설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

요약

현재 문서 곰팡이 독성 메커니즘에 대한 우리의 지식을 향상 할 수있는 유용한 도구가 될 것입니다 인간 대 식세포와 통성 세포 내 인간의 곰팡이 병원균 칸디다 글라 브라의 상호 작용을 연구하는 체외 세포 배양 모델 시스템을 구축 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.

초록

세포 배양 모델 계, 호스트 환경 조건 부근 미믹, 미생물 병원체 감염의 특정 단계의 연구를위한 동물 모델 시스템을 저렴하고 재현성 쉽게 처리 가능한 대안이 될 수있는 경우. , 포르 볼 에스테르 치료시, 대 식세포로 분화된다 THP-1 인간 단핵구 세포주는 이전에 결핵균을 포함한 많은 세포 내 병원체의 독성 전략을 연구하기 위해 사용되었다. 여기서, 우리는 시험 관내 세포 배양 모델을 규정하는 프로토콜 토론 호스트 식세포 세포와 기회 주의적 인간의 효모 병원체 칸디다 글라 브라의 상호 작용을 묘사하는 THP-1 대식 세포를 사용하여 시스템. 이 모델 시스템은 간단하고, 빠르고, 높은 처리량 돌연변이 화면에 순종하고, 더 정교한 장비가 필요하지 않습니다. 전형적인 THP-1 대식 세포 감염 실험 복구 세포를 허용하는 추가 ~ 48 시간으로 약 24 시간 소요식민지 단위 기반의 생존 분석을 형성하기 위해 다양한 매체에 성장 효모. 다른 시험 관내 모델 시스템과 같이,이 접근법의 가능한 제한은 인간 숙주에 존재하는 매우 복잡한 면역 세포 회로에 얻어진 결과를 외삽 곤란하다. 그러나 이것에도 불구하고, 현재의 프로토콜은 곰팡이 병원균 / 회피 항균 응답을 방해 생존, 적응 및 숙주 면역 세포의 영양이 부족한 환경에서 증식하는 데 사용할 수있다 전략을 명료하게하는 것은 매우 유용합니다.

서론

칸디다 종은 면역 저하 환자의 ^1에 생명을 위협하는 침습성 진균 감염의 주요 원인이다. 칸디다 글라 브라, 신흥 병원 내 병원체는 지리적 위치 ^1-3에 따라 중환자 실 환자에서 두 번째 또는 세 번째 가장 자주 고립 칸디다 종입니다. 계통 발생 학적으로, C. 글라 브라, 반수체 신진 효모, 더 밀접하게 비 병원성 모델 효모 사카로 병원성 칸디다 종보다 사카로 마이 세스 세레 비시에 관련되어 있습니다. C. 포함 알비 칸스 ^4. 이과 일치, C. 글라 브라는 짝짓기, 분비 단백질 분해 활성과 형태 학적 소성 ^4-5 등 일부 주요 곰팡이 독성 특성이 부족하다.

비록 C. 글라 브라는 균사를 형성하지 않는, 그것은 생존과 ^6-8는 고유 발병 메커니즘을 개발했다고 제안 쥐와 인간 대 식세포에 복제 할 수 있습니다. 제한된 정보는 전략에 대해 사용할 수 있는지 C. 글라 브라는 영양이 부족한 세포 대식 세포 환경을 생존과 산화 및 호스트 면역 세포 ⁵ 마운트 비산 화성 호스트의 응답을 방해하기 위하여 사용한다. 관련 식세포 모델 시스템은 C.의 상호 작용을 묘사하는 필수 조건이다 기능 유전체 및 단백체 접근 방식을 통해 호스트 식세포 세포와 글라 브라. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를) 및 인간 및 뮤린 기원의 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)는 각각 이전 C.의 상호 작용을 연구하는데 사용되어왔다 숙주 면역 세포 ^7,9와 글라 브라. 그러나, PBMC를하고 BMDMs를 얻기 어려움, 제한된 수명과 다른 포유 동물의 기증자들 본질적인 변화는 이러한 세포의 활용으로 다양한 모델의 시스템을 제한합니다.

여기에서, 우리는 intracellul을 연구하는 생체 시스템의 구축 방법을 설명합니다C. 아칸소 동작 인간 단핵구 세포주 THP-1에서 파생 된 대 식세포에서 글라 브라 셀. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 쉽게 호스트 곰팡이 병원균 상호 작용의 다양한 측면을 연구하기 위해 조작 할 수있는 간단하고 저렴한, 빠르고, 재생 가능한 세포 배양 모델 시스템을 제정했다.

THP-1 세포는 이전에 박테리아, 바이러스, 진균 등 ^10-12 병원균의 광범위한 대 숙주 면역 반응을 해독하는데 사용되어왔다. 단핵구 THP-1 세포는 유지 관리가 용이하고 인간의 단핵구 유래 대 식세포를 모방하고 적절한 대식 세포 마커 ^(13)를 표현하는 대 식세포에, 포르 볼 에스테르 처리에 따라 차별화 할 수 있습니다. THP-1 대식 모델 시스템의 주요 이점은 사용의 용이성 및 정교한 장비의 요구 사항의 부족이다.

여기에 제시된 프로토콜은 HOS 다른 사람의 곰팡이 병원균의 상호 작용을 연구하기 쉽게 적응할 수있다면역 세포를 톤. 현재의 절차는 또한 고 스루풋 돌연변이 스크린을 사용하여 관심의 병원체에 대한 독성 요소를 식별하기 위해 사용될 수있다. 이 증명의 개념은 인간 대 식세포에서 ⁸ C. 글라 브라의 생존에 필요한 유전자 (56)의 집합을 식별하는 THP-1 배양 모델 시스템의 성공적인 사용에 의해 예시되었다.

프로토콜

그것은 C.를 수행하는 것이 좋습니다 글라 브라 감염 바이오 안전성 봉쇄 레벨 2와 실험실 실험 (BSL-2).

1. THP-1 대식 세포 단일 층의 제조.
2. C. 준비 글라 브라 세포 현탁액.
3. C.와 THP-1 대식 세포의 감염 글라 브라 셀.
4. 콜로니 형성 단위의 분석을 통해 식균 작용의 속도와 세포 내 복제의 측정.
5. 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 세포 내 복제의 모니터링.

1. THP-1 대식 세포 단일 층의 제조

1. THP-1은 급성 단핵구 백혈병 ¹⁴ 고통받는 1 살짜리 남자 아이의 말초 혈액에서 파생 된 인간의 단핵 세포 라인입니다. THP-1, 현탁 세포주, 일상적으로 10 % FBS (소 태아 혈청)으로 보충 된 RPMI-1640 배지에서 가습 된 5 % CO _2에서 37 ° C로 유지된다. 포르 12 myrista 치료TE 13 - 아세테이트 (PMA, 포르 볼 에스테르) 대 식세포로 THP-1 단핵 세포의 말단 분화 초래한다. 중요한 사실은, PMA 처리는 세포 생존에 영향을주지 않으며 분화 된 세포는 분열하지 않는다.
2. 종자 약 1.5 × 10의 100mm 배양 접시에있는 ⁶ THP-1 단핵구 RPMI-1640 완전 배지 (RPMI-1640 배지 10 % 혈청, 2 MM의 글루타민과 1X 항생제로 보충, 10 ㎖ / 요리)와 세포가 37로 증가하자 2 일 동안 5 % CO _2에서 C를 °.
3. THP-1 세포를 13 × ¹⁰⁵ 세포 / ml의 밀도에 도달 세포 배양 층류 후드에 배양 접시를 전송하고 부드럽게 침전 세포를 재현 탁하도록 소용돌이했으면.
4. 세포 현탁액을 피펫, 4 분 동안 1,000 rpm으로 (130 XG)에서 15 ㎖의 멸균 튜브와 원심 분리기에 배치합니다. 뜨는을 취소하고 5 ㎖ 신선한, 예비 가온, RPMI-1640 완전한 매체에 THP-1 세포 펠렛을 일시 중지합니다.
5. 혈구와 세포를 열거하고 CEL 희석10 ⁶ 세포 / ㎖로 데워진 RPMI-1640 완전한 매체의 최종 밀도 L 서스펜션
6. (포르 볼 12 - 미리 스테이트 13 - 아세테이트 용액은 디메틸 설폭 사이드에서 제조) 10 ㎖ THP-1 세포 현탁액 (최종 농도 16 NM)에 160 mM의 PMA 주식 1 μl를 추가하고 잘 섞는다. 24 잘 조직 배양 플레이트의 각 웰에 1 ml의 세포 현탁액을 분배하고 12 시간 동안 5 % CO _2와 37 ° C로 유지 인큐베이터에서 접시를 품어.
7. 오래된 매체를 제거, 1 ml의 RPMI-1640 완전한 매체를 데워진 추가하고 세포가 5 % CO _2에서 37 ° C에서 12 시간 동안 복구 할 수 있습니다.
8. 현탁액이 타원형 모양의 THP-1 단핵구 세포가 평평 모양의 스핀들 및 식세포로 분화 졌음을 보장하기 위하여 거꾸로 현미경으로 세포를 관찰합니다. 이 분화 된 세포는 지금 C.을 수행 할 준비가 된 것입니다 글라 브라 감염 연구.

2. C. 준비 글라 브라 & #(160), 세포 현탁액

C. 글라 브라 야생형 균주 BG2는 THP-1 대식 세포를 감염시키기 위해 사용된다. C. 글라 브라 셀 액체 YPD (효모 추출물 (1 %), 펩톤 (2 %), 덱 스트로스 (2 %)) 배지에서 일상적으로 배양 하였다. 단단한 YPD 배지는 배지 고압 증기 멸균 전에 2 %의 한천을 첨가함으로써 제조된다.

1. C.의 문화를 준비하려면 글라 브라가, 멸균, 일회용 루프 한천 플레이트에서 하나의 식민지을 주워와 10 ㎖ YPD 액체 배지에 접종하고 30 ℃에서 (200 rpm)으로 진탕 14 ~ 16 시간 동안 배양
2. 테이블 위에 마이크로 원심에서 5 분 4,000 RPM (1,800 XG)에서 원심 분리기이 문화 (1 ㎖), 멸균 PBS (인산염 완충 식염수, 산도 7.4)와 세 번 세포를 세척하고 1 ㎖의 PBS에 세포 펠렛을 일시 중지합니다.
3. C.의 OD _600을 측정 글라 브라 세포 현탁액 및 2 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 밀도를 얻기 위해 멸균 PBS의 적절한 부피로 희석 (OD ₆₀₀= 0.1). 대안 적으로, 원하는 세포 밀도는 혈구 계를 사용하여 효모 세포를 카운트함으로써 달성 될 수있다.

3. C.와 THP-1 식세포의 감염 글라 브라 셀

1. 50 μL의 C. 추가 THP-1 식세포 (10 ⁶ 세포를 24 웰 배양 플레이트의 웰 당 시드) 0.1의 MOI (감염의 다중성)를 얻어 5 % CO _2와 37 ° C에서 접시를 부화에 글라 브라 세포 현탁액.
2. 가능한 효모 수를 결정하기 위해 50 μL C를 희석 글라 브라 세포 현탁액 멸균 PBS의 100 배와 YPD 고체 배지에 100 μl를 접시. 30 ° C에서 접시를 품어 수동 1-2일 후 나타나는 효모 콜로니의 수를 계산합니다. 이 숫자는, 이제부터는, 0 시간의 C.로 언급 될 것이다 글라 브라 CFUs (콜로니 형성 단위).
3. C.와 THP-1 세포의 2 시간의 공동 배양 한 후 24 - 웰 조직 배양 플레이트를 반전시킴으로써 글라 브라 셀 폐기 배지 INA 저수지 및 nonphagocytosed 세포 C.를 제거하는 예비 가온 멸균 PBS로 가볍게 세 번 씻어 글라 브라 셀. PBS와 부드러운 세척은 THP-1 대식 세포 단일 층에 손상을 초래하지 않고 모든 세포 효모의 완전한 제거를 달성하기 위해 절대적으로 필수적이다.

4. 식민지가 단위 분석을 형성을 통해 식균 작용 속도 및 세포 내 복제의 측정

1. 를 Lyse C. 글라 브라 ₂ O 2 분 동안 잘로부터 대식 파편을 제거하고 마이크로 원심 분리 튜브에 세포 용 해물을 수집 가볍게 긁어 1 ㎖ 무균 H에서 THP-1 마크로파지를 감염. 전체 대식 세포 용해 현미경 검증은 모든 내면화 효모의 복구를 위해 필수적이다.
2. 멸균 PBS에 용해 액의 100 배 희석액을 준비 YPD 고체 배지에 100 μl를 접시 30 ° C에서 접시를 품어
3. 1~2일 후, C.의 수를 수동으로 계산 글라 브라는 AP를 식민지YPD 매체에 peared는 희석 계수 (2 시간의 CFUs)에 거는와 C의 비율을 의미한다 식균 작용의 속도를 계산 다음과 같은 공식을 사용하여 2 시간의 coincubation 후 THP-1 식세포에 의해 섭취되는 글라 브라 셀.
   % 식균 작용은 = [(2 시간에서 CFUs) / (0 H에서 CFUs)] X 100
4. C.의 세포 복제 속도를 측정하려면 THP-1 식세포에서 글라 브라 세포는 점은 감염의 예를 게시 다른 시간에 세포 내 효모를 수집합니다. 4, 6, 8, 10, 12, 24 시간, 3.3-4.3 단계를 반복함에 따라.
5. C.의 배 서바이벌 / 복제를 계산 2 시간 (포식 효모)에 그 어떤 주어진 시점에서 총 CFUs 나누어 THP-1 식세포에서 글라 브라 셀.

5. 공 초점 라스를 사용하여 세포 내 복제 모니터링어 스캐닝 현미경

1. 제 1 절에서 설명하는 단계에 따라 2 ~ 4 잘 챔버 슬라이드의 각 웰에있는 PMA 처리 된 5 × ⁵ THP-1 세포를 배정하고 12 시간 동안 5 % CO _2와 37 ° C에서 알을 품다.
2. 데워진 RPMI-1640 완전 배지와 오래 된 매체를 교체하고 세포를 12 시간 동안 PMA 처리를 복구 할 수 있습니다.
3. GFP를 준비 (녹색 형광 단백질) C.에게 - 태그 글라 브라 세포 현탁액 2 항에서 기술과 1의 MOI에 THP-1 대식 세포에 감염으로. 만약 C. GFP를 표현하는 FITC (플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트)으로 표시 효모 세포는 초기 이벤트가 감염 즉 게시 모니터링하는 데 사용할 수있는 사용할 수없는 글라 브라는 변종. 식균 작용의 속도와 2 시간에 phagolysosomal 성숙.
4. , 5 % CO _2와 37 ° C에서 2 시간 동안 슬라이드를 품어 매체를 삭제하고 무균으로 배를 씻어 신중하게 반전, PBS는 데워진.
5. 500 μL는 RPMI-1640 완전한 메디 데워진 추가음 하나의 슬라이드의 각 실에 22 시간 동안 5 % CO _2와 37 ° C에서 그것을 품어.
6. 2 시간의 C.를 해결하려면 글라 브라에 감염된 THP-1 식세포, 다른 슬라이드의 각 실에 (PBS에서 준비) 3.7 %의 포름 알데히드 500 μl를 추가하고 어둠 속에서 20 분 동안 실온에서 그것을 품어.
7. 워시, PBS로 세 번 슬라이드 500 μL 트리톤-X (0.7 %)를 추가하고, 어둠 속에서 5 분 실온에서 알을 품다.
8. PBS로 세척 슬라이드 배는, 문화의 슬라이드에서 챔버를 제거하고 공기 어둠 속에서 3 ~ 5 분 동안 건조.
9. 정중 기포 형성을 회피 슬라이드 DAPI를 포함 Vectashield 장착 매체 (4 ',6-diamidino-2-페닐 인돌)를 사용하여 커버 슬립을 장착. 부드럽게 킴 와이프로 물기를 제거하고 손톱 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉. 4 ° C에서 사용할 때까지의 어둠에 보관 슬라이드.
10. 반복 THP-1 세포에게 24 시간 후 감염을 처리하기 위해 5.4 5.6-5.9 단계를 반복합니다.
11. 레이저 스캐닝 confo를 이용한 이미지 셀칼 현미경 (60X 기름 침지 목표, DAPI 및 GFP의 얼룩에 대한 405 nm의 및 488 nm에서 여기, 각각).

결과

감염 C.와 PMA 처리 THP-1 대식 세포의 분석 글라 브라 야생형 (중량) 세포는 중량 세포가 2 시간의 coincubation 후 55-65%의 속도로 대 식세포에 의해 포식 것으로 나타났다. 또한, C. 글라 브라 세포는 THP-1 식세포에 의해 살해를 저항 할 수 있었고, 적당한 5을 시행 - THP-1 식세포 ⁸ 공동 배양 24 시간 후 CFUs의 7 배 증가. THP-1 식세포에서 GFP-발현 플라스미드로 형질 전환 된 야생형 세포의 세포 복제는 THP-1 식세포 당 세포 효모 세포의 수가 걸쳐 7-12에 하나 또는 두 증가 상기 공 초점 형광 현미경으로 확인 하였다 24 시간의 (그림 1).

토론

선천성 면역계는 편의적 진균 감염의 조절에 중요​​한 역할을한다. 대 식세포는 섭취와 곰팡이 병원균의 파괴에 의해 방어 항진균제에 기여한다. 따라서, 생존 및 / 또는 대 식세포의 항균 기능을 반작용에 필요한 요인의 해명은 곰팡이 독성 전략에 대한 우리의 이해를 진행합니다. 이러한 상황에서, 우리는 인간 편의적 진균 병원체 C.의 상호 작용을 특성화하기 위해 인간 단구 세포주 THP-1 유래의 대 식세포를 사용하여 시험 관내 세포 배양 모델 시스템을 설립 호스트 식세포 세포와 글라 브라. 이 THP-1 대식 모델 시스템이 성공적 C.를 식별하는 데 사용되었지만 칸디다 ^8의 쥐 모델에서 감쇠 독성을 표시 감소 생존 글라 브라 돌연변이,이 시스템의 그럴듯한 제한, 따라서, 얻어진 결과는 고립 된 상황이고하지 않을 수 있습니다항상 복잡한 포유 동물 숙주의 면역 시스템에 적용 가능. 또한,이 시스템은 살아있는 세포 이미징 방법과는 달리...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
THP-1	American Type Culture Collection	TIB 202	인간 급성 단핵 백혈병 세포주
RPMI-1640	Hyclone	SH30096.01	THP-1 세포 유지를 위해
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P 8139	주의: 위험한
YPD	BD-Difco	242710	Candida glabrata 세포 성장용
포름알데히드	Sigma-Aldrich	F8775	C. glabrata-감염된 THP-1 대식세포의 고정을 위해
인산염 완충 식염수 (PBS)			완충액 (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) 세척용
식염수-시트르산나트륨 (SSC)			세척용 완충액(3M NaCl, 20배 농도의 경우 0.3M 구연산나트륨)
사전 혼성화 완충액			완충액(50% 포름아미드, 5배 Denhardt' s solution, 5x SSC, 1% SDS) 혼성화를 위한
VECTASHIELD 마운팅 매체	Vector Labs	H-1200	컨포칼 현미경 검사용
32P 라벨링 α-dCTP	JONAKI-BARC	LCP-102	시그니처 태그의 방사선 라벨링용
100 mm 조직 배양 접시	Corning	430167	THP-1 세포 배양
24-웰 조직 배양 플레이트	Corning	3527	THP-1 대식 세포에서 C. glabrata 감염 연구를 수행하려면
4 챔버 조직 배양 처리 유리 슬라이드	BD Falcon	REF354104 <	em>C. glabrata< / em> 감염된 THP-1 대식 세포를 이미지화하려면
혈구계	Rohem India		세포 계수
용 탁상용 마이크로 원심 분리기 Beckman	Coulter	Microfuge 18	마이크로튜브의 세포 회전용
탁상용 원심분리기	Remi	R-8C	15ml 튜브의 세포 축소
분광 광도계	Amersham Biosciences	Ultraspec 10	효모 세포의 흡광도를 모니터링하기 위해
플레이트 인큐베이터	Labtech	냉장	C. glabrata 세포 성장
Shaker incubator	New Brunswick	Innova 43	C. glabrata 세포 성장
워터 재킷 CO2  인큐베이터	Thermo Electron Corporation	Forma series 2	THP-1 세포 배양
컨포칼 현미경	Carl Ziess	Ziess LSM 510 meta	C. glabrata 감염된 THP-1 대식세포 관찰
복합 현미경	Olympus	CKX 41	C. glabrata 및 THP-1 대식세포 PCR 기계를 관찰하기 위해
	BioRad	DNA 엔진	입력 및 출력 게놈 DNA 교잡 오븐에서 고유한 태그를 증폭하기 위해
	Labnet	Problot 12S	혼성화를 위해
PhosphorImager	Fujifilm	FLA-9000	하이브리드 멤브레인 스캔용
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort	방사선 표지 서명 태그의 변성용
겔 문서화 유닛	Alphainnontech	Alphaimager	아가로스 겔에서 브롬화 에티듐 염색 DNA를 시각화하기 위해