Method Article

단일 베이 수준에서 산소 미시의 양 및 시간 제어

DOI:

10.3791/50616

⸱

November 17th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan-Dearborn, 2Department of Surgery/Transplant, University of Illinois at Chicago, 3Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

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미세 유체 산소 제어 생물학적 실험 저산소 챔버를 통해 단지 편리함과 속도보다 더 부여. 막을 통해 확산을 통해 구현 특히, 미세 유체 산소 마이크로 수준에서 동시 액체 및 기체 상 변조를 제공 할 수있다. 이 기술은 섬의 병태 생리를 연구하는 동적 멀티 파라미터 실험은 중요 할 수 있습니다.

Abstract

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하나의 기술에서 포도당 자극 분비 커플 링 요소를 동시에 산소 및 모니터링은 특히 이식 환경에서, 섬 저산소증의 병리 생리 학적 상태를 모델링하는 것이 중요합니다. 기본 저산소 챔버 기술은 동시에 자극을 변조 또는 이용 글루코스 자극 - 분비 커플 링 요소의 실시간 모니터링을 제공 할 수 없다. 이러한 어려움을 해결하기 위해, 우리는 확산 막을 통해 수성 및 가스 위상 변조 모두를 통합하는 다층 마이크로 유체 기술을 적용 하였다. 이 형광 현미경을 통해 상기 커플 링 요소의 모니터링을 가능하게 투명 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 장치 내의 microscaled 섬 주위에 자극 샌드위치를​​ 만듭니다. 또한, 가스 입력은 0-21% 간의 산소의 정량적, 정 분 변조를 제공 microdispensers의 쌍에 의해 제어된다. 이 간헐적 저산소증이 섬의 새로운 현상을 조사하기 위해 적용T 전처리. 또한, 복합 현미경으로 무장 한, 우리는 이러한 저산소 발생시 상세한 칼슘과 K ATP 채널 역학 볼 수 있었다. 우리는 독도를 공부뿐만 아니라 많은 생체 조직에 가치있는 도구로, 미세 유체 저산소증, 특히이 동시 듀얼 위상 방법을 구상.

Introduction

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동적 저산소증은 특히 섬 이식, 생물학에서 중요하다

동적 저산소증은 많은 생물 조직에서 중요한 생리뿐만 아니라 병리 생리 학적 매개 변수입니다. 산소의 변화는, 예를 들어, 혈관 신생의 잠재적 발달 신호이다. 또한, 저산소증에 공간과 시간적 패턴 HIF1 - 알파를 조절하고 췌장 암과 같은 질병에 역할을한다. 저산소증은 섬 이식 결과에 영향을 미치는 교란 요인이다. 최근, 저산소증, 또는 간헐적 인 저산소증 (IH)의 시간적 진동은 "사전 조정"독도 1에 혜택을 증명하고있다. 그러나, 섬의 생리에 대한 정적 및 과도 모두 저산소증 효과는 잘 주로 섬의 미세 환경을 제어하는​​ 적절한 도구의 부족으로 이해하고, 공부 못하고있다.

독도 아니라 생체 내에서 혈관이 있습니다

췌장은 50-400입니다 56, 베타 세포와 포도당 항상성에 대한 책임은 알파 세포를 포함한 내분비 세포의 M의 구상 집계. 독도 ATP에 민감한 칼륨 (K ATP) 채널과 인슐린 과립의 세포 외 유출을 유발 칼슘 유입의 결과를 열어 ATP 생산에 혈액, 흡수와 작용 리드 자극 포도당에 노출 된 경우. 산소이 심하게 대....

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Protocol

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1. 마우스 독도 준비

  1. C57BL / 6 쥐를 해부 및 콜라게나 소화 피콜 밀도 구배 분리에 의해 섬을 격리 할 것. (2,3에서 참조 조브 기사 참조).
  2. 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 배양 접시에 20 mM의 HEPES를 포함하는 RPMI-1640 배지에 독도를 품다 (37 ° C, 5 % CO 2). 후 분리, 배양 실험에 사용하기 전에 24 시간 동안 섬. 일관된 결과를 보장하기 위해 1-2 일 안에 독도를 사용합니다.

2. 미세 유체 플랫폼 만들기

  1. 각 장치 계층에 대한 투명성 포토 마스크의 미세 형상을 생성합니다 : 1) 입구와 출구, perifusion 실 2) 포도당 미세 유체 층 (8 mm 직경 × 3 mm의 150 μL), 마이크로 웰 3) 200 μm의 막 (500 μm의 직경, 100 깊은 μM), 4) 가스 미세 유체 층.
  2. 입구와 출구 층을 제조하기에 탈기, 예비 혼합 된 PDMS를 부어2 시간 동안 80 ° C에서 빈 페트리 접시 및 치료에 1.5 mm의 높이. 2mm 직경의 입력 / 출력 포트를 펀치.
  3. 글루코스 미세 층을 제조하기 위해, 실리콘 웨....

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Results

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이 섬의 저산소증 기술의 중심이 분 규모의 과도와 같은 마이크로 유체 챔버에서 수성과 기상 자극을 조절하는 기능입니다. 그림 1)의 대표 결과 섬의 챔버 내에서 측정 된 듀얼 자극 및 B) 빠른 변조. 챔버에 형광의 도입으로 도시 수성 변조, 혼합 3-4 분 균형을 달성한다. 또한, 산소는 2 분 정도로 짧은 기간에 산소의 순환을 가능하게 빠른 과도로 5-21% 강화 될 수있다. 도 2에 도시 된 바와 같이 서로 다른 순환 안쪽과 주파수는 성취 될 수있다.

이 순환은 아일렛에 간헐적 저산소증을 생성인가되면 일반, 정상 산소 펄스,도 3a에 비해, 하나는 저산소증에 대해 독도 전처리의 이점을 관찰 할 수있다. 세포 내 칼슘 플럭스 신호 mechanis 때문에인슐린의 분비가 M-되어 실시간으로 모니터링, 저산소증과 IH의 효과는 칼슘 과도, 그림 3b의 오버 .......

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Discussion

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이 섬의 저산소증 기술에 통합 된 여러 양식은 현재 몇 점은 문제를 해결하려면 여기 지적했다. 먼저 고립 된 섬이 저하 인해 선방 세포에서 소화 효소에 문화를 분해하는 것을 계속한다. 섬 격리 후 1-2 일 실험을 표준화하면 일관성있는 결과를 얻기에 따라서 중요합니다. 둘째, 수성 유동은 층류 확산 사이의 경계에서 대류 일소 방지 할 저산소증 및 간헐적 저산소증 동안 중단 하였다. 이것은 베이 전처리의 지속 시간을 제한하는 것으로 보인다. 아직도 막에서 빠른 가스 변조를 허용하면서 수성 채널에서 가스 교환의 미래 통합이 작은 간극을 제거 할 수 있습니다. 독도를로드하는 동안 셋째, 수성 튜브는 공기 방울이 방지하기 위해 (콘센트 다음 입구) 역순으로 조심스럽게 다시 연결해야합니다. 마지막으로, 미래의 장치 분포를 돕기 위해 삼진 아웃 미세 유체 분배로 보강 될 수있다사냥꾼 포켓의 배열 패턴 화 될 수있는 바닥에, 전체 챔버를 통해 독도의 클러스터 테. 포켓 배열 외에 추가로이 마이크로 유체 분포는 높은 처리량 실험 독도의 위치.......

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Disclosures

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

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이 작품은 건강 보조금 R01 DK091526 (JO), NSF 0,852,416 (DTE)의 국립 연구소와 시카고 당뇨병 프로젝트에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< 강력 > 시약 / 재료< / 강력 >
스피너LaurellWS-400
SU8MicroChemSU8-2150 / SU8-2100
디지털 핫 플레이트PMC 데이터 플레이트722A
UV 경화 램프OmniCureS1000
PMDS다우 케미컬실가드 184
Corona WandETPBD-20AC
진공 챔버Bel-Art420220000
마이크로 디스펜서The Lee CompanyIKTX0322000A
5V 및 20V DC 전원라디오 판잣집
NI USBNational InstrumentNI USB-6501
온도계Omega Engineering, Inc.
연동 펌프GilsonMinipulse 2
산소 센서Ocean OpticsNeoFox
분획 수집기Gilson203
PippetteFisher ScientificFinnpipette II 100μ l
거꾸로 된 epifluorescence 현미경LeicaDMI 4000B
50 ml 원뿔 관Fisher Scientific
Fura-2 형광 염료분자 프로브, Life Technologies
Rhodamine 123 형광 염료분자 프로브, Life Technologies
문화 매체Sigma-AldrichRPMI-1640
HEPESSigma-Aldrich
포도당시그마-Aldrich
소 혈청 알부민Sigma-Aldrich
30 in 실리콘 튜빙Cole-Parmer1/16 in x 1/8 in
1.5 ml Eppendorf 튜브Fisher Scientific
Y-커넥터Cole-Parmer1/16 인치 및 4mm
주사기 커넥터Cole-Parmer암 Luer 플러그 1/16 인치
스트레이트 커넥터Cole-Parmer1/16 in
엘보우 커넥터Cole-Parmer1/16 인치

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
  2. Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreati....

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Tags

Microfluidic HypoxiaOxygen ModulationIslet IsolationFluorescence MicroscopyPDMS DeviceGas Permeable MembraneCalcium DynamicsKATP ChannelIntermittent HypoxiaGlucose Stimulus

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