이 연구에서 주요 목적은 탄소 나노튜브(CNT)의 세포 흡수와 최종 엑소사이토시스를 모니터링하는 것이었습니다. 이러한 관점에서, 우리는 통계적으로 유의미한 수의 세포에서 CNT의 정량화 및 국소화를 허용하는 다중 스펙트럼 이미징 유세포 분석을 사용하는 고유한 방법을 제안했습니다.
방법 논문
멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법과 세포의 현지화 및 탄소 나노 튜브의 상대 정량
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
탄소 나노 튜브 (CNT)와 같은 탄소 기반 나노 물질은 탄소가 풍부한 세포 구조와 구별하기가 매우 어렵고 사실상 세포 및 조직 수준에서 분포를 평가할 정량적 방법이 아직 없습니다. 여기서 우리가 제안하는 것은 다중 스펙트럼 이미징 유세포 분석기(ImageStream, Amnis)를 사용하여 세포 내 CNT를 검출하고 정량화할 수 있는 혁신적인 방법입니다. 새로 개발된 이 장치는 고처리량 세포와 고해상도 이미징을 모두 통합하여 각 세포에 대한 이미지를 직접 유동적으로 제공하므로 통계적으로 관련성이 있는 이미지 분석을 제공합니다. 각 세포 이미지는 명시야(BF), 암시야(DF) 및 형광 채널에서 획득되어 각 세포의 광 흡수, 산란 광 및 형광의 수준과 분포에 각각 액세스할 수 있습니다. 그런 다음 분석은 실험의 각 조건에 대해 획득한 7,000-10,000개의 세포에 대한 각 이미지의 픽셀 단위 비교로 구성됩니다. CNTs의 국소화 그리고 정량화는 CNTs의 몇몇 특정한 본질적인 재산 덕분에 가능하게 한다: 강한 가벼운 흡수율 및 산란; 실제로 CNT는 정확한 공동 국소화와 함께 BF에서 강하게 흡수된 어두운 반점과 DF에서 밝은 반점으로 나타납니다.
이 방법론은 빛을 충분히 강하게 흡수(및/또는 산란)할 수 있는 한 이 프로토콜이 광범위한 나노 물질에 적용할 수 있다는 점을 감안할 때 나노 물질과 세포 간의 상호 작용에 대한 연구에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.
서론
지난 수십 년 동안 나노 입자의 위치는 광범위한 응용 분야에서 중요해졌습니다. 특히, 탄소 나노튜브(CNT)는 다양한 진단 및 치료 응용을 위한 나노 도구로 점점 더 탐구되고 있습니다. CNT는 특정 전기적, 열적 및 분광 특성 덕분에 다양한 약물 또는 조영제의 전달 매개체 역할을 하거나 조직 공학1에 관여할 수도 있습니다.
그러나, 그런 nanomaterials의 잠재적인 독성에 관하여 관심사는 유기체에 있는 CNTs의 운명이 아주 논란의 여지가 남아 있기 때문에 주로, 아직도 토론의 밑에 있습니다. 예를 들어, 라만 분광법, 광음향 및 근적외선 광발광 이미징과 같은 기술이 제안되었지만 각 방법은 나노튜브의 유형 및/또는 환경에 따라 한계를 보입니다2-8.
여기서 제안된 방법은 세포 내 나노 입자의 검출 및 정량화에 적용할 수 있습니다. 이는 유세포 분석과 고해상도 이미징을 결합한 장치인 ImageStream을 사용하여 가능했습니다. 많은 세포를 획득할 수 있는 장점(최대 5000 events/sec)과 통계 데이터와 각 세포의 고해상도 이미지를 동시에 얻을 수 있는 이점(0.5μm 공간 해상도)을 결합합니다. 일반적으로 이미지는 CCD 카메라를 사용하여 수집되며 세포의 2차원 그레이 스케일 표현입니다. 빛은 이미지의 각 픽셀에 대해 정량화되고 형광 또는 세포 내 크기(예: BF)를 가진 구성 요소의 강도와 위치를 모두 식별하므로 세포의 모양에 따라 세포를 구별할 수 있는 강력한 기능을 제공합니다9,10.
목표는 세포에서 CNT의 분포 및 거동을 정량적으로 평가할 수 있는 나노 계측 방법을 설계하는 것이었습니다. 특히, 이 방법은 세포에 의한 CNT의 세포 흡수, 처리 및 외세포작용(exocytosis)을 연구하기 위해 개발되었습니다. 우리는 첫째로 CNTs의 복잡한 세포질 수송을 입증하고 둘째로 세포 사이 이 nanomaterials의 이동을 입증했다: 세포 internalized CNTs는 압박을 받을 때 그들의 숙주 세포를 탈출하고, extracellular 공간에서 해외로 퍼지고 naive 세포에 의해, homotypic 또는 heterotypic11
이다는 것을 증명했다입니다.
이전 연구는 CNT 기능화 및 응집 상태12에 따라 능동 또는 수동적 인 세포 흡수의 다른 메커니즘이 발생할 수 있음을 보여주었습니다. 여기에서 다중벽 CNTs는 1,3-dipolar cycloaddition 및 amidation을 통해 기능화되고 그 후에 형광 프로브로 유도체화되었으며, 이소티오시아네이트(FITC)에 형광을 발했습니다. 투과 전자 현미경에서, 이들은 세포질 국소화를 통해 개별적으로 또는 다발로 세포에 의해 내재화되는 것으로 보이며, 대부분 엔도솜 및 리소좀 구획에서 발견됩니다11. ImageStream에서 클러스터링된 CNT는 BF의 어두운 점과 DF의 밝은 점으로 높은 상관관계를 나타내므로 CNT 표지 세포와 대조 세포를 명확하게 구분할 수 있습니다. 다른 한편으로는, CNTs로 기능화된 형광 마커에 의해 방출되는 형광 신호의 분포는 잘 공동 국소화되지 않았다: 실제로, 아마도 담금질 현상으로 인해, 녹색 형광 반점이 BF 및 DF의 반점과 반드시 일치하지는 않는다. 이는 첫째, 형광 프로브가 ImageStream을 사용한 CNT 검출에 필수가 아니며, 둘째, 포르티오리(fortiori)가 CNT의 정량화 및 국소화 모두에 대해 완전히 대표되지 않음을 나타냅니다.
nanoparticles의 통계적인 관계되는 정량화를 주는 저쪽에, 이 방법은 또한 세포에 있는 CNTs의 국소화에 관하여 정보를 제공한다, 예를 들면, 세포의 내부에 CNTs 대 원형질막에 묶인 그들을 구별한ᄂ다는 것을 의미하는. 세포 이미지에서 CNT를 국소화하는 능력은 기존 유세포 분석 분석의 한계를 명확하게 극복합니다13. 이 절차는 세포의 특정 영역에 맞는 마스크를 만들고 로드된 CNT에 해당하는 어두운 반점도 선택함으로써 여기에서 개발되었습니다.
일반적으로 이 방법은 사용된 나노 입자가 빛을 강력하게 흡수(및/또는 산란)할 수 있는 조건의 세포에서 시각화 또는 정량화의 필요성과 관련된 광범위한 실험에 적용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 수 분 산성 탄소 나노 튜브 (CNT)의 제조
- 20 °C의 목욕물 초음파 발생기에서 20 분 동안 초음파 처리 하기 전에 세포 배양 용수에 첫 번째 CNT를 분산시킵니다. CNT가 형광 프로브로 기능화되는 경우 실험 전반에 걸쳐 빛으로부터 가능한 한 많이 보호하십시오.
2. CNT로 셀 라벨링
- 예를 들어, 10%의 소 태아 혈청과 1%의 페니실린 스트렙토마이신을 함유한 DMEM 배지의 25cm² 플레이트에서 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 성장시킵니다.
- 완전한 배지에서 0, 10, 20 및 50 μg/ml의 농도로 CNT 용액을 준비하고 37°C에서 20시간 또는 4°C에서 20시간(25cm² 플레이트의 경우 CNT 현탁액 2ml)으로 세포를 배양합니다.
3. 세포 고정
- 그 후 배양 배지를 제거하고, PBS로 세포를 헹구고, 트립신화하고, 완전한 DMEM 배지에서 세포를 재현탁합니다. 1,200rpm에서 5분 동안 원심분리기.
- 매체를 먼저 파라 포름 알데히드 4 %로 4 ° C에서 1 시간 동안 교체 한 다음 PBS로 교체하여 보존합니다. 필요한 경우, 세포분석 분석이 이루어질 때까지 며칠 동안 4°C에서 공정의 이 단계에서 세포를 보관할 수 있습니다.
- 각 샘플에는 50μl의 PBS에 농축된 약 10개의6개의 세포가 포함되어야 합니다. 분석 중 응집체를 피하기 위해 올바르게 현탁하고 50μm 메쉬 염색기를 통해 필터링합니다.
참고: 세포를 보존하기 위해 각 단계를 매우 조심스럽게 수행해야 합니다.
4. ImageStream 획득
멀티 스펙트럼 이미징 유세포 분석기 ImageStream을 사용하여 세포 이미지를 획득합니다.
몇 가지 사항을 존중해야 합니다.
- 조정된 배율을 선택합니다(여기서는 40X 대물렌즈가 사용됨).
- 형광 색소를 사용하는 경우 :
- fluorochrome.
없이 대조군 샘플을 준비합니다. -
에 사용된 각 형광 색소에 대해 단색 positive control로 세포를 준비합니다. 샘플에 추가합니다. - 레이저 488 nm를 사용하여 FITC를 여기시키고 채널 02를 사용하여 형광 방출 (대역 통과 480-560 nm)을 수집합니다. 또한 명시야(BF)와 암시야(DF)에 대해 각각 채널 01 및 06을 사용하십시오.
5. 후처리 - IDEAS 분석 소프트웨어(버전 4.0)
- 획득된 모든 이벤트 중에서 분석은 먼저 단일 세포 모집단으로 제한되어야 합니다: '종횡비'(즉, 너비/높이) 대 '세포 면적'(BF의 세포에 적용된 매개변수)을 나타내는 이중 파라메트릭 점도표를 사용합니다(그림 1). 표준 면적과 종횡비가 1에 가까운 관심 영역에 포함된 단일 세포는 다세포 이벤트(큰 면적 및 작은 종횡비) 및 파편(매우 작은 면적)과 구별됩니다.
- 초점이 맞춰진 평면에서 세포를 선택하려면, 고대비(highly contrasted) CNT 표지 세포에 적합한 쌍파라메트릭 도트 플롯(biparametric dot plot)을 사용하십시오: BF 이미지에서 'contrast' 대 'RMS gradient'(이미지의 선명도 품질 측정)를 플로팅합니다 - 이를 통해 BF 이미지에서 낮은 rms gradient와 low contrast를 모두 보여주는 초점이 맞지 않는 세포를 제외할 수 있습니다(그림 1).
-
- "find the best feature(최상의 기능 찾기)"를 사용하여 레이블이 지정된 셀과 레이블이 지정되지 않은 셀 간에 최상의 통계적 분리를 제공하는 매개 변수를 결정합니다. 이 연구에서 평균 픽셀 개체 특징은 가장 적합한 매개변수입니다(그림 2).
- 이 파라미터를 사용하여 정규화된 주파수와 히스토그램을 추적하여 테스트된 농도에 대한 uptaken-CNT의 양을 비교합니다(그림 3).
- 이 두 매개변수 간의 상관 관계를 연구하기 위해 'BF의 평균 픽셀 개체'(표기법: Mean Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) 대 'DF의 강도'(Intensity_MC_Ch06)를 이중 파라메트릭 그래프로 추적합니다(그림 4).
- 정량화는 또한 마스크를 통해 평가됩니다.
- CNTs는 BF에 강하게 흡수하는 어두운 반점으로 나타나기 때문에, 이 연구에서 0-533 (Mask 1, 표기법: Intensity(M01, BF, 0-533)) (그림 5)으로 구성된 낮은 강도의 제한된 범위의 픽셀을 선택하여 정확하게 맞는 임계값 마스크를 먼저 만듭니다. Threshold intensity의 선택은 control cells와 비교하여 labeled cells에서 이루어집니다.
- 반대로, DF(마스크 2, 표기: 강도 (M06, DF, 150-4095))의 고강도(이 경우 150-4095) 픽셀을 사용하여 마스크 피팅도 만듭니다(그림 6).
- 마스크의 면적(1 또는 2; (표기법 : 마스크 1의 경우 Area_Intensity (M01, BF, 0-533) ) : 서로 다른 농도에서 CNT의 내재화에 대한 상대적인 정량화를 제공합니다 (그림 7).
- 이 두 마스크 간의 상관 관계 정도를 확인합니다(이중 파라메트릭 플롯 '마스크 1 영역' 대 '마스크 2 영역' 덕분에).(그림 7).
- 세포에서 CNT를 국소화하기 위해 다른 마스크를 만듭니다.
- 세포 내부에 맞는 마스크 : Erode (M01, 7) - 전체 세포 (M01)의 마스크 (M01)에 해당하며 (그림 8), 7 픽셀로 더 침식됩니다 (그림 9).
- 부울 방정식 M01 및 Erode(M01,7)이 아닌 M01 - 내부(Erode(M01,7))에서 뺀 전체 셀(M01)의 마스크(그림 10)을 사용하여 멤브레인에 맞는 마스크(그림 10).
- 멤브레인의 어두운 픽셀(CNT에 해당)을 고려하려면 Intensity(M01 및 Erode(M01, 7), BF, 0-533) 마스크를 만듭니다(그림 11).
- 세포 모음에 적용된 다양한 마스크를 시각화하여 레이블이 지정된 세포와 표시되지 않은 세포에 대한 관련성을 확인합니다(그림 12).
- 멤브레인의 검은색 픽셀인 'Area_Intensity(M01 and not Erode(M01, 7), BF, 0-533)'를 선택하여 마스크에 피처 영역을 적용합니다. 멤브레인에서 CNT를 정량화할 수 있습니다.
최종적으로 내재화된 CNT와 멤브레인에만 흡착된 CNT를 구별하기 위해 멤브레인의 블랙 영역과 전체 세포의 블랙 영역을 플로팅합니다(즉, 'Area_ Intensity(M01 및 not Erode(M01, 7), BF, 0-533' 대 'Area_ Intensity(M01, BF, 0-533)').
메모: FITC 형광 신호에도 동일한 유형의 절차가 적용됩니다: BF에서 FITC 형광 강도의 증가와 평균 픽셀 신호의 감소를 비교하거나, BF의 어두운 점과 FITC 형광 강도 간의 공동 국소화를 비교합니다. 우리의 경우, 형광 신호가 한편으로는 BF의 다크 스팟과 정확하게 일치하지 않고 다른 한편으로는 DF의 명시야와 정확하게 일치하지 않기 때문에 이러한 유형의 분석은 관련이 없으며, 이는 CNT의 고유 특성(광 흡광 및 산란)이 형광 프로브와 관련된 신호보다 더 적절하다는 것을 보여줍니다.
- 하나의 실험 조건에서 모든 플롯이 생성되면 "통계 보고서 템플릿"을 만들고 템플릿을 .ast 파일로 저장하고 모든 데이터 파일을 일괄 처리합니다.
결과
ImageStream 장치의 원리에 대한 개요는 그림 1에 제시되어 있습니다. 이 장치는 그림 2에서 CNT로 표지된 세 가지 서로 다른 세포의 예시와 같이, 명시야(BF), 암시야(DF 또는 측방 산란광) 및 형광 채널을 포함하여 유동 상태에 있는 각 세포의 다중 고해상도 이미지를 생성합니다. 이러한 채널들의 오버레이 이미지 또한 함께 제시되어 있으며, 이는 첫눈에 상관관계를 잘 보여줍니다.
모든 후처리 분석이 세포 이미징을 기반으로 하므로, 초점이 맞은 세포를 선택하는 것이 연구에서 매우 중요합니다.그림 3). 실제로 CNT의 존재는 라벨링되지 않은 세포와 비교하여 대비와 기울기 모두에 변화를 유도한다. 상당량의 CNT를 내부화한 초점 내 세포는 일반적으로 초점 내 세포를 판별하는 데 사용되는 유일한 파라미터인 rms 기울기가 낮은 경향이 있다. 대비 초점이 맞지 않은 세포)뿐만 아니라, 이분산 도표(biparametric plot)가 필수적인 이유를 설명하는 중요한 대조군이 됩니다. On 그림 3 초점이 맞지 않은 영역(노란색 영역) 간의 구분이 나타나 있습니다. 대조 초점이 맞춰진 세포(파란색 영역).
세포 내로 유입된 CNT는 명확하게 구분되며, 특히 BF에서는 강하게 흡수되는 어두운 점으로 나타납니다(그림 4에서 다양한 라벨링 농도의 효과를 확인하십시오). 또한, BF에서의 평균 픽셀 신호를 분석하여 섭취량을 상대적으로 정량화하였으며, 그림 5의 그래프는 CNT 라벨링 농도가 증가함에 따라 섭취량이 유의미하게 증가함을 보여줍니다(실험 조건당 약 7,000개의 세포에 대한 결과).
둘째로, BF(명시야)의 제한된 어두운 픽셀 범위 또는 DF(암시야)의 고강도 픽셀(그림 6의 예시 참조)에 마스크를 적용하여 CNT를 정량화할 수 있으며, 이는 CNT의 존재로 인해 발생하는 반점들에 해당합니다. 따라서 이러한 마스크의 면적을 도식화하면, 섭취량의 증가뿐만 아니라 강조 표시가 가능합니다(0-533 범위의 픽셀을 선택한 BF 마스크 면적으로 그림 7에 예시됨).
또한, DF 강도를 BF 평균 픽셀 신호에 대해 도식화하거나( 그림 8과 같이) (마스크 독립적 분석), BF의 마스크 영역(마스크 1)을 DF의 영역(마스크 2)에 대해 도식화함으로써 BF와 DF 상의 스팟 간 상관관계를 평가할 수 있습니다.
세포 내 CNT의 국소화를 위해 생성된 절차와 관련하여, 그림 9A는 생성된 다양한 마스크를 보여줍니다. (기본 세포 마스크의 침식에 기반한) 국소화 마스크의 견고함은 라벨링된 세포와 라벨링되지 않은 세포 집합에서 시각적으로 확인해야 함에 유의하십시오. 동일한 마스크가 모든 샘플에 사용됩니다.
세포막의 검은 점 총 면적을 전체 세포의 검은 점 총 면적에 대비하여 도식화하면, 4 °C에서 2시간 동안 배양한 경우와 비교하여 37 °C에서 20시간 동안 배양한 세포의 내부화 점수를 얻을 수 있습니다(그림 9B 참조). 이는 4 °C에서는 CNT가 주로 세포막에 위치하는 반면, 37 °C에서는 90% 이상의 세포에서 CNT가 내부화되었음을 나타냅니다.
마지막으로 형광과 관련하여, 형광 스팟과 BF(및 DF) 상의 스팟 간의 상관관계가 너무 낮아 이 파라미터는 CNT 정량을 위한 지표로 사용되지 않았습니다. 실제로 FITC 강도와 명시야 평균 픽셀 간의 상관관계는 피어슨 상관계수 -0.2로 나타났습니다. 그림 10에서는 형광 신호가 명시야의 검은 스팟과 적절하게 일치하는 경우와 그렇지 않은 경우의 두 가지 사례가 예시되어 있습니다.
그림 1. ImageStream의 일반적인 작동 개요.다중 스펙트럼 이미징 시스템은 명시야, 암시야 및 형광의 세 가지 서로 다른 모드에서 세포당 최대 12개의 이미지를 획득합니다. 설정은 405, 488, 560, 658 nm를 포함한 5개의 여기 레이저로 구성됩니다. 빛은 다양한 대물렌즈(본 연구에서는 40X 대물렌즈 사용)를 통해 큐벳 내에서 흐르는 세포로부터 수집되며, 각도 배열 형태의 롱패스 필터 세트로 구성된 스펙트럼 분해 소자로 전달됩니다. 세포 이미지를 수집하는 CCD 카메라는 이미지 끌림 현상을 방지하기 위해 시간 지연 적분(time-delay-integration)이라는 기술을 사용하여 작동됩니다. 확장 초점 심도(EDF) 옵션을 사용할 수 있습니다.
그림 2. 다양한 채널(명시야(BF), 암시야(DF), 형광(FITC) 및 이들의 중첩 이미지)을 통해 ImageStream으로 캡처한 탄소 나노튜브(50 μg/mL)로 라벨링된 세포의 이미지 갤러리. 세포 내 리소좀에 갇힌 CNT는 명시야 이미지에서 커다란 검은색 점으로 나타난다. 반대로, 암시야 및 형광 이미지에서는 밝은 점으로 나타난다.
그림 3. 초점이 맞은 세포의 선택. BF 이미지에서 root mean square (rms) gradient 대 대비를 나타내는 이변량 도트 플롯을 통해 초점이 맞지 않은 세포를 제외할 수 있다. 여기서 노란색 영역은 초점이 맞지 않은 세포를, 파란색 영역은 초점이 맞은 세포를 나타낸다. 초점이 맞지 않은 세포는 명시야 이미지에서 낮은 대비와 낮은 gradient rms를 보이는 것이 특징이다. CNT로 라벨링한 후 초점이 맞은 세포를 구별하기 위해서는 rms gradient 외에 대비 특성이 추가로 필요하다.
그림 4. ImageStream으로 시각화한 CNT의 농도 의존적 흡수. 세포 배양 시 CNT의 농도(0-50 µg/ml 범위)가 증가함에 따라 명시야 이미지 상의 검은 점의 수와 면적이 증가한다. 대조군 세포에는 검은 점이 없음에 유의하라.
그림 5. 명시야 이미지를 기반으로 한 CNT 흡수의 상대적 정량화. 전체 세포를 나타내는 "object" 마스크에 적용된 평균 픽셀 특징의 히스토그램은 정량화에 사용할 수 있는 용량 의존적 거동을 명확하게 보여준다. R9 범위는 CNT 양성 세포를 포함한다.
그림 6. BF 이미지의 검은 점과 DF 이미지의 밝은 점을 선택하는 마스크 생성. CNT는 BF 이미지에서 강하게 흡수되는 어두운 점으로 나타나므로, 본 연구에서는 0-533 사이의 낮은 강도를 가진 제한된 범위의 픽셀을 선택하기 위해 임계값 마스크를 생성하였습니다 (마스크 1, 표기: Intensity(M01, BF, 0-533)). 반대로, DF 이미지에서 높은 강도(이 경우 150-4095)의 픽셀에 맞는 마스크 (마스크 2, 표기: Intensity (M06, DF, 150-4095))를 사용하여 높은 산란 영역에 해당하는 DF의 밝은 점을 선택합니다.
그림 7. BF 이미지의 검은 점 면적 정량을 통해 CNT의 농도 의존적 섭취를 확인하였다. BF 이미지에 임계값 마스크(mask 1)를 적용하여 각 세포의 검은 점 면적을 정량화한 결과, 농도 의존적인 분포가 나타났다.
그림 8. BF(흡수) 및 DF(산란) 이미지에 기반한 CNT 정량 분석 방법 간의 상관관계. 왼쪽은 BF 이미지의 평균 픽셀값입니다. 대비 DF 이미지의 강도는 CNT로 라벨링된 세포와 좋은 상관관계를 보이며 (50 µg/ml) (피어슨 상관계수 r = -0.68). 오른쪽은 BF 상의 암점(dark spots)에 피팅된 마스크 영역임 대조 CNT로 라벨링된 세포의 DF(암시야) 이미지에서 밝은 점들에 일치하는 마스크 영역(50 µg/ml). 피어슨 상관계수는 r = -0.83입니다. 7,000개 세포의 수치를 도식화하였습니다.
그림 9. 특정 마스크를 이용한 세포 내 CNT 국소화. (A) 세포의 특정 위치에 맞게 마스크를 생성하며, 왼쪽부터 오른쪽 순으로 전체 세포, 세포막 전용, 그리고 세포 내부입니다. 또 다른 마스크는 임계 강도 덕분에 검은색 지점에 맞게 설정됩니다 (마스크 1, 표기: Intensity(M01, BF, 0-533)). (B) A에서 설명한 국소화 마스크를 사용하여 세포의 서로 다른 국소 부위에서 검은색 지점의 면적을 측정함으로써 CNT의 국소화를 평가할 수 있습니다. 내재화 경로를 억제하기 위해 37 °C와 4 °C 모두에서 CNT (50 µg/ml) 배양을 수행했습니다. 세포막의 검은색 면적 대비 전체 세포의 검은색 면적을 나타내는 그래프는 4 °C에서 세포막에 CNT가 농도 의존적으로 흡착됨을 보여주는 반면, 37 °C에서는 CNT의 완전한 내재화가 효과적으로 이루어짐을 보여줍니다.
그림 10. BF 상의 CNT 유도 검은 점과 FITC 이미지의 형광 밝은 점의 공국소화. 형광 밝은 점이 BF 상의 검은 점과 항상 공국소화되는 것은 아니다. 표시된 처음 두 세포에서는 적절하게 일치하지만, 마지막 두 세포에서는 그렇지 않다.
토론
1. 수정 및 문제 해결
이 연구에서 첫 번째 목표는 세포 내 CNT의 양과 국소화를 평가하는 것이었습니다. 공초점 현미경은 형광 마커 FITC8,14로 기능화된 CNT의 세포내 분포를 평가하기 위한 선험적인 금 방법일 수 있습니다. 그러나 주요 단점은 단일 세포 이미징에 대한 제한으로 인해 통계적으로 관련된 데이터가 부족하다는 것입니다. ImageStream은 이러한 장애물을 넘어서는 작업을 가능하게 합니다: 실제로 짧은 시간(<분)에 많은 수의 세포(5,000-10,000개)를 스크리닝함으로써 통계적으로 강력한 결과를 산출하며, 세포 내 해상도(0.5μm)로 각 세포에 대한 이미지를 제공하는 고해상도 이미징으로 향상되었습니다. 그런 다음 단일 이미지 분석을 기반으로 많은 양의 데이터를 분석할 수 있습니다.
기존의 유세포 분석과 비교하여 ImageStream의 고유한 장점은 각 세포의 다중 스펙트럼 이미지 와 신호 강도의 픽셀별 비교를 제공한다는 것입니다. 따라서 ImageStream은 고처리량 유세포 분석의 통계적 능력과 분석된 각 세포에 대한 공초점 이미징의 분석적 이점을 결합합니다. 이는 세포 내 CNT의 무표지 상대적 정량 및 국소화에 매우 중요합니다.
2. 프로토콜 내의 중요한 단계
중요한 단계는 각 연구에 가장 적합한 매개변수를 선택하는 것으로 구성됩니다. 우리의 경우 가장 좋은 방법은 나노튜브의 흡수 및 산란 특성을 기반으로 분석하는 것이었습니다: BF의 어두운 반점의 국소화와 DF의 밝은 반점 사이의 좋은 상관관계는 개발된 방법이 관련성이 있고 신뢰할 수 있으며 세포 이미징 없이는 불가능했을 수도 있음을 뒷받침합니다.
3. 기술의 한계
세포에서 CNT의 시각화는 엔도솜 세포내 소포에 축적된 경향이 있다가 강한 흡수 및 산란 지점으로 나타나기 때문에 가능했다는 점을 강조해야 합니다. 개별 나노튜브는 이 방법을 기반으로 검출되어서는 안 되지만 결국 형광에서 검출될 수 있으며 이는 명백한 한계를 구성합니다. 둘째, 정량화는 '절대적'이 아니라 다양한 표지 농도 및 표지되지 않은 대조군 세포와 비교하여 상대적입니다. 일부 정량적 기능(평균 픽셀, 강도 등)은 절대 매개변수인 반면 다른 기능은 마스크 선택(임계값 마스크, 현지화 마스크)에 따라 달라집니다.
4. 기존 방법과의 중요성
형광과 관련하여 ImageStream 분석은 FITC 밝은 신호와 다른 채널의 스폿 사이의 CNT 클러스터의 열악한 공동 국소화를 강조합니다. 따라서 형광은 CNT의 정량화 및 국소화에 대한 신뢰할 수 있는 지표가 아닌 것으로 보입니다. 그럼에도 불구하고 주로 형광 정량화를 기반으로 하는 기존 유세포 분석의 한계를 극복한 다중 스펙트럼 고처리량 ImageStream은 세포 내부의 탄소 나노튜브의 국소화를 제공하는 동시에 통계적 무표지 정량화를 위한 길을 열어줍니다.
5. 향후 응용
이 고처리량 통계적 나노계측 방법은 세포와 상호 작용할 때 빛의 높은 흡수 및 산란을 보이는 모든 나노물질에 일반화될 수 있습니다. 따라서 나노 바이오 인터페이스, 나노 독성학 및 나노 의학 연구에 중요한 응용 분야를 가질 수 있습니다.
공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 ANR P2N (Nanother 프로젝트 2010-NANO-008-04), Region Ile de France (계약 번호 E539) 및 CNRS의 지원을 받았습니다. 오픈 액세스는 EMD Millipore가 비용을 지불했습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 이미지스트림(ImageStream) |  Amnis |
참고문헌
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