근섬유는 정상과 질병 상태 모두에서 중요한 생리 과정을 조절하는 위장관의 영향력 기질 세포이다. 우리는 마우스 및 시험 관내 실험에 이용 될 수있는 인간의 결장 조직 모두에서 일차 근육 섬유 모세포의 분리를 허용하는 기술을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
근섬유는 많은 GI 기능에서의 중요한 역할에 대해 상당한 관심을 얻고있다 위장관 (GI) 요로의 기질 세포이다. 여러 근섬유 세포 라인은 체외에서이 세포를 연구하기 위해 상업적으로 사용할 수 있지만, 실험 세포 배양 조건에 노출 된 세포주에서의 연구 결과는 작품의 지나치게 환원 주의적 성격으로 인해 고유의 제한이 있습니다. 일차 근육 섬유 모세포의 사용은 세포주에서 확인 실험 결과를 확인하는 점에서 큰 장점을 제공한다. 동물 모델에서 기본 근육 섬유 모세포의 분리는 더 밀접하게 질병 상태가 연구되고 모방 조건에서 근육 섬유 모세포의 연구를 위해 수 있습니다. 세포가 기저 질환을 가진 환자에서 직접 오기 때문에 인간의 대장 조직에서 기본 근육 섬유 모세포의 분리는, 틀림없이 가장 관련성이 실험 데이터를 제공합니다. 우리는 u가 될 수있는 잘 확립 된 기술을 설명마우스와 인간의 대장 조직 모두에서 기본 근육 섬유 모세포를 분리 tilized. 이 고립 된 세포는 피하 장 근육 섬유 모세포와 일치하는 알파 - 평활근 액틴과 vimentin에 양성하고, 최근 desmin 음수로 특성화되었다. 주요 근섬유 세포는 세포 배양에서 성장 및 통로 한정 이상의 실험 목적을 위해 사용될 수있다.
서론
위장관 기능의 조절은 점막층과 내부 간엽 간의 복잡한 동적 상호 작용을 수반한다. 이러한 상호 작용은 일반적으로 항상성을 유지하는 역할뿐만 아니라 병적 인 조건 1에서 질병 상태의 개발로 이어질 수 있습니다. 근육 섬유 모세포는 점막 재생, 수리 및 섬유증 2를 포함 중요한 위장관 프로세스의 수를 조절하는 세포 모집단을 둘러싼 주변 분비 방식으로 통신 상피 층 바로 아래에 위치 기질 세포의 모집단입니다.
그것이 시츄 근육 섬유 모세포의 차의 많은 특징을 공유하기 때문에 18Co 세포주 널리 근섬유의 기능을 연구하기 위해 사용되었다 인간 결장 근섬유 세포주의 예이다. 이러한 단백질 - 평활근 액틴의 발현 (α-SMA) 및 멘틴뿐만 아니라 수의 표현을 포함이러한 표피 성장 인자 수용체, 또는 라이 소포스 파티 딕산에 3,4위한 수용체로서 세포 표면 수용체. 때문에 이러한 공유 미세 구조 특성뿐만 아니라 생물학적 기능 소재 유사성 18Co 세포주는 염증성 장 질환 또는 대장 암 3,6 많은 질병 상태의 컨텍스트에서 근섬유의 기능을 연구하기 위해 광범위하게 사용되고있다. 그러나, 세포주를 사용하여 고유의 제한 문제가있....
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프로토콜
1. 콜론 조직을 얻기
마우스
이론적 근거 및 연구의 목적을 자세히, 동물 실험을 수행 할 수있는 프로토콜 제출 및 동물 연구 감독의 우리의 기관 사무실에 의해 승인되었습니다.
- 자궁 경부 전위 다음에 흡입 이소 플루 란으로 마우스를 안락사.
- 복부 정중선 절개를 멀리 소장을 철회하고 콜론을 확인합니다. 옆으로 방광과 자궁 (있는 경우)를 후퇴와 치골을 식별하고 직장을 노출 미세 가위로 잘라.
- 대장의 떨어져 직장의 지느러미 장간막을 해부하고 항문에서 맹장에 콜론을 동원하고, 소장에서 대장을 분리를 절개.
- 얼음처럼 차가운 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 표본을 놓습니다.
- 얼음처럼 차가운 PBS로 10 ML의 주사기를 입력하고 콜론 OPE를 절단 한 후, 그 내용을 취소 여러 번 루멘 콜론을 플러시N 길이 방향 가위를 사용.
- 얼음처럼 차가운 PBS의 20 ML을 포함하는 50 ML 원뿔 관에 콜론을 배치합니다. 콜론은 특정 방향으로 배치 할 필요가 없습니다. 유체가없는 입자상 물질을 취소 할 때까지 PBS를 대체하여 대장을 씻으십시오.
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결과
일단 고립 된, 인간의 기본 근육 섬유 모세포는 세포 배양에서 재배하고 (유로 4까지) 통로의 제한된 수의를 통해 사용할 수 있습니다. 이 세포는 장 피하 근육 섬유 모세포 5,7와 일치 - 평활근 액틴과 vimentin에 긍정적 인 것으로 특징 및 최근 desmin 음 (그림 1A) 있습니다. 또한 특성 별 모양의 형태 (그림 1B)가있다. 주요 근육 섬유 모세포는 세포주에서 확인 실험 결과를 확인하기 위하여 사용될 수있다. 이 방법은 염증성 사이토 카인 TNF-α (10 NG / ML)은 EGF 수용체 발현의 상향 조절을 유도하고 이러한 세포 7 신호 있음을 입증하기 위해 이용되었다. 상향 조절 EGF 수용체 발현 및 신호는 처음에는 앞서 언급 한 인간의 대장 근섬유 세포 라인 18Co (그림 2)를 이용하여 발견되었다. 그림 2A, 우리는에 18Co 세포의 노출 .......
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토론
마우스 또는 인간의 콜론을 사용하면 일반적인 방법은 비슷합니다. 이 기술은 또한 소장에서 근육 섬유 모세포를 분리하는데 사용될 수있다. 1 근육 섬유 모세포의 분리에 대한 구체적인 내용은. 마우스와 2. 인간의 대장은 아래에 설명되어 있습니다.
1. 마우스 콜론
마우스 결장 관개는 결장의 일단에 16 G 포퍼 무딘 엔드 바늘에 4를 부착함으로써 촉진된다. 세로 결장 절단 경우에도 도움이됩니다. 당신은 바늘에 결장 조직을 아코디언 수있다, 그 후에 날카로운 끝을 위로 가위의 한 끝을 배치하고 세로 엽니자를 때 가위의 가장자리에 결장 조직을 밀어 넣습니다.
2.1 단계에서, 죽은 세포에서 핵 물질이 세포의 응집을 초래할 수 있다는 것을 이해하는 것이 중요합니다. DNA 분해 효소 (50 ㎎ / ㎖)의 추가는이 문제를 해결하기 위해 사용될 수있다.
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 작품은 JY에 건강 그랜트 5KO8DK085136-02의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약명 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 (선택 사항) |
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| 콜라겐분해효소 D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
참고문헌
- Armaka, M., et al. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in healt....
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재인쇄 및 허가
