유동 세포 계측법 및 현미경에 따라 두 개의 보완적인 방법은 효모에서 MAPK 경로의 활성화에 의해 유도되는 유전자 발현의 역학의 단일 세포 수준에서 정량을, 가능하게하는 표시됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
단일 세포 수준에서의 유전자 발현의 정량화는 집단 수준에서 수행되는 측정에 가려진 신규 규제 메커니즘을 폭로. 두 가지 방법 현미경을 기반으로 유동 세포 계측법은 이러한 데이터를 취득 할 수있는 방법을 보여주기 위해 제공됩니다. 효모에서 고 삼투압 글리세롤 MAPK 경로의 활성화시에 유도 된 형광 리포터의 발현은 예로서 사용된다. 각 방법의 구체적인 장점은 강조 표시됩니다. 계측법 다수의 셀 (10000)을 측정하고 형광 단백질의 성숙 느린 동역학 독립적 단백질 발현의 역학의 직접적인 측정을 제공 흐른다. 현미경으로 살아있는 세포의 영상이 적은 세포에서 기자의 성숙 형태의 측정에 한정 대조적입니다. 그러나,이 기술에 의해 생성 된 데이터 세트는 여러 기자의 조합 및 시공간 정보에 매우 풍부 감사 될 수각각의 세포에서 얻은. 이 두 가지 측정 방법의 조합은 신호 전달 경로에 의해 단백질 발현의 조절에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
서론
전달 폭포를 통해 신호는 종종 단백질의 발현에 절정. 이 발현 프로파일의 특성화는 생물학적 경로의 기능을 이해하는데 중요한 요소이다. 위로 통제 단백질과 그들의 활성화의 역학의 스펙트럼의 식별은 마이크로 어레이, 북부 오 또는 서부 오 1-3와 같은 다양한 기술에 의해 달성 될 수있다. 그러나, 이러한 기술은 세포의 전체 모집단의 응답을 평균. 단백질 발현의 미세 조절을 이해하기 위해, 단일 세포 수준에서 측정을 수집하는 것이 바람직하다. 이상적으로, 이러한 측정은 기본 경로의 수학적 모델을 개발하는 의무가 정량적 데이터를 제공해야합니다.
현미경 및 유동 세포 계측법 이상적으로 이러한 양적 단일 세포 측정을 제공하기 위해 적합한 두 가지 기술이다. 형광 단백질과 단백질의 내생 태그는 B 수전자 발현 레벨 4를 정량화하는 데 사용됩니다. 단백질의 말단에 큰 형광 부분의 첨가는 비 기능을 렌더링 할 수 있기 때문에 그러나, 형광 구조체의 발현을 구동 프로모터에 따라 특정 식 기자를 생성하는 것이 더욱 바람직하다. 이 기자의 단백질은 셀룰러 시스템에 외생 적이며, 따라서 세포에서 일어나고있는 신호 이벤트에 영향을주지 않습니다.
현미경 및 유동 세포 계측법 모두 널리 효모 신호 분야에서 사용되어왔다. 예로서, 콜먼 - 러너와 동료는 상관 관계, 하나의 세포, 효모 짝짓기 신호 전달 캐스케이드 5의 노이즈를 정량화하기 위해 현미경으로 구체적이고 구조적으로 표현 기자 짝짓기의 표현, ACAR 및 규제 네트워크를 연구하는 유동 세포 계측법을 사용하는 동료 GAL 6 유전자의 발현을 제어한다. 이전 연구 7에서, 우리는 combinati을 사용했습니다높은 삼투압 글리세롤 효모 신진에서 (HOG) 경로에서 표현의 출력을 연구하는이 두 기술에. 이 미토 겐 활성화 단백질 키나제 (MAPK) 경로는 하이퍼 삼투압 스트레스에 의해 트리거된다. 그것은 약 300 유전자의 발현 결과 전사 프로그램을 유도하는 세포의 핵으로 옭 Hog1 MAPK의 활성화를 초래한다. 이 과정을 연구하기 위해, 우리는 배 금성 형광 단백질 (P의 STL1-QV)의 발현을 구동 STL1 프로모터 (Hog1 활동 8에 대한 응답으로 구체적으로 유도하는 유전자)를 기반으로 식 기자를 설계했다. 측정은 형광 기자를 표현하는 인구의 비율과 중간 스트레스 수준 (0.1 M의 NaCl)에서 세포의 두 집단의 존재를 발견 유동 세포 계측법. 우리는 더 이상이 문제를 조사하기 위해 현미경을 사용하고 단백질 발현이 노이즈가 고유 요인 (9)에 의해 지배 된 것을 발견했다. 우리는 기LD 더욱 Hog1 활동의 유사한 수준의 세포가 현저하게 상이한 발현 결과를 표시 할 수 있다는 것을 관찰한다. 이 두 기술의 조합은 우리가 스트레스 반응 유전자의 느린 리모델링이 하나의 셀 레벨 7의 발현 결과에 영향을 방법을 설명 할 수있었습니다.
이 논문에서, 우리는 현미경에 의한 단백질 발현의 정량의 예를 들어 하이퍼 삼투 충격에 의해 유도 된 P STL1-QV 기자의 표현을 사용하고 유동 세포 계측법. 0.2 M의 NaCl 스트레스 대상이 같은 변형은 두 가지 방법으로 연구 하였다. 이것은 우리가 이러한 상호 보완적인이 두 기술의 몇 가지 주요 차이점을 강조 할 수 있습니다.
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프로토콜
1. 현미경 측정
- 효모와 합성 배지 5 ㎖를 접종한다.
- 하룻밤 30 ° C에서 세포를 성장.
- 다음날 아침 밤새 문화의 OD 600을 측정합니다.
- 600 0.05 과다 복용 5 ㎖ 합성 배지에서 하룻밤 문화를 희석.
- 최소 4 시간 동안 30 ° C에서 희석 문화를 성장.
- 준비 3 배 합성 배지 (0.6 M) NaCl 용액 집중.
- PBS에서 인 Concanavalin A (CONA)의 1 ㎎ / ㎖의 솔루션을 준비합니다.
- 여과 액 ~ 잘 슬라이드에 CONA 용액 200 μL.
- 30 분 동안 서 보자.
- CONA 솔루션을 제거합니다.
- 웰에 150 μL의 H 2 O를 추가합니다.
- H 2 O를 제거
- 세포 배양의 OD 600을 측정합니다.
- 1.5 ml의 마이크로 튜브에 = 0.02 OD 600에서 세포 배양의 300 μl를 준비합니다.
- 45 초 동안 수욕에서 초음파 처리 셀.
- 소용돌이 짧게 마일crotube.
- 45 초 동안 수욕에서 초음파 처리 셀.
- 간단히 소용돌이 모세관.
- 우물에 세포 배양 200 μl를 추가합니다.
- 세포가 우물의 바닥에 정착하도록 30 분을 기다립니다.
- 현미경에 잘 슬라이드를 놓습니다.
- 기록 될 채널에 대한 형광 조명 세팅을 선택한다.
- (: 세포의 적절한 분할 수 있도록 초점면 아래의 3 μm의 약간 초점의 하나) 두 명 시야 이미지의 조명 설정을 선택합니다.
- 시간 경과 측정 시간 간격을 선택
- 이미지 뷰의 필드를 선택합니다.
- 몇 프레임의 인수를 시작합니다.
- 0.6 M의 NaCl 매체의 100 μl를 추가 인수를 일시 중지합니다.
- 영상을 다시 시작합니다.
2. 유동 세포 계측법 측정
- 효모와 합성 배지 5 ㎖를 접종한다.
- 하룻밤 30 ° C에서 성장.
- 측정OD 하룻밤 문화의 600 다음날 아침.
- 600 0.1 과다 복용 5 ㎖ 합성 배지에서 하룻밤 문화를 희석.
- OD 0.2 ~ 0.4의 600에 도달하기 위해 최소 4 시간 동안 30 ° C에서 성장.
- H 2 O에서 사이클로 헥시 미드 용액을 1 ㎎ / ㎖를 준비
- 준비 3 배 합성 배지 (0.6 M) NaCl 용액 집중.
- 측정 할 때마다 포인트 0.6 M의 NaCl 매체의 100 μL와 하나의 1.5 ML 마이크로 튜브를 준비합니다.
- 시간 0에서, 각각의 마이크로 튜브에 세포 배양 200 μl를 추가합니다.
- 30 ℃에서 진탕 배양한다
- 시간 t에서, 마이크로 튜브에 30 μL의 사이클로 헥시 미드를 추가합니다.
- 원하는 모든 시점에 2.11 단계를 반복합니다.
- 적어도 45 분 동안 모든 마이크로 튜브를 품어 떨고와 30 ° C에서 최대 3 시간.
- 400 ㎕의 PBS와 FACS 튜브를 준비합니다.
- 1 분 동안 수욕에서 초음파 처리 셀.
- 간단히 소용돌이 모세관.
- 아들1 분 동안 수욕 세포 icate.
- 간단히 소용돌이 모세관.
- 각 모세관에서의 대응 FACS 튜브에 100 ㎕의 세포 배양을 추가합니다.
- 검출을위한 488 nm의 여기 레이저와 30분의 530 nm의 대역 통과 필터를 선택합니다.
- 테스트가 아닌 표현과 완전히 그들이 검출기 감도 범위에 빠지고 있는지 확인하기 위해 샘플을 표현.
- 획득 한 각 샘플에 대한 10,000 세포를 측정한다.
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결과
현미경 사용
발현 리포터 P STL1-QV (ySP9 7) 베어링 효모 세포는 잘 슬라이드 하단에 부착되고, 현미경하에 넣었다. 세포 이미징 세션 도중에 직접 우물에 응력 매체의 첨가에 의해 자극 하였다. 이것은 우리가 통로 유도하기 전에 세포의 몇 가지 이미지를 획득하고 자극 후 자신의 운명을 수행 할 수 있습니다. 본 경우에, 세포를 10 분의 시간 간격으로 1 ~ 2 시간 동안 관찰 하였다.도 1a는 유도 및도 1b 전에 비 - 형광 세포의 이미지가 발현 리포터가 가지는 2 시간 스트레스 후에 동일한 셀에게 표시 유도 된 형광되고있다.
이러한 이미지에 존재하는 정량적 정보를 추출하기 위해 복잡한 이미지 분석 처리가 수행되어야한다. 그것은 I의 객체를 정의하는 세포의 분할을 포함한다마법사, 다음에 하나의 프레임에서 이러한 객체의 추...
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토론
현미경 사용
CONA와 잘 치료는 세포의 적절한 이미징을 보장하는 필수 단계이다. CONA은 PBS (5 ㎎ / ㎖)에서 낮은 용해도를 갖기 때문에, 여과 처리 수는 여과되지 않은 용액에 존재하고 촬상 방해 큰 응집물의 제거. 세포는 처리 된 표면에 비교적 강하게 부착하고 유도 용액의 첨가는 자극 전후 지속적인 추적을 허용 세포의 현지화를 방해해서는 안된다. 세포는 정 유량 7,15을 실시 하였다이 치료는 또한 마이크로 유체 소자 채널 또는 흐름에 적용될 수있다. 확실히이 제대로 처리 후에 물로 세정하지 않으면 용액 CONA이 세포에 직접 결합 및 유리 표면에 강한 결합을 형성하는 것을 방해 아마도 때문에, 세포는 유리에 적절히 부착되지 것이다. 세척 단계 후, 잘은 3 건조 남아있을 수 있습니다 -띄게 유리 세포의 결합에 영향을주지 않고 세포를 첨가하기 전에 4 시간.
형광 채널에 대한 노출 시간의 선택은 실...
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
저자는 마티아스 베드로와 이러한 방법이 개발되었다 취리히의 ETH에서 생화학 연구소에서 자신의 그룹을 감사합니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | |||
| 효모 질소 염기 | CYN6202 | ||
| CSM 아미노산 혼합 | 용Medium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | 독성 |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| 현미경 제어 소프트웨어 | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| 배양 챔버 | LIS | The Box | |
| 형광 광 source | Lumencor | SpectraX | |
| 카메라 | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| 유세포 분석기 | BD | FACS calibur | |
| Sonicator 욕조 | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-웰 슬라이드 | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-웰 플레이트 | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS 튜브 | BD 팔콘 | 352054 | |
참고문헌
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Wu, J. -Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
- Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
- de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100(2006).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18(2008).
- Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).
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