs 대 원형질막에 묶인 그들을 구별한ᄂ다는 것을 의미하는. 세포 이미지에서 CNT를 국소화하는 능력은 기존 유세포 분석 분석의 한계를 명확하게 극복합니다¹³. 이 절차는 세포의 특정 영역에 맞는 마스크를 만들고 로드된 CNT에 해당하는 어두운 반점도 선택함으로써 여기에서 개발되었습니다.

일반적으로 이 방법은 사용된 나노 입자가 빛을 강력하게 흡수(및/또는 산란)할 수 있는 조건의 세포에서 시각화 또는 정량화의 필요성과 관련된 광범위한 실험에 적용할 수 있습니다.

1. 수 분 산성 탄소 나노 튜브 (CNT)의 제조

1. 20 °C의 목욕물 초음파 발생기에서 20 분 동안 초음파 처리 하기 전에 세포 배양 용수에 첫 번째 CNT를 분산시킵니다. CNT가 형광 프로브로 기능화되는 경우 실험 전반에 걸쳐 빛으로부터 가능한 한 많이 보호하십시오.

2. CNT로 셀 라벨링

1. 예를 들어, 10%의 소 태아 혈청과 1%의 페니실린 스트렙토마이신을 함유한 DMEM 배지의 25cm² 플레이트에서 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 성장시킵니다.
2. 완전한 배지에서 0, 10, 20 및 50 μg/ml의 농도로 CNT 용액을 준비하고 37°C에서 20시간 또는 4°C에서 20시간(25cm² 플레이트의 경우 CNT 현탁액 2ml)으로 세포를 배양합니다.

3. 세포 고정

1. 그 후 배양 배지를 제거하고, PBS로 세포를 헹구고, 트립신화하고, 완전한 DMEM 배지에서 세포를 재현탁합니다. 1,200rpm에서 5분 동안 원심분리기.
2. 매체를 먼저 파라 포름 알데히드 4 %로 4 ° C에서 1 시간 동안 교체 한 다음 PBS로 교체하여 보존합니다. 필요한 경우, 세포분석 분석이 이루어질 때까지 며칠 동안 4°C에서 공정의 이 단계에서 세포를 보관할 수 있습니다.
3. 각 샘플에는 50μl의 PBS에 농축된 약 10개의⁶개의 세포가 포함되어야 합니다. 분석 중 응집체를 피하기 위해 올바르게 현탁하고 50μm 메쉬 염색기를 통해 필터링합니다.
   참고: 세포를 보존하기 위해 각 단계를 매우 조심스럽게 수행해야 합니다.

4. ImageStream 획득

멀티 스펙트럼 이미징 유세포 분석기 ImageStream을 사용하여 세포 이미지를 획득합니다.
몇 가지 사항을 존중해야 합니다.

1. 조정된 배율을 선택합니다(여기서는 40X 대물렌즈가 사용됨).
2. 형광 색소를 사용하는 경우 :
   - fluorochrome.
   없이 대조군 샘플을 준비합니다. -
   에 사용된 각 형광 색소에 대해 단색 positive control로 세포를 준비합니다. 샘플에 추가합니다.
3. 레이저 488 nm를 사용하여 FITC를 여기시키고 채널 02를 사용하여 형광 방출 (대역 통과 480-560 nm)을 수집합니다. 또한 명시야(BF)와 암시야(DF)에 대해 각각 채널 01 및 06을 사용하십시오.

5. 후처리 - IDEAS 분석 소프트웨어(버전 4.0)

1. 획득된 모든 이벤트 중에서 분석은 먼저 단일 세포 모집단으로 제한되어야 합니다: '종횡비'(즉, 너비/높이) 대 '세포 면적'(BF의 세포에 적용된 매개변수)을 나타내는 이중 파라메트릭 점도표를 사용합니다(그림 1). 표준 면적과 종횡비가 1에 가까운 관심 영역에 포함된 단일 세포는 다세포 이벤트(큰 면적 및 작은 종횡비) 및 파편(매우 작은 면적)과 구별됩니다.
2. 초점이 맞춰진 평면에서 세포를 선택하려면, 고대비(highly contrasted) CNT 표지 세포에 적합한 쌍파라메트릭 도트 플롯(biparametric dot plot)을 사용하십시오: BF 이미지에서 'contrast' 대 'RMS gradient'(이미지의 선명도 품질 측정)를 플로팅합니다 - 이를 통해 BF 이미지에서 낮은 rms gradient와 low contrast를 모두 보여주는 초점이 맞지 않는 세포를 제외할 수 있습니다(그림 1).
3. 1. "find the best feature(최상의 기능 찾기)"를 사용하여 레이블이 지정된 셀과 레이블이 지정되지 않은 셀 간에 최상의 통계적 분리를 제공하는 매개 변수를 결정합니다. 이 연구에서 평균 픽셀 개체 특징은 가장 적합한 매개변수입니다(그림 2).
   2. 이 파라미터를 사용하여 정규화된 주파수와 히스토그램을 추적하여 테스트된 농도에 대한 uptaken-CNT의 양을 비교합니다(그림 3).
   3. 이 두 매개변수 간의 상관 관계를 연구하기 위해 'BF의 평균 픽셀 개체'(표기법: Mean Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) 대 'DF의 강도'(Intensity_MC_Ch06)를 이중 파라메트릭 그래프로 추적합니다(그림 4).
4. 정량화는 또한 마스크를 통해 평가됩니다.
   1. CNTs는 BF에 강하게 흡수하는 어두운 반점으로 나타나기 때문에, 이 연구에서 0-533 (Mask 1, 표기법: Intensity(M01, BF, 0-533)) (그림 5)으로 구성된 낮은 강도의 제한된 범위의 픽셀을 선택하여 정확하게 맞는 임계값 마스크를 먼저 만듭니다. Threshold intensity의 선택은 control cells와 비교하여 labeled cells에서 이루어집니다.
   2. 반대로, DF(마스크 2, 표기: 강도 (M06, DF, 150-4095))의 고강도(이 경우 150-4095) 픽셀을 사용하여 마스크 피팅도 만듭니다(그림 6).
   3. 마스크의 면적(1 또는 2; (표기법 : 마스크 1의 경우 Area_Intensity (M01, BF, 0-533) ) : 서로 다른 농도에서 CNT의 내재화에 대한 상대적인 정량화를 제공합니다 (그림 7).
   4. 이 두 마스크 간의 상관 관계 정도를 확인합니다(이중 파라메트릭 플롯 '마스크 1 영역' 대 '마스크 2 영역' 덕분에).(그림 7).
5. 세포에서 CNT를 국소화하기 위해 다른 마스크를 만듭니다.
   1. 세포 내부에 맞는 마스크 : Erode (M01, 7) - 전체 세포 (M01)의 마스크 (M01)에 해당하며 (그림 8), 7 픽셀로 더 침식됩니다 (그림 9).
   2. 부울 방정식 M01 및 Erode(M01,7)이 아닌 M01 - 내부(Erode(M01,7))에서 뺀 전체 셀(M01)의 마스크(그림 10)을 사용하여 멤브레인에 맞는 마스크(그림 10).
   3. 멤브레인의 어두운 픽셀(CNT에 해당)을 고려하려면 Intensity(M01 및 Erode(M01, 7), BF, 0-533) 마스크를 만듭니다(그림 11).
   4. 세포 모음에 적용된 다양한 마스크를 시각화하여 레이블이 지정된 세포와 표시되지 않은 세포에 대한 관련성을 확인합니다(그림 12).
   5. 멤브레인의 검은색 픽셀인 'Area_Intensity(M01 and not Erode(M01, 7), BF, 0-533)'를 선택하여 마스크에 피처 영역을 적용합니다. 멤브레인에서 CNT를 정량화할 수 있습니다.
      
      최종적으로 내재화된 CNT와 멤브레인에만 흡착된 CNT를 구별하기 위해 멤브레인의 블랙 영역과 전체 세포의 블랙 영역을 플로팅합니다(즉, 'Area_ Intensity(M01 및 not Erode(M01, 7), BF, 0-533' 대 'Area_ Intensity(M01, BF, 0-533)').
      
      메모: FITC 형광 신호에도 동일한 유형의 절차가 적용됩니다: BF에서 FITC 형광 강도의 증가와 평균 픽셀 신호의 감소를 비교하거나, BF의 어두운 점과 FITC 형광 강도 간의 공동 국소화를 비교합니다. 우리의 경우, 형광 신호가 한편으로는 BF의 다크 스팟과 정확하게 일치하지 않고 다른 한편으로는 DF의 명시야와 정확하게 일치하지 않기 때문에 이러한 유형의 분석은 관련이 없으며, 이는 CNT의 고유 특성(광 흡광 및 산란)이 형광 프로브와 관련된 신호보다 더 적절하다는 것을 보여줍니다.
6. 하나의 실험 조건에서 모든 플롯이 생성되면 "통계 보고서 템플릿"을 만들고 템플릿을 .ast 파일로 저장하고 모든 데이터 파일을 일괄 처리합니다.

ImageStream 장치의 원리에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 명시야(BF), 암시야(DF 또는 측면 산란광) 및 형광 채널을 포함하여 유동하는 각 세포의 여러 고해상도 이미지를 생성하며, 그림 2에서 예시된 바와 같이 CNT로 표지된 3개의 다른 세포가 있습니다. 이러한 채널의 오버레이도 표시되며, 첫눈에 상관 관계를 보여줍니다.

모든 후처리 분석이 세포 이미징을 기반으로 한다는 점을 감안할 때 초점이 맞춰진 세포의 선택은 연구에 매우 중요합니다(그림 3). 실제로, CNTs의 존재는 표지되지 않은 세포와 비교된 대조 및 기온변화도 둘 다에 변화를 유도합니다: CNTs의 중요한 양을 internalized, 집중된 세포에는, 낮은 rms 기온변화도가 있는 경향이 있습니다 (보통 집중된 세포와 unfocused의 감별을 위해 이용된 유일한 모수인) 또한 중요한 대조에는, 왜 biparametric 줄거리가 근본적인지를 설명하. 그림 3에는 초점이 맞지 않은 셀(노란색 영역)과 초점이 맞춰진 셀(파란색 영역)의 차이가 표시되어 있습니다.

세포 내재화된 CNT는 특히 BF에서 강하게 흡수하는 다크 스팟으로 나타나는 경우 명확하게 구별할 수 있습니다(다양한 라벨링 농도의 효과 참조, 그림 4). 더욱이, BF에 대한 평균 픽셀 신호를 분석하여 흡수의 상대적 정량화를 제공했다: 그림 5의 그래프는 CNT-라벨링 농도에 따른 현저한 증가를 보여준다(실험 조건당 약 7,000개의 세포에 대한 결과).

둘째, CNT의 존재로 인한 반점에 해당하는 BF의 제한된 범위의 어두운 픽셀 또는 DF의 높은 강도의 픽셀에 적용되는 마스크의 사용을 통해 CNT의 정량화도 가능합니다(그림 6의 예 참조). 따라서 이러한 마스크의 영역을 플로팅하면 하이라이팅과 흡수 증가가 가능합니다(그림 7에서 BF의 마스크 영역과 함께 0-533 범위의 픽셀 선택).

또한, BF와 DF의 스폿 간의 상관관계는 BF 강도 대 BF 평균 픽셀 신호(그림 8 참조)(마스크 독립적 분석) 또는 BF의 마스크 면적(마스크 1) 대 DF 면적(마스크 2)을 플로팅하여 평가할 수 있습니다.

세포 내부의 CNTs 국소화를 위해 생성된 절차와 관련하여 그림 9A는 생성된 다양한 마스크를 표시합니다. 국소화 마스크(기본 세포 마스크의 침식에 기반)의 견고성은 라벨링된 세포와 라벨링되지 않은 세포의 집합체에서 시각적으로 확인해야 합니다. 모든 샘플에 동일한 마스크가 사용됩니다.

세포막의 검은 반점의 총 면적과 전체 세포의 전체 면적을 플로팅하면 4 °C에서 2 시간 배양과 비교하여 37 °C에서 20 시간 동안 배양 된 세포에 대한 내재화 점수를 제공합니다 (그림 9B 참조). 이는 CNT가 대부분 4 °C의 막에 위치한다는 것을 나타냅니다. 37 °C에서 CNT는 세포의 90 % 이상에서 내재화됩니다.

마지막으로 형광과 관련하여 이 매개변수는 형광 반점과 BF(및 DF)의 반점 사이의 상관관계가 너무 낮기 때문에 CNT의 정량화를 위한 지표로 사용되지 않았습니다. 실제로, FITC 강도와 명시야 평균 픽셀 간의 상관관계는 -0.2의 Pearson 상관 계수를 나타냅니다. 그림 10에는 형광 신호가 명시야 블랙 스팟과 적절하게 일치하거나 일치하지 않는 두 가지 사례가 나와 있습니다.

그림 1. ImageStream 개요 - 일반 작동.멀티 스펙트럼 이미징 시스템은 명시야, 암시야 및 형광의 세 가지 모드에서 셀당 최대 12개의 이미지를 획득합니다. 설정은 405, 488, 560 및 658nm를 포함한 5개의 여기 레이저로 구성됩니다. 빛은 다른 대물 렌즈(이 연구에서는 40X 대물 렌즈가 사용됨)를 사용하여 큐벳에 흐르는 세포에서 수집되어 angular array의 longpass filter 세트로 구성된 스펙트럼 분해 요소로 전달됩니다. 세포 이미지를 수집하는 CCD 카메라는 이미지 줄무늬를 방지하기 위해 시간 지연 통합(time-delay-integration)이라는 기술을 사용하여 작동됩니다. 확장된 피사계 심도(EDF)는 옵션입니다.

그림 2. 다양한 채널(명시야(BF), 암시야(DF), 형광(FITC) 및 오버레이)를 통해 ImageStream에서 캡처한 탄소 나노튜브(50μg/mL)로 라벨링된 세포의 이미지 갤러리. 세포 내 리소좀(intracellular lysosome) 내에 국한된 CNT는 명시야 이미지에서 큰 검은 점으로 나타납니다. 반대로, 그들은 어두운 영역과 형광 이미지에 밝은 점을 만듭니다.

그림 3. 초점이 맞춰진 셀 선택. BF 이미지에서 rms(Root Mean Square) 구배와 대비를 나타내는 이변량 점도표를 사용하면 초점이 맞지 않는 세포를 제외할 수 있습니다. 여기서 노란색 영역은 초점이 맞지 않은 셀을 나타내고 초점이 맞춰진 셀은 파란색으로 표시됩니다. 초점이 맞지 않는 세포는 명시야 이미지에서 낮은 contrast와 low gradient rms를 모두 특징으로 합니다. rms gradient 외에도 contrast feature는 CNT로 라벨링한 후 focused cell을 구별해야 합니다.

그림 4. ImageStream으로 시각화된 CNT의 용량 의존적 흡수. 명시야 이미지의 검은 반점의 수와 면적은 세포로 배양하는 동안 CNT의 용량에 따라 증가하고 있습니다(0-50μg/ml 범위). 대조군 셀에는 검은 점이 없습니다.

그림 5. 명시야 이미지를 기반으로 한 CNT 흡수의 상대적 정량화. 전체 세포를 특징으로 하는 마스크 "개체"에 적용된 평균 픽셀 특징의 히스토그램은 정량화에 사용할 수 있는 용량 의존적 거동을 명확하게 보여줍니다. R9 범위는 CNT 양성 세포를 둘러쌉니다.

그림 6. BF에서 블랙 스팟을 선택하고 DF 이미지에서 밝은 스팟을 선택하는 마스크 생성. CNT가 BF 이미지에서 강하게 흡수하는 다크 스팟으로 나타나기 때문에 본 연구에서는 0-533(마스크 1, 표기: Intensity(M01, BF, 0-533))으로 구성된 낮은 강도의 제한된 범위의 픽셀을 선택하기 위해 임계값 마스크를 생성합니다. 반대로, DF 이미지(마스크 2, 표기법: 강도(M06, DF, 150-4095))의 고휘도 픽셀(이 경우 150-4095)이 있는 마스크 피팅을 사용하여 높은 산란 영역에 해당하는 DF의 밝은 지점을 선택합니다.

그림 7. CNT의 용량 의존적 흡수는 BF 이미지에서 블랙 스팟 영역의 정량화에 의해 입증됩니다. BF에 적용된 임계값 마스크(마스크 1)를 사용하여 각 세포에 대한 블랙 스팟의 면적을 정량화하여 용량 의존적 분포를 보여줄 수 있습니다.

그림 8. BF(흡수) 및 DF(산란) 이미지를 기반으로 한 CNT 정량화 방법은 상관관계가 있습니다. 왼쪽에서 BF 이미지의 평균 픽셀과 DF 이미지의 강도는 CNT(50μg/ml)로 라벨링된 세포에 대해 양호한 상관관계를 보여줍니다(Pearson 상관 계수 r = -0.68). 오른쪽은 BF에 어두운 반점이 맞는 마스크 영역과 CNT(50μg/ml)로 라벨링된 세포에 대해 DF에 밝은 반점이 맞는 마스크 영역입니다. Pearson 상관 계수는 r = -0.83입니다.7,000개 셀의 값이 표시됩니다.

그림 9. 특정 마스크를 사용한 세포의 CNT 국소화. (A) 마스크는 세포의 특정 위치, 즉 왼쪽에서 오른쪽으로, 세포 전체, 막만, 세포 내부에 맞게 만들어집니다. 또 다른 마스크는 임계값 강도(마스크 1, 표기: Intensity(M01, BF, 0-533)) 덕분에 검은 반점에 맞습니다. (B) CNTs의 국소화의 평가는 A. CNTs (50 μg/ml)를 가진 배양은 내재화 경로를 금하기 위하여 37 °C와 4 °C에 둘 다 기술된 세포의 다른 국소화에 있는 검은 반점의 지역을 측정해서 얻어질 수 있다. 전체 세포의 검은 색 영역과 막의 검은 영역을 나타내는 그래프는 4 ° C에서 막에서 CNT의 용량 의존적 흡수를 보여주는 반면, CNT의 전체 내재화는 37 ° C에서 효과적입니다.

그림 10. FITC 이미지의 형광 밝은 점과 BF의 CNT 유도 흑점의 공동 국소화. 형광 밝은 반점이 항상 BF의 검은 반점과 같은 국소화되는 것은 아닙니다. 표시된 처음 두 셀에 대해서는 제대로 일치하지만 마지막 두 셀에 대해서는 일치하지 않습니다.

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.