방법 논문

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

DOI:

10.3791/50586

⸱

2013년 7월 10일

 , 
1Fungal Pathogenesis Unit, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

이 논문에서

요약

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우리는 밀도 기울기 원심 분리하여 및 CellTracker 염료를 사용하여 호중구 라벨링 마우스 골수에서 호중구의 분리 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스트림 기능 연구 또는 입양 전송 및 추적 실험 호중구의 큰 숫자를 얻기위한 간단하고 빠른 재생하고 경제적 인 방법을 나타냅니다.

초록

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호중구는 타고난 면역 시스템의 중요한 효과기 세포입니다. 그들은 빠르게 급성 염증의 사이트에서 모집하고 염증 환경에 따라 보호 또는 병원성 효과를 발휘합니다. 그럼에도 불구하고, 다른 전염성 질환 및 염증성 조건에서 호중구의 '음향과 immunopathogenic 효과를 중재하는 분자 요인의 면역 자세한 이해 호중구의 필수 불가결 한 역할에도 불구하고 아직도 부분적으로 때문에 그들의 짧은 반감기, 이들의 처리에 어려움, 부족한 세포 및 다운 스트림 기능 연구와 입양 전송 실험 호중구의 충분한 숫자를 얻기위한 신뢰성있는 실험 프로토콜의 부족. 따라서, 간단하고, 빠르고, 경제적이며 신뢰할 수있는 방법은 식균 작용, 살인, 시토 킨 생산, 탈과립 및 인신 매매 등의 기능을 평가하기위한 마우스 호중구 충분한 수의 수확에 매우 바람직하다. 이를 위해,우리는 높은 순도와 가능성과 생쥐의 골수에서 백혈구의 큰 숫자를 분리하는 어떤 실험실에서 적용 할 수있는 재생 밀도 기울기 원심 분리 기반의 프로토콜을 제시한다. 더욱이, 우리는 adoptively 유동 세포 계측법을 사용하여 적어도 4 시간 후 전송받는 생쥐에 옮겨와 여러 조직에서 추적 할 수있는 고립 된 호중구, 레이블 CellTracker 염료를 사용하는 간단한 프로토콜을 제시한다. 이 방법을 사용하면 다른 CellTracker 염료와 야생형 유전자 결핍 생쥐에서 호중구의 차이 라벨이 성공적으로 생체 내 표적 조직에 혈액에서 호중구의 거래에서 특정 유전자의 직접적인 역할을 평가하기위한 경쟁력을 다시 채우기 연구를 수행하기 위해 고용 수 있습니다 .

서론

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호중구는 인간의 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 그들은 미생물 침입에 대한 방어의 첫 번째 라인으로 타고난 면역 시스템과 법의 주요 세포 구성 요소입니다. 호중구 수 및 / 또는 기능에 영향을 인수 호중구 감소증 및 기본 면역 부전 환자 호스트 방어 1이 세포의 중요성을 강조 생명을 위협하는 침입 세균 및 곰팡이 감염을 개발할 수 있습니다. 염증 조직 2에 혈류에서 채용 호중구 수있는 화성 그라데이션을 생성 chemoattractants의 분비로 연결 조율 타고난 면역 반응의 유도에 자신의 동족 패턴 인식 수용체 결과에 감염 사이트에서 병원균 침입의 면역 인식 . 호중구는 감염 사이트를 입력 한 후, 그들은 활성화되고, 이는 사이토 카인과 케모카인 생산, 병원균의 이해에 이르게하고, 산화 비 산화 나를 통해 살해chanisms 3. 타고난 면역 자신의 잘 인식 역할 외에, 호중구는 최근 효과적인 적응 면역 반응 4 개시로 중요한 역할을 보여왔다. 5-7 감염 및 면역 질환의 다양한 같이 다른 한편으로는, 떨어져 면역 자신의 보호의 역할에서, 호중구는 또한 과도한 축적 및 / 또는 염증의 사이트에서 활성화로 인한 조직 손상과 면역 병리를 중재 할 수 있습니다.

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프로토콜

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1. 마우스 골수 세포의 분리

  1. 기관의 동물 관리위원회의 승인 프로토콜을 사용하여 쥐를 안락사와 70 % 에탄올과 동물의 표면을 스프레이.
  2. 중반 복부 피부의 절개를 확인하고 하반신을 덮고있는 피부를 포함한 마우스의 말초 부분에서 피부를 제거합니다.
  3. 가위를 사용하여 하반신의 근육을 잘라 대퇴골 머리를 깨고 피하면서 조심스럽게 고관절의 비구를 탈구.
  4. 메스와 가위를 사용하여 대퇴골과 경골에 남아있는 근육을 제거하고 뼈 끝을 중단하지 않도록 무릎 관절 운동 치료의 경골에서 대퇴골을 분리합니다. 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 1X를 포함하는 페트리 접시에 뼈를 놓습니다.
  5. 조직 문화 후드에서 다음 단계를 진행합니다. neutrophi을 방지하기 위해 엄격한 무균 기술을 유지하기 위해 추가 조치를 취L 활성화.
  6. 뼈의 표면에서 에탄올을 씻어하는 얼음처럼 차가운 멸균 PBS 세 이후의 세척 (배양 접시 내에서) 다음에 70 % 에탄올 (페트리 접시 이내) 각 뼈를 씻어.
  7. 깨끗한 멸균 페트리 접시 안에, 뼈의 epiphyses을 차단하고 따로 보관하십시오.
  8. 25 게이지 바늘과 RPMI 10 % FBS, ....

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결과

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이 프로토콜은 쥐의 골수 세포와 시중 Histopaque 세포 분리 매체를 사용하여 밀도 기울기 원심 분리하여 이들 세포에서 호중구의 연속적인 분리의 수확에 최적화되어 있습니다. 호중구는이 방법을 사용하는 것은 다운 스트림 기능 연구 전직 생체의 다양한 사람과받는 사람의 생쥐의 입양 전송 실험에 사용할 수입니다.

감염 8-12주 된 C57BL / 6 마​​우스 당 대퇴골과 경골 모두에서 골수 세포의 컬렉션의 전형적인 수율은 ~ 94~98%의 생존과 ~ 60-80000000 세포이다. 이러한 세포의 하류 밀도 기울기 원심 분리 Histopaque 밀도 분리 매체를 사용하여 일반적으로 감염 마우스 당 ~ 6-12000000 호중구를 얻을 수 있습니다. 호중구 80-95 % 순수하고> 95 % 가능한, 등 유동 세포 계측법 (그림 1)에 의해 확인. 그것은 밀도 전에 여러 동물에서 풀 골수 세포 수는 있지만기울기 원심 분리 단계 .......

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토론

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여기에 우리는 밀도 기울기 원심 분리 방식을 사용하여 고순도 생존과 생쥐의 골수에서 호중구의 큰 숫자의 절연을위한 신뢰성, 빠르고 간단하고 경제적 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜이 올바르게 수행 될 때, ~ 6-12 × 10 6 백혈구는 감염 마우스에서 복구 할 수 있으며, 많은 ~으로 30 ~ 40 × 10 6 백혈구는 감염 후 6 마우스에서 분리 할 수 있습니다. 격리 된 호중구 80-95 % 순수와> 95 % 가능한입니다.

골수 스트림 기능 연구와 입양 전송 실험 쥐 호중구를 얻기위한 적절한 저수지이다. 첫째, 이전에 두 구획의 세포가 유사한 산화 버스트와 탈과립 16 전시로 골수 호중구 쥐에서 혈액 호중구 기능적으로 유사하다는 것을 보였다. 둘째, 마우스 골수 호중구는 protr 살아 남기 위해 표시되었습니다문화 시간의 행동 기간이 상당히 오래 마우스 혈액 호중구 16에

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공개 사항

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저자는 그들이 더 경쟁 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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이 작품은 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID), 국립 보건 연구소 (NIH), 미국의 교내 연구 부문에 의해 지원되었다.

모든 마우스는 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID)에서 실험 동물 관리 공인 동물 시설의 인증을위한 미국 협회에서 관리 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서에 설명 된 절차에 따라 보관 하였다 NIAID의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜의 후원하에.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
 Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPESCellgro10-041-CV 
소 태아 세럼 (열 비활성화)GemCell100500 
페니실린/스트렙토마이신(페니실린 10,000 단위 / 10,000 mg/ml 연쇄상구균)GIBCO15140 
0.5 M EDTA품질 생물학 Inc351-027-101 
0.2% 및 1.6% 염화나트륨JT Baker3624증류수와 멸균 여과를 사용하여 염화나트륨 용액
멸균 여과된 Histopaque 1077Sigma10771Histopaque 1077은 18-26°C로 가져와야 합니다. C 사용 전
멸균 여과 Histopaque 1119Sigma11191Histopaque 1119는 18-26 °로 가져와야 합니다. 사용 전 C
칼슘과 마그네슘 없는 인산염 완충 식염수 (PBS)Cellgro210-40-CV 
에틸 알코올 (200 proof)워너 그레이엄 컴퍼니64-17-5 
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)InvitrogenC-7025DMSO에서 10 mM의 원액을 만들고 분취 및 -80°C에서 보관; C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)InvitrogenC-2927DMSO에서 10 mM의 원액을 만들고 분취 및 -80°C에서 보관; C
안티-마우스 CD45 (클론 30-F11)eBioscience170451-82 
안티 마우스 Ly6G (클론 1A8)BD Pharmingen551461 
안티-마우스 Ly6G (클론 1A8)BD 파밍겐560599 
안티-마우스 CD11b (클론 M1/70)eBioscience47-0112-82 
안티-마우스 CD16/CD32 (마우스 BD Fc 블록)BD Pharmingen5531411:100 희석에서 사용
LIVE/DEAD 수정 가능한 블루 데드 셀 스테인 키트분자 프로브L-231051:1000 희석에서 사용
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma67-68-5 
파라포름알데히드 용액, PBSUSB Corporation19943 
 표 1. 채택된 호중구의 분리, 라벨링 및 추적을 위한 시약.
 Materials
C57BL/6 마우스Taconic 
15ml 원심분리기 튜브Corning430053 
50 ml 원심분리기 튜브BD Falcon352070 
25 ml 혈청학 피펫Celltreat229225B 
10 ml 혈청학 피펫Celltreat229210B 
5 ml 혈청학 피펫Celltreat229205B 
파스퇴르 피펫 (3 ml)BD Falcon357575 
12 ml 주사기Kendall monoject512878 
25G x 5/8인치 바늘 (정밀 활공 바늘)BD305122 
100mm 셀 스트레이너BD Falcon352360 
살균 페트리 접시BD Falcon351029 
Combitips Plus BiopurEppendorf2249608-5 
쥐 해부 기구 (가위, 펜치, 메스)생물 의학 연구 기구10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000기구는 사용 전에 멸균 처리되었습니다
.Equipment
Tissue culture hoodThe Baker CompanySG403 
냉장 원심분리기Thermo Fischer Scientific75004521 
37 &도; C 쉐이킹 워터 배스Thermo Fischer Scientific3166721 
 표 2. 이 프로토콜에 사용되는 재료 및 장비 목록.
에서 4%

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
  2. Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22

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