Method Article

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

DOI:

10.3791/50637

⸱

October 4th, 2013

 ,  , 
1Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유동 세포 계측법 및 현미경에 따라 두 개의 보완적인 방법은 효모에서 MAPK 경로의 활성화에 의해 유도되는 유전자 발현의 역학의 단일 세포 수준에서 정량을, 가능하게하는 표시됩니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단일 세포 수준에서의 유전자 발현의 정량화는 집단 수준에서 수행되는 측정에 가려진 신규 규제 메커니즘을 폭로. 두 가지 방법 현미경을 기반으로 유동 세포 계측법은 이러한 데이터를 취득 할 수있는 방법을 보여주기 위해 제공됩니다. 효모에서 고 삼투압 글리세롤 MAPK 경로의 활성화시에 유도 된 형광 리포터의 발현은 예로서 사용된다. 각 방법의 구체적인 장점은 강조 표시됩니다. 계측법 다수의 셀 (10000)을 측정하고 형광 단백질의 성숙 느린 동역학 독립적 단백질 발현의 역학의 직접적인 측정을 제공 흐른다. 현미경으로 살아있는 세포의 영상이 적은 세포에서 기자의 성숙 형태의 측정에 한정 대조적입니다. 그러나,이 기술에 의해 생성 된 데이터 세트는 여러 기자의 조합 및 시공간 정보에 매우 풍부 감사 될 수각각의 세포에서 얻은. 이 두 가지 측정 방법의 조합은 신호 전달 경로에 의해 단백질 발현의 조절에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전달 폭포를 통해 신호는 종종 단백질의 발현에 절정. 이 발현 프로파일의 특성화는 생물학적 경로의 기능을 이해하는데 중요한 요소이다. 위로 통제 단백질과 그들의 활성화의 역학의 스펙트럼의 식별은 마이크로 어레이, 북부 오 또는 서부 오 1-3와 같은 다양한 기술에 의해 달성 될 수있다. 그러나, 이러한 기술은 세포의 전체 모집단의 응답을 평균. 단백질 발현의 미세 조절을 이해하기 위해, 단일 세포 수준에서 측정을 수집하는 것이 바람직하다. 이상적으로, 이러한 측정은 기본 경로의 수학적 모델을 개발하는 의무가 정량적 데이터를 제공해야합니다.

현미경 및 유동 세포 계측법 이상적으로 이러한 양적 단일 세포 측정을 제공하기 위해 적합한 두 가지 기술이다. 형광 단백질과 단백질의 내생 태그는 B 수전자 발현 레벨 4를 정량화하는 데 사용됩니다. 단백질의 말단에 큰 형광 부분의 첨가는 비 기능을 렌더링 할 수 있기 때문에 그러나, 형광 구조체의 발현을 구동 프로모터에 따라 특정 식 기자를 생성하는 것이 더욱 바람직하다. 이 기자의 단백질은 셀룰러 시스템에 외생 적이며, 따라서 세포에서 일어나고있는 신호 이벤트에 영향을주지 않습니다.

현미경 및 유동 세포 계측법....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 현미경 측정

  1. 효모와 합성 배지 5 ㎖를 접종한다.
  2. 하룻밤 30 ° C에서 세포를 성장.
  3. 다음날 아침 밤새 문화의 OD 600을 측정합니다.
  4. 600 0.05 과다 복용 5 ㎖ 합성 배지에서 하룻밤 문화를 희석.
  5. 최소 4 시간 동안 30 ° C에서 희석 문화를 성장.
  6. 준비 3 배 합성 배지 (0.6 M) NaCl 용액 집중.
  7. PBS에서 인 Concanavalin A (CONA)의 1 ㎎ / ㎖의 솔루션을 준비합니다.
  8. 여과 액 ~ 잘 슬라이드에 CONA 용액 200 μL.
  9. 30 분 동안 서 보자.
  10. CONA 솔루션을 제거합니다.
  11. 웰에 150 μL의 H 2 O를 추가합니다.
  12. H 2 O를 제거
  13. 세포 배양의 OD 600을 측정합니다.
  14. 1.5 ml의 마이크로 튜브에 = 0.02 OD 600에서 세포 배양의 300 μl를 준비합니다.
  15. 45 초 동안 수욕에서 초음파 처리 셀.
  16. 소용돌이 짧게 마일crotu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

현미경 사용

발현 리포터 P STL1-QV (ySP9 7) 베어링 효모 세포는 잘 슬라이드 하단에 부착되고, 현미경하에 넣었다. 세포 이미징 세션 도중에 직접 우물에 응력 매체의 첨가에 의해 자극 하였다. 이것은 우리가 통로 유도하기 전에 세포의 몇 가지 이미지를 획득하고 자극 후 자신의 운명을 수행 할 수 있습니다. 본 경우에, 세포를 10 분의 시간 간격으로 1 ~ 2 시간 동안 관찰 하였다.도 1a는 유도 및도 1b 전에 비 - 형광 세포의 이미지가 발현 리포터가 가지는 2 시간 스트레스 후에 동일한 셀에게 표시 유도 된 형광되고있다.

이러한 이미지에 존재하는 정량적 정보를 추출하기 위해 복잡한 이미지 분석 처리가 수행되어야한다. 그것은 I의 객체를 정의하는 세포의 분할을 포함한다마법사, 다음에 하나의 프레임에서 이러한 객체의 추.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

현미경 사용

CONA와 잘 치료는 세포의 적절한 이미징을 보장하는 필수 단계이다. CONA은 PBS (5 ㎎ / ㎖)에서 낮은 용해도를 갖기 때문에, 여과 처리 수는 여과되지 않은 용액에 존재하고 촬상 방해 큰 응집물의 제거. 세포는 처리 된 표면에 비교적 강하게 부착하고 유도 용액의 첨가는 자극 전후 지속적인 추적을 허용 세포의 현지화를 방해해서는 안된다. 세포는 정 유량 7,15을 실시 하였다이 치료는 또한 마이크로 유체 소자 채널 또는 흐름에 적용될 수있다. 확실히이 제대로 처리 후에 물로 세정하지 않으면 용액 CONA이 세포에 직접 결합 및 유리 표면에 강한 결합을 형성하는 것을 방해 아마도 때문에, 세포는 유리에 적절히 부착되지 것이다. 세척 단계 후, 잘은 3 건조 남아있을 수 있습니다 -띄게 유리 세포의 결합에 영향을주지 않고 세포를 첨가하기 전에 4 시간.

형광 채널에 대한 노출 시간의 선택은 실.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 마티아스 베드로와 이러한 방법이 개발되었다 취리히의 ETH에서 생화학 연구소에서 자신의 그룹을 감사합니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 지원되었다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약
효모 질소 염기CYN6202
CSM 아미노산 혼합용MediumDCS0011
Concanavalin AGE Healthcare17-0450-01
CycloheximideFluka Aldrich SigmaC7698독성
ySP9W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
MicroscopeNikonTi-Eclipse
현미경 제어 소프트웨어Micro-managerVer 1.4.11
배양 챔버LISThe Box
형광 광 sourceLumencorSpectraX
카메라HamamatsuFlash 4.0
유세포 분석기BDFACS calibur
Sonicator 욕조TelesonicTUC-150
8-웰 슬라이드 Thermo Lab-tek155409
96-웰 플레이트Matrical bioscienceMGB096-1-2-LG
FACS 튜브BD 팔콘352054
중

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
  2. de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MAPK PathwayYeast CellsFluorescent ReporterFlow CytometryLive Cell MicroscopySingle Cell AnalysisProtein ExpressionCycloheximide TreatmentTime Lapse ImagingGene Expression

Related Articles