유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

요약

우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다.

초록

단지 신호 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)의 구조 및 동적 연구를 용이하게하기 위해 새로운 접근 방식은 수용체의 기능을 교란하지 않는 표현 수용체에 정보를 프로브 또는 라벨을 도입해야합니다. 우리는 유 전적으로 인코딩에 앰버 코돈 억제 기술을 사용 부자연 아미노산 heterologously 포유 동물 세포에서 발현의 GPCR의 다양한 표적 위치에서의 P-아지도-L-페닐알라닌 (AZF). 아지 그룹의 다양성은 그들 나라의 세포​​ 환경이나 세제 용해 된 상태에서의 GPCR을 연구하는 다른 응용 프로그램에서 보여줍니다. 먼저, 트리튬 표지 된 저분자 리간드 유전자 부호화 아지 아미노산 가교 GPCR의 리간드 결합 포켓 잔기를 식별하는 셀 기반 타겟팅 광 가교 기술을 보여준다. 우리는 그 다음 bioorthogonal 딩거 (Staudinger) - BERTOZZI 결찰 REAC로의 GPCR의 사이트의 특정 변형을 보여 주포스 핀 유도체를 사용하는 아지 도기를 대상 기. 우리는 전체 세포 기반 ELISA 방법을 사용하여의 문화와 탐지 표현 막 단백질의 대상 펩티드 에피토프 태그에 대한 일반적인 전략에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 AZF-GPCR에 선택적 형광 프로브로 태그 될 수 있다는 것을 보여줍니다. 그들은 원칙적으로 활성 신호 복합체를 심문하는 GPCR을 발현 어느 임의의 아미노산 위치에 적용 할 수 있다는 점에서 논의 된 방법은 일반적이다.

서론

Heptahelical G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)는 중요하고 다양한 세포 외 신호를 매개하는 매우 역동적 인 막 단백질의 거대 집단을 포함한다. 고전적인 패러다임에서, 수용체의 활성화는 리간드에 의한 구조적 변화와 연결되어있다. ^1,의 GPCR의 구조 ^{생물학에있는} 최근 전진이 횡단 신호의 분자 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. ^{3-5하지만,} 더 큰 화학 정밀도와 이해 기능적인 메커니즘과 GPCR 신호의 구조 역학은, 접근 방법의 툴킷은 활성 신호 단지를 심문하는 정보를 분자 및 화학 프로브를 통합하는 데 필요합니다.

이를 위해, 우리는 사이트 구체적으로 이전 슐츠와 C에 의해 개척 억제 기술 코돈 호박을 사용하여 자연스러운 아미노산 (UAA) 돌연변이에 따라 표현 수용체에 비 또는 최소가 혼란 프로브를 소개하는 방법을 적용oworkers. ⁶ 우리는 포유 동물 세포 이외의 대부분의 이종 시스템에서 표현하기 어려운의 GPCR과 같은 단백질에 대한 높은 수율의 발현 및 돌연변이 유발 시스템을 달성하기 위해 UAA 돌연변이 유발 방법을 최적화. 직교 설계 회로의 tRNA를 사용하여 특정 UAA에 대한 아미노 아실-tRNA의 합성 쌍을 진화....

프로토콜

1. GPCR에에 부 자연스러운 아미노산의 사이트 별 유전 설립

1. 5 % CO ₂ 분위기에서 37 ° C에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)이 보충 된 DMEM에서 HEK293T 세포 (포도당 4.5 g / L, 2 mM의 글루타민)을 유지한다.
2. 리포 펙 타민 플러스 시약을 사용하여 10-cm 접시에서 60-80% 합류로 성장 된 세포를 형질.
   1. 750 μL의 DMEM에, 원하는 위치에 황색 정지 코돈을 포함하는 10 ㎕의 플러스 시약, GPCR의 cDNA 3.5 μg (pMT4. RHO 또는 pcDNA를 3.1. CCR5), 3.5 회로의 tRNA의 cDNA (pSVB.Yam) ㎍의 0.35 μg을 추가 P-아지도-L-페닐알라닌 (pcDNA.RS)에 대한 돌연변이 아미노 아실 tRNA의 합성 효소의 cDNA. 15 분 동안 실온에서 배양한다. 또한 제어 역할을 중량 GPCR의 cDNA (앰버 정지 코돈을 함유하지 않는)를 사용하여 유사한 형질 전환을 수행한다. 17 μL의 리포 펙 타민과 DMEM 750 μL에이 혼합물을 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 평형화 한 후 가져4 ML에 전체 볼륨.
   2. 10 cm의 접시에 대기음 매체는 세포에 형질 전환 혼합물을 적용하고, CO _2....

결과

우리는 - 특히 사이트 억제 기술 코돈 호박을 사용하여 GPCR에 분자 프로브를 소개하는 부 자연스러운 아미노산 돌연변이 유발 방법을 채택했다. 그림 1의 방식은 방법론의 돌출 단계와의 GPCR에, 다양한 UAA를, P-아지도-L-페닐알라닌 (AZF) 통합의 다양한 응용 프로그램을 설명합니다. 포유 동물 세포에 AZF - GPCR에의 발현은 리간드 광 가교를 대상으로하고, bioorthogonal 라벨 화학을 통해 펩티드 에피토프 태그 또는 GPCR의 형광 수정을 대상으로 할 수 있습니다.

광 가교 기술은 생균 GPCR의 리간드 복합체 (도 1A)의 구조적 양상을 조사하기 위해 사용될 수있다. 하나의 실험에서 얻은 대표 데이터는 그림 2와 같다. ¹⁹ 여기에 우리가 앉아 바인딩을 식별 할 수있는 방사성 표지 작은 분자 리간드, 삼중 마.......

토론

우리의 GPCR에, 반응 조사, AZF의 사이트 별 편입 여기 강력한 방법을 설명하고의 GPCR의 구조와 역학을 연구하는이 도구의 세 가지 유용한 응용 프로그램을 보여줍니다. 우리의 방법이 사이트는, 구체적으로 UAAs 화학적 ^{(32, 33)를} 라벨 또는 단일 접근 시스테인 돌연변이에 photocrosslinkers ^{34 부착에} 따라 다른 전략에 근본적인 문제를 우회 통합. 시스테인 티올 그룹을 대상으로 화학 형광 프로브를 부착하기 위해 사용 된,하지만, 이러한 전략은 시스테인 프리 단백질 배경의 생성을 필요로한다. 모든 GPCR에 적절한 수용체 기능을 유지하는 것이 필수적 일 수있다 많은 중 하나 이상의 시스테인을 소유 때문에 이것은 제한 될 수있다. 따라서, 화학 수정 의무 또는 UV 빛에 의해 활성화 될 수있는 UAA를 소개하는 가능성은 매우 매력적이다.

사 ž의 공유 결합 반응표적 분자와 oactivatable 가교제는 거리와 이.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플라스미드 pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
azF			pcDNA.RS(Ye et al., 2009)
플라스미드 pMT4.Rho 및 pcDNA 3.1.CCR5			선택적으로 원하는 위치에 호박색 정지 코돈(TAG)을 포함
HEK 293T 세포			부착 세포
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566	년
인산염 완충 식염수	Gibco	14200
태아 소 세럼	제미니 바이오 제품	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			표 1. GPCRs 재료에 비천연 아미노산의 현장 특정 유전자 통합
Maxima ML-3500S UV-A 램프	Spectronics Corporation		azF는 365-nm 빛에 의해 활성화됩니다
. Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	어바인 사이언티픽	9319
소 세럼 알부민	로슈	3117405001
트리티움 표지 리간드			공동 연구자(Grunbeck et al., 2012)
에서1%(w/v) n-도데실-&베타;-D-말토시드	Anatrace	D310LA&	nbsp;
CNBr-활성화된 세파로스 2B 수지에 고정된 1D4-세파로스
1% (w/v) 소듐 도데실 설페이트 (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS 젤	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE는 NuPAGE 장치에서 수행됩니다.
Trans-Blot SD 장치	Biorad		장치, 반건조 전송을 위한
Immobilon, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막	Millipore	IPVH00010
무지방 우유	Fisher Scientific	NC9934262
트윈-20	알드리치	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	신틸레이션
유체 신틸레이션 바이알	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta 액체 섬광 카운터	Perkin Elmer		Beta-섬광 카운터
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	맞춤형
양고추냉이 과산화효소(HRP)-접합 항마우스 IgG	KPL, Inc.	474-1806	년
SuperSignal West Pico 화학발광 기판	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR 필름	Denville	E3018
			표 2. 표적 광교차결합 재료
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-트리아릴포스핀	시그마	GPHOS1
M2 FLAG mAb	시그마	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
폴리-D-라이신	시그마	P6407
96-웰 플레이트	Costar	3601	투명 바닥, 고결합 EIA/RIA
인산염 완충 식염수 (칼슘, 마그네슘)	Gibco	14040
16% 파라포름알데히드	EMS	28908
HRP 활용	KPL, Inc.	474-1516	년
안티 토끼 IgG	KPL, Inc.	474-1516	년
Amplex 레드	인비트로젠	A12222
과산화수소	DE 헬스케어 제품	97-93399
CytoFluor II 형광 멀티웰 플레이트 리더	Perseptive Biosystems
			Table 3. targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., 2012년 제출)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-세파로스 레진			1D4 mAb CNBr-활성화 세파로스 2B 레진에 고정
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS 겔	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE는 NuPAGE 장치에서 수행
Confocal Typhoon 9400 형광 스캐너	GE 헬스케어	중단	스캐너 488-nm 파장 레이저
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용 플라스미드 수지 1D4 mAb, 장치, , 를 모방한 펩타이드됨 된