이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 병렬로 복수의 단일 세포에서 세포 내 생체 분자의 정량적 측정을 가능하게하는 미세 유체 장치를 제시한다. 이를 위해, 세포는 수동적 microchamber의 중간에 갇혀있다. 제어 층의 활성화시에, 셀은 작은 챔버에서 주변 볼륨으로부터 분리된다. 주변 음량은 고립 셀에 영향을주지 않고 교환 될 수있다. 그러나, 챔버의 짧은 개방 및 폐쇄시에, 챔버 내 용액을 몇 백 밀리 초 내에서 대체 될 수있다. 때문에 실의 가역성에, 세포 배양, 세척, 및 최종적으로, 세포 용해 예 : 고도로 제어 가능한 방식으로 다른 솔루션을 순차적으로 노출 할 수있다. 단단히 밀봉 microchambers은 해물의 유지를 가능하게 최소화하고 세포 용해 후 희석을 제어 할 수 있습니다. 용해 및 분석은 동일한 위치에서 발생하기 때문에, 고감도가 유지되어 더 이상의 D보기 때문에분석의 ilution 또는 손실이 운송 중에 발생합니다. microchamber 디자인 따라서 각각의 세포에서 방출 세포 내 분자 (아토 몰, zeptomoles)의 매우 작은 크기의 숫자의 신뢰성과 재현성 분석을 가능하게한다. 또한, 많은 microchambers 적합한 광학 기기가 모니터링을 위해 사용되는 관련 한번에 많은 세포의 분석을 가능하게 배열 형식으로 배열 될 수있다. 우리는 이미 세포 내 단백질, 효소, 보조 인자 및 상대 또는 절대 하나를 정량화 할 수있는 방법으로 두 번째 메신저를 분석하기 위해 개념 증명 연구를위한 플랫폼을 사용하고 있습니다.
서론
과거의 많은 연구는 세포에 세포 대 세포 인구 1-3 이내의 차이, 특히 신호 4를 처리, 또는 단백질 5,6, 대사 및 보조 인자 7,8 세포 내 생체 분자의 양을 제시했습니다. 이러한 이질성은 세포의 적응과 진화 9 근본적으로 중요 할뿐만 아니라, 암과 10-13과 같은 질병의 출현 및 치료에 중요한 역할을하는 것으로 간주됩니다. 따라서, 단일 세포 수준에서의 연구는 이러한 연구는 생리 활성 화학 물질로 처리 한 후 다른 세포 반응을 표시하는 경우 특히, 생물학적, 약리학 적 연구에 높은 관심이다.
최근, 많은 분석 플랫폼은 하나의 살아있는 세포의 분석이나 세포 함량의 화학 성분을 용이하게 개발되었다. 형광 활성 세포 정렬 (FACS)는 금 성 동안andard 단일 살아있는 세포의 매우 높은 처리량 분석을 위해,이 방법은 세포 내 또는 분비 화합물의 정량에 이용 될 수 없다. 미세 유체 플랫폼의 출현 위치, 치료 및 단일 세포의 관찰에 대한 새로운 분석 전략을 약속했다. 미세 유체의 이정표가 지진 및 동료 (14, 15)에 의해 실현 유연한 PDMS 밸브의 통합에 도달 하였다. 그들은 칩 영역을 분리....
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프로토콜
1. SU-8 마스터 제작
다음과 같은 프로토콜을 사용하지만 서로 다른 마스크 패턴 (회로도 및 치수는 그림 2 참조, 유체 제어) 채널을 모두 마스터 금형을 준비합니다. 공정은도 3a에 도시된다.
- 180 ℃에서 10 분 동안 4 인치 실리콘 웨이퍼를 가열함으로써 시작 스핀 코터에 탈수 웨이퍼를 넣고 스핀 코팅 SU-8 2015 년 다음과 같은 프로토콜을 사용합니다 :
- (분배 후이 단계 닫아서 동안 SU-8을 분배, 스핀 코터의 열린 뚜껑) 20 초 동안 100 rpm에서 웨이퍼를 스핀.
- 10 초 동안 500 rpm으로 회전 웨이퍼 (이것은 웨이퍼 전체에 저항을 전파합니다.)
- 30 초 동안 1,750 rpm으로 회전 웨이퍼 (20 μm의 저항의 높이를 정의한다).
- 이것은, 그렇지 않으면 다음 단계에서 열판 행할 것이다 아세톤 (면봉을 사용)와 함께 웨이퍼의 에지로부터 레지스트를 제거한다. 아 웨이퍼 이동4 분 동안 95 ° C 열에서 otplate. 소프트 베이크 후, (365 nm에서 측정 된 150 엠제이 / cm 2) 자외선 마스크 얼 라이너에 유리 소다....
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결과
우리의 플랫폼에 존재하거나 단일 세포에 의해 생산 세포뿐만 아니라 다양한 분비 분자를 분석 할 수있다. 여기에서, 우리는 가능한 분석의 다양성을 강조하기 위해 다른 예를 들어 연구를 제시하고 싶습니다. 우리는 분비 효소 (그림 5a)뿐만 아니라 세포 내 효소 (그림 5b)와 단백질 (그림 5C와 D)에 대한 예를 제공합니다. 이러한 보조 인자 또는 작은 분자로 더 많은 예제를 위해, Eyer 등. Eyer 등으로 (2012) 참조하여주십시오. (2013).
첫째, 우리는 분비되는 효소 (그림 5a)에 대한 분석을 제시한다. 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)를 활성화시에, 사람의 단핵구는 리소자임의 분비, 세균 세포 용해를 유도 효소를 유도한다. 이 분석을 위해, 세포는 완충액 4 - 메틸 움 β-D.......
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토론
미세 유체 기술은 단일 세포 분석을위한 새로운 매혹적인 가능성을 열었습니다. 특히, 트랩 가능성 및 미세 도구를 사용하여 개별적으로 세포를 고정화는 단일 셀의 속성과 응답에 대한 체계적인 장단기 연구를 허용했다. 또한, 마이크로 칩에서 생성 고주파 미세 방울, 셀의 캡슐화는, 통상적 계측법 장치로 수행 할 수없는 단일 세포 분비 연구를 사용할 수있다. 의 microdroplet 방법은, 그러나, 배양 및 세척 단계를 분석 프로토콜에 필요한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 우리의 접근 방법은 셀 포착 및 분리의 개념을 모두 겸비하고 따라서, 표면에 고정화 된 항체에 근거 면역 포함한 더 복잡한 분석을 수행하기 용이하게한다. 또한, 상기 방법은 애플리케이션과 타겟 분석 물에 대해 매우 유연하다.
마이크로 칩의 설계는 (I) effi 수cient 셀 트래핑 각종 버퍼 및 시약 (ⅱ) 공급하고, 매우 작은 양의 (III)의 안정적인 절연 필수. 이러한 방식으로 타겟 분자의 희석은 회.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
저자는 기꺼이 원고, 맞춤형 압력 제어 시스템의 건설을위한 C. Bärtschi 및 H. 벤츠의 증거 독서 톰 로빈슨을 인정합니다. 우리는 또한 클린 룸 시설 FIRST 두 ETH 취리히에서 빛을 현미경 센터 (LMC)의 사용을 인정하고 싶습니다. 작품은 7 번째 프레임 워크 프로그램 (ERC 그랜트를 시작, 프로젝트 없음. 203428, nμLIPIDs)에서 머크 세로 노, 유럽 연구위원회 (ERC)에 의해 투자되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| REAGENTS: | |||
| 시약 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 (선택 사항) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | ||
| ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | ||
| 4-methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (독일 다름슈타트) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (독일 비스바덴) | n.a.AZ | |
| 726 개발자 | AZ Electronic Materials (독일 비스바덴) | n.a. | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 알드리치 | A-4503 | |
| 소 혈청 알부민, 비오틴 | 시그마 알드리치 | A-8549 | |
| 세포 해리 완충액 | 인비트로젠 | 13151-014 | |
| 헥사메틸디실라잔(HDMS) | 시그마 알드리치 | 40215 | |
| 염산 | 플루카 | 84422 | |
| 이소프로판올 | Merck VWR (독일 다름슈타트) | 109634 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (독일 베를린) | n.a.PBS | |
| Invitrogen | 10010-031 | ||
| PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dü bendorf, Switzerland) | n.a.PLL-g-PEG | |
| 이식 비오틴 | SuSoS, (Dü bendorf, Switzerland) | n.a. | |
| 염화칼륨 | Fluka | 60132 | |
| Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| 실리콘 웨이퍼 | Si-Mat (Kaufering, 독일) | n.a.Sylgard | |
| 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | ||
| 1610716 트윈 20 | Biorad | 1706531 | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| 0.22 µ m PES 주사기 필터 | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 mm 생검 펀처 | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics 필터 20 µ m | Partec | 04-004-2325 | |
| 원심분리기 Sigma 3-18K | Kuehner | n.a.Hotplate | |
| HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a.MA-6 | |
| 마스크 aligner | Karl Suess | n.a.Multizoom | |
| AZ100M 현미경 | Nikon Corporation | n.a.Photomask | |
| Microlitho, Essex, U.K. | n.a | ||
| 플라즈마 클리너 PDC-32G | Harrick | n.a.Spin | |
| coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a.Spin | |
| 모듈 SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a.Step | |
| 프로파일러 Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
| 주사기 펌프 neMESYS | Cetoni | n.a. |
참고문헌
- Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
- Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
- Lecault, V....
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