Method Article

컴퓨터를 이용한 다중 전극 패치 클램프 시스템

DOI:

10.3791/50630

⸱

October 18th, 2013

 , 
1Laboratory of Neural Microcircuitry - Brain Mind Institute, Ecole Polytechnique Federale de Lausanne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다중 전극 패치 클램프 녹음은 복잡한 작업을 구성한다. 여기에서 우리는 실험 단계의 많은 자동화함으로써, 성능과 녹음 수의 질적 향상으로 이어지는 프로세스를 가속화 할 수 방법을 보여줍니다.

Abstract

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패치 클램프 기술은 개별 신경 세포 또는 세포 내 구획에서 전기 활동을 기록하기위한 가장 잘 확립 된 방법 오늘입니다. 그럼에도 불구하고, 안정된 기록을 실현에도 개별 세포에서 상당한 복잡도의 시간 소모적 인 절차 남아있다. 효율적인 정보 표시와 함께 여러 단계의 자동화가 크게 더 큰 신뢰성과 녹음의 큰 숫자를 수행하는 적은 시간 experimentalists 에의을 지원할 수 있습니다. 대규모 기록을 달성하기 위하여, 우리는 가장 효과적인 접근법은 완전히 공정을 자동화하기 위하여 만 실험 단계를 단순화하고 효율적 실험자의 경험 및 비주얼 피드백을 도입하면서 인간의 오류의 가능성을 줄일 수없는 결론 지었다. 이러한 목표를 마음에 담아두고, 우리는 하나의 인터페이스에서 다중 전극 패치 클램프 실험, COMMERC에 필요한 모든 컨트롤을 중앙 집중식으로 컴퓨터를 이용한 시스템을 개발ially 사용할 수있는 무선 게임 패드, 컴퓨터 화면에 실험 관련 정보 및 안내 신호를 표시하는 동안. 여기에서 우리는 우리가 기록 구성을 달성하기 위해 필요한 시간을 감소시키고 실질적으로 동시에 성공적 뉴런 다수의 기록 가능성을 높일 수 시스템의 다른 구성 요소를 설명한다.

Introduction

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마이크로 미터 정밀도로 다수의 사이트를 기록하고 자극하는 능력은 실험적 신경 시스템의 더 나은 이해를 달성하기 위해 매우 유용하다. 대부분의 기술은이를 위해 개발되었습니다 만, 어느 것도 submillivolt 해상도가 서브 스레숄드 활동 및 개별 시냅스 잠재력을 공부에 필수적인 패치 클램프 기술에 의해 달성 할 수 없습니다. 여기에서 우리는 동시에 녹음하고 신경원 연결성의 연구를위한 충분한 정밀도로 각 셀을 다수 자극 겨냥 열두 전극 컴퓨터 보조 패치 - 클램프 시스템의 개발을 포함한다. 많은 다른 애플리케이션이 같은 시스템에 대해 생각 될 수 있지만, 뉴런의 그룹 내에서 가능한 연결의 수가 문제 뉴런의 수의 제곱에 비례하여 성장한다는 관련 시냅스 연결의 연구에 특히 잘 빌려 준다. 따라서, 세 개의 전극 시스템에게 테스트 수 있지만최대 6 개의 연결의 발생과 가장 자주 열두 뉴런을 기록, 단일 한 기록은 최대 132 연결의 발생을 테스트하고 자주 (그림 1) 하나 이상의 다스을 관찰 할 수 있습니다. 연결 수십 동시에 관측 가능 소규모 네트워크의 구성을 분석하고, 그렇지 않으면 1 프로빙 할 수없는 네트워크 구조의 통계적 성질을 유추 ​​할 수있다. 또한, 수많은 세포의 정확한 자극은 시냅스 후 세포 2 모집의 정량화....

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Protocol

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1. 장비 준비

  1. 컴퓨터에서 제어 조작기
    1. 시리얼 포트 (RS-232)를 통해 컴퓨터에 각각의 미세 조작기 컨트롤러 박스를 연결합니다.
    2. 쿼리 및 직렬 포트를 통해 전송 될 수 있도록 설정을 조정, 위치에 대한 명령을 구현합니다. 주어진 속도와 하드웨어 호환성 문제는 C / C + +는 프로그래밍 언어로 추천합니다.
    3. 제로 모터 및 긍정적 인 움직임이 모터로부터 멀리 지향에 대하여 가장 근접한 위치가되도록 매니퓰레이터의 참조 시스템을 표준화한다.
    4. 2mm 시편 초점면 (좌표 [0, 0, 2000]) 위의 중앙 위치에 현미경을 배치합니다.
    5. 상점, 각 조작기 들어 피펫 팁이 현미경의 시야의 중심에서 관찰 될 수 있도록 로컬 좌표. 이것은 각 전극의 초기 기준점이다.
  2. 기기, 비즈니스LIZE 전극 포지션.이 실험 중에 각 전극의 위치를 추적 할 수 있어야하는 것은 매우 유용하다. 그래픽 표현이 달성의 가장 직관적 인 방법입니다. 이를 위해 기준 각 전극의 시스템과 현미경의는 일치해야합니다. 이를위한 간단한 방법이다 :
    1. 시야의 중심 전극의 선단을 가져온다.
    2. 매니퓰레이터의 각....

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Results

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상술의 방법으로 우리는 다음 거의 동시에 신경 세포의 큰 숫자 패치 클램프 따라서 작게 배로 동시에 최대 열두 뉴런의 전체 - 세포의 기록을 행하는 것에 성공. 쥐의 체 감각 피질의 레이어 V에 기록 된 피라미드 뉴런 사이의 직접 시냅스 연결의 네트워크의 예는 그림 6에 나와 있습니다.

주어진 세포 유형에 대한 간 체세포의 거리의 함수로서 접속 확률 정보의 판정은 다중 전극 패치 - 클램프 시스템 (1)을 효율적으로 수행 할 수있는 그 대표적인 측정이다. 최근 사진 자극은 데이터 3,4를 얻는 훨씬 더 효율적인 방법으로 표시하기 시작했다. 중요하게, 그러나, 다중 전극 패치 - 클램프 시스템으로 취득한 데이터는 실험자가 더욱 연구중인 네트워크의 맵핑뿐만 아니라 인트라 가진 고해상도 염색을 얻을 수세포는 염료를 확산. 다중 전극 패치 클램프 실험에서 모든 세포는 종종 사진 자극 칼슘 이미징과 같은 다른 기술의.......

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Discussion

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즉각적인 문제는 우리가 일반적으로 기술 된 과정 성공률 관한 생긴다. 높은 성공률에 대한 준비는 필수적이다. 피펫은 기록 된 세포의 존재에 대한 적절 팁 구멍이 있어야합니다. 막힌 피펫을 피하기 위해 세포 내 액을 여과하는 것도 중요하다. 매우 깨끗하고, 갓 뽑아 피펫은 다른 요구 사항입니다. 이항 분포는 이러한 문제를 최종 수율에 영향을 미치는 방법을 이해하는 데 사용할 수있는 간단한 모델입니다. 그것은 80 % 시각적 피드백 개별 뉴런을 기록 더의 성공률을 달성하기 위해 경험과 적절한 장비와 실험을 기대하는 것이 합리적이다. 초보자 중요한 준비 단계가 간과 특히, 매우 낮은 성공률을 달성 할 것으로 예상 할 수있다. 이 비율은 실험 당 기록 된 세포의 숫자가 변환되는 방법을 그림 10에서 볼 수 있습니다. 동시에 패치 조개의 수 또한 증가PED 신경 가능성이 조작기의 소형화와 차례로 세부 사항에 상당한주의를 필요로하는 절차의 신뢰성 향상을 필요로하지만, 완전히 실현 가능한 것입니다.

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Disclosures

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 패치 클램프 절차의 자동화를위한 개선에 유용한 조언을 길 라드 Silberberg 다음, 미셸 피나 텔리, 토마스 K. 버거, 루카 Gambazzi 및 소니아 가르시아에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 가치있는 조언과 소프트웨어 구현에 대한 지원은 Rajnish 란잔 감사합니다. 이 작품은 유럽 연합 (EU) 시냅스의 프로젝트에 의해 부분적으로 인간 프론티어 과학 프로그램에 의해 부분적으로 투자되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
현미경OlympusBX51WI40X Immersion Objective
ManipulatorsLuigs NeumannSM-5Serial protocol used
증폭기Axon InstrumentsMultiClamp 700BSDK used
CameraTill PhotonicsVS 55BNC analog output
FramegrabberData TranslationDT3120SDK used
오실로스코프TektronixTDS 2014시리얼 통신
데이터 수집InstruTECHITC 1600
데이터 수집National InstrumentsPCI-6221사용 라이브러리 (.dll)
압력 밸브SMCSMC070C-6BG-32
압력 센서Honeywell24PCDFA6G
멤브레인 펌프SchegoOptimal

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
  2. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS ....

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Tags

Patch ClampMulti electrode RecordingComputer assisted SystemWhole Cell ModeNeuronal Network AnalysisPipette PositioningGiga Seal FormationSynaptic Connectivity MappingWireless Gamepad ControlVisual Feedback Interface

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