우리는 밀도 기울기 원심 분리하여 및 CellTracker 염료를 사용하여 호중구 라벨링 마우스 골수에서 호중구의 분리 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스트림 기능 연구 또는 입양 전송 및 추적 실험 호중구의 큰 숫자를 얻기위한 간단하고 빠른 재생하고 경제적 인 방법을 나타냅니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| 소 태아 세럼 (열 비활성화) | GemCell | 100500 | |
| 페니실린/스트렙토마이신(페니실린 10,000 단위 / 10,000 mg/ml 연쇄상구균) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | 품질 생물학 Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% 및 1.6% 염화나트륨 | JT Baker | 3624 | 증류수와 멸균 여과를 사용하여 염화나트륨 용액 |
| 멸균 여과된 Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077은 18-26°C로 가져와야 합니다. C 사용 전 |
| 멸균 여과 Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119는 18-26 °로 가져와야 합니다. 사용 전 C |
| 칼슘과 마그네슘 없는 인산염 완충 식염수 (PBS) | Cellgro | 210-40-CV& | nbsp; |
| 에틸 알코올 (200 proof) | 워너 그레이엄 컴퍼니 | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | DMSO에서 10 mM의 원액을 만들고 분취 및 -80°C에서 보관; C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | DMSO에서 10 mM의 원액을 만들고 분취 및 -80°C에서 보관; C |
| 안티-마우스 CD45 (클론 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| 안티 마우스 Ly6G (클론 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| 안티-마우스 Ly6G (클론 1A8) | BD 파밍겐 | 560599 | |
| 안티-마우스 CD11b (클론 M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| 안티-마우스 CD16/CD32 (마우스 BD Fc 블록) | BD Pharmingen | 553141 | 1:100 희석에서 사용 |
| LIVE/DEAD 수정 가능한 블루 데드 셀 스테인 키트 | 분자 프로브 | L-23105 | 1:1000 희석에서 사용 |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| 파라포름알데히드 용액, PBS | USB Corporation | 19943 | |
| 표 1. 채택된 호중구의 분리, 라벨링 및 추적을 위한 시약. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 마우스 | Taconic | ||
| 15ml 원심분리기 튜브 | Corning | 430053 | |
| 50 ml 원심분리기 튜브 | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml 혈청학 피펫 | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml 혈청학 피펫 | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml 혈청학 피펫 | Celltreat | 229205B | |
| 파스퇴르 피펫 (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml 주사기 | Kendall monoject | 512878 | |
| 25G x 5/8인치 바늘 (정밀 활공 바늘) | BD | 305122 | |
| 100mm 셀 스트레이너 | BD Falcon | 352360 | |
| 살균 페트리 접시 | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| 쥐 해부 기구 (가위, 펜치, 메스) | 생물 의학 연구 기구 | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | 기구는 사용 전에 멸균 처리되었습니다 |
| . | Equipment | ||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| 냉장 원심분리기 | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 &도; C 쉐이킹 워터 배스 | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| 표 2. 이 프로토콜에 사용되는 재료 및 장비 목록. |
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