생물막의 세포 및 세포 외 성분의 동시 정량화

Summary

생물막 내 3개의 세포 및 세포 외 구성 요소를 동시에 정량화하고 비교하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법론에는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경, 생물막 구조 분석 및 시각화 소프트웨어, 통계 분석 소프트웨어의 사용이 포함됩니다.

Abstract

컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)은 생물막 조사를 위한 강력한 도구입니다. 1) 스펙트럼 겹침이 최소화된 형광 염료의 선택은 복잡하고 2) 여러 형광 색소의 정량화는 다요인 문제를 제기하기 때문에 생물막 내에서 두 가지 이상의 성분의 동시 분포를 성공적으로 정량화한 연구는 거의 없습니다. 목표: 관련 기질에서 성장한 생물막의 3가지 세포/세포 외 구성 요소의 동시 3차원 분포를 정량화하고 비교하는 방법론을 보고합니다. 방법: 이 방법은 생물막 성장, 염색, CLSM 이미징, 생물막 구조 분석 및 시각화, 구조 매개변수의 통계 분석을 포함하는 별개의 상호 연결된 단계로 구성됩니다. Streptococcus mutans (균주 UA159)의 생물막을 Point 4 및 TPH³ 수지 복합체의 멸균 표본에서 48 시간 동안 성장시켰다. 그 후 검체를 Biotène PBF(BIO) 또는 Listerine Total Care(LTO) 구강 세정제 또는 물(대조군, n=5/그룹)에 60초 동안 담가두었습니다. 생물막은 CLSM으로 이미징하기 전에 세포 외 고분자 물질, 단백질 및 핵산에 대한 형광 색소로 염색되었습니다. ISA3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 계산된 생물막 구조 매개변수는 생체 부피와 평균 생물막 두께였습니다. 혼합 모델, 통계 분석, 구강 세정제와 대조군 간의 구조적 매개변수를 비교했습니다(SAS 소프트웨어, α=0.05). Volocity 소프트웨어를 사용하면 오버레이된 생물막 구성 요소(형광 색소)의 3D 분포를 시각화할 수 있었습니다. 결과: 구강 세척제 BIO는 두 수지 복합재 모두에서 대조군(p<0.05)과 크게 다른 생물막 구조를 생성한 반면, LTO는 두 제품 모두에서 차이(p>0.05)를 생성하지 않았습니다. 결론: 이 방법론은 관련 기질에서 S. mutans 생물막 내 세 가지 주요 성분의 동시 3D 분포를 효율적이고 성공적으로 정량화하고 비교하여 생물막 성분의 동시 평가에 대한 두 가지 과제를 극복했습니다. 이 방법은 구강 세정제를 사용하여 표시된 것처럼 여러 생물막 성분에 대한 항균/방오제의 효능을 결정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 게다가, 이 방법에는 다양한 분야에 있는 biofilms의 3D 구조/건축술의 비교를 촉진하기 때문에 넓은 응용이 있습니다.

Introduction

생물막은 자가 생산된 세포외 기질에 캡슐화되어 생물학적 또는 불활성 표면에 부착된 구조화된 미생물 군집입니다¹. 생물막은 많은 박테리아의 일반적인 생활 방식을 나타내며 자유 부유(플랑크톤) 세포에서 복잡한 다종 군집으로 단계적으로 전환하여 형성됩니다. 항균제에 대한 생물막의 고유한 내성은 구강 생물막(치태)에 의해 입증된 바와 같이 많은 지속적이고 만성적인 박테리아 감염^1,2의 근원입니다. 돌연변이 연쇄상 구균과 같은 충치 성 미생물은 자당 및 기타 탄수화물을 처리하여 세포 외 기질을 생성하고 치아 구조를 탈염시키고 충치를 유발할 수 있는 산을 생성합니다. 대부분의 생물막 매트릭스는 외다당류(EPS), 단백질 및 핵산과 같은 세포 및 세포 외 구성 요소로 구성된 생체 고분자입니다^3,4.

형광 이미징에 가장 널리 사용되는 기술인 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)은 고정 없이 수화된 생물학적 구조의 3D 이미지를 수집할 수 있기 때문에 생물학에서 광학 이미징을 근본적으로 변화시켰습니다^5,6,7. 이 비파괴 기술은 초점이 맞지 않는 빛의 기여를 제거하는 방식으로 표본의 관심 영역 내에서 얇은 부분의 이미지를 수집하는 것을 포함합니다. CLSM으로 캡처한 이미지의 품질과 해상도는 광시야 형광 현미경을 사용하여 달성할 수 있는 것 이상입니다. CLSM의 주요 단점 중 하나는 전체 이미지가 동시에 수집되는 광시야 현미경 기술보다 느린 속도로 이미지 스캔이 발생한다는 것입니다⁵. 그러나 형광 색소, 레이저 및 필터의 선택이 확대됨에 따라 CLSM은 다중 스펙트럼 이미징^5,7을 위한 일반적인 기술 중 하나가 되었습니다.

이전 연구는 CLSM가 하나 또는 두 개의 형광 태그 또는 염색을 사용하여 생물막의 구조 또는 구조를 검사하는 데 유용한 도구임을 보여 주어 생물막 내에서, 특히 세포외 기질^7,8 내에서 EPS 및 세포의 분포에 대한 더 나은 이해를 제공합니다. 이론적으로 여러 구성 요소의 형광 염색/라벨링은 생물막 내 세포 및 세포 외 구성 요소의 상세한 구조와 공동 국소화를 탐구하는 데 바람직합니다. 그러나 생물막 내의 다양한 성분을 동시에 분석하는 것은 1) 스펙트럼 중복이 최소화된 형광 염료의 선택이 복잡하고 2) 여러 형광 색소의 정량화가 다요인 문제를 제기하기 때문에 어려울 수 있습니다. 여러 형광 색소를 사용한 공동 국소화는 두 개의 형광 색소가 스펙트럼 피크에서 상당한 중복을 가질 때 발생하는 블리드 스루 효과를 피하기 위해 스펙트럼 간섭을 최소화한 매우 특이적인 염색을 사용해야 합니다⁹. 이상적으로는 겹치지 않는 여기 스펙트럼을 가진 형광 색소가 최상의 결과를 제공하지만 이 기준을 충족하는 염색을 찾는 것은 매우 어렵습니다. 대신, 방출 스펙트럼이 최소한의 중복을 갖는 형광 색소를 선택하여 염색 선택이 최적화되어 제한된 관찰 파장 대역⁹ 내에서 염색을 하나씩 볼 수 있습니다.

형광 이미지의 중첩은 아마도 형광 색소의 동시 분포를 평가하는 데 가장 널리 사용되는 방법일 것입니다. 다양한 성분의 공동 국소화(colocalization)는 검사 중인 형광 색소에 의해 생성된 다중 채널을 통해 서로 다른 색상의 중첩으로 나타납니다¹⁰. 다중 채널 형광 이미지를 병합된 컬러 이미지로 표시하는 도구는 대부분의 CLSM 소프트웨어 및 생물학적 이미지 분석 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다. 이미지의 중첩은 공동 국소화의 공간 평가에 유용하지만 이미지는 시각적 분석을 통해서만 정성적으로 검사할 수 있습니다. 이러한 표현은 일반적으로 다른 실험 조건에서 공동 국소화를 정량화하는 데 도움이 되지 않으며 공동 국소화가 무작위 우연의 일치¹¹를 초과하는지 여부를 결정하지 않기 때문에 제한된 양의 정보를 제공합니다. 지금까지 생물막 및 생물막 성분의 3차원 구조를 분석하기 위해 정량적 방법을 사용한 연구는 거의 없었으며, 생물막 성분에 대한 항균 처리 또는 방오 조치의 효과를 정량화한 연구는 더욱 적었습니다.

이 연구의 목적은 생물막의 3가지 세포 및 세포 외 구성 요소의 동시 3차원 분포의 정량화 및 비교를 위한 방법론을 보고하는 것이었습니다. 이 방법은 생물막 성장, 염색, 생물막의 CLSM 이미징, 생물막 구조 분석 및 시각화, 구조 매개변수의 통계 분석을 포함하는 별개이지만 상호 연결된 단계로 구성됩니다. 생물막 성장 분석은 관련 기질에서 생물막 성장을 허용하고 재현 가능한 생물막 구조를 생성합니다. EPS, 단백질 및 핵산 성분의 새로운 동시 염색과 3D 생물막 구조 매개변수 측정의 조합은 생물막 내 성분의 정량화 가능한 분포를 가져옵니다. 생물막 구조 매개변수의 통계적 분석은 다음 섹션에서 설명하는 것처럼 특정 실험 조건(예: 구강 세정제 처리 후)에서 생물막의 평가를 용이하게 합니다.

Protocol

1. 배지 및 시약의 준비

1. 300ml의 하룻밤 배양 배지(THY, 초순수에 0.3% 효모 추출물이 보충된 제조업체의 지침에 따라 준비된 3% Todd Hewitt 육수)와 오토클레이브를 만듭니다. 실온에서 최대 2개월까지 보관하세요.
2. 1L THY 한천(초순수에 토드 휴이트 육수 3%, 효모 추출물 0.3%, 한천 1.5%)을 만들고 오토클레이브한 다음 페트리 접시에 붓기 전에 60°C로 식힙니다. 4°C에서 최대 3개월까지 보관합니다.
3. 150ml의 생물막 성장 배지(10mM 자당이 보충된 0.5X TY, 초순수에 1.5% 트립톤, 0.5% 효모 추출물 및 10mM 자당)를 만들고 여과 살균합니다. 실온에서 최대 1개월까지 보관하세요.
4. 1L 인산염 완충 식염수(PBS, 초순수에서 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na₂HPO₄ 및 0.24g KH₂PO₄)와 오토클레이브를 만듭니다. 실온에서 몇 달 동안 보관하십시오.
5. 초순수(TC 완충액, pH 7.2) 및 오토클레이브에서 10mM CaCl₂가 보충된 600ml 10mM Tris HCl 완충액을 만듭니다. 실온에서 몇 달 동안 보관하십시오.
6. 오토클레이브 1L 초순수. 실온에서 몇 달 동안 보관하십시오.

2. 시편 제작

1. Point 4 (PF) 및 TPH³ (TP) 치과 수지 복합재의 디스크 모양 시편을 맞춤형 스테인리스 스틸 금형에서 두 번에 걸쳐 제작합니다. 각 증분은 LED 광경화 장치를 사용하여 40초 동안 광경화됩니다. 두 제품은 조성과 필러 수준이 약간 다르기 때문에 생물막이 자랄 수 있는 서로 다른 표면 지형을 생성합니다.
   1. 관련 기질의 표본은 2.1단계 대신 다른 분야의 확립된 프로토콜을 사용하여 제작할 수 있습니다.
2. 허용 가능한 최종 표면 마감으로 시편을 마무리하고 연마합니다(예: 반자동 그라인더-폴리셔 사용). 연마된 시편을 초순수로 헹구고 압축 공기를 사용하여 건조시킵니다.
3. 에틸렌 옥사이드 가스 또는 대체 멸균 방법을 사용하여 검체를 멸균합니다.

3. 생물막 성장

1. S. mutans의 단일 콜로니를 4ml 야간 배양 배지에 접종합니다(1.1단계). 37 ° C에서 16-18 시간 동안 밤새 배양하십시오. 배양물의 광학 밀도(OD₆₀₀)는 ≥0.9여야 합니다.
   1. 원래 스톡에서 2x 통과한 플레이트 배양물의 콜로니를 사용하는 것이 가장 좋은데, 이는 보다 일관된 생물막 성장을 초래하기 때문입니다.
2. 10ml의 생물막 성장 배지(1.3단계)에서 하룻밤 배양(1.1단계)을 사용하여 1:100 희석액을 생성합니다.
3. 멸균 수지 복합 시료(예: PF, TP)를 멸균 12웰 플레이트로 옮깁니다.
4. 2.5ml의 희석 배양 배지(3.2단계)를 처리(구강 세척제) 및 대조군을 위해 웰에 추가합니다. 멸균 제어 웰에 2.5ml의 멸균 미접종 생물막 성장 배지를 추가합니다.
5. microaerophilic 조건에서 생물막을 성장시킵니다. 37°C의 인큐베이터 내부에서 100rpm의 셰이커에 플레이트를 24시간 동안 놓습니다.
6. 24 시간 후에, 모든 우물에서 매체를 무균으로 흡인하고 각 세척 후에 PBS를 흡인하는 메마른 PBS (단계 1.4; 2.5 ml/well)로 두 번 세척하십시오. 각 웰에 2.5ml의 신선한 생물막 성장 배지를 보충하고 이전 단계와 동일한 조건에서 추가로 24시간 동안 배양하여 총 생물막 성장 시간 48시간을 보냅니다.
7. 위 단계 대신에, 다른 종의 biofilms는 설치된 protocols를 사용하여 기질에 성장될 수 있었다.

4. 항균/구강 세정제 트리트먼트

1. 생물막 성장이 완료된 후 배지를 흡입합니다.
2. 치료 그룹의 웰에 2.5ml Biotène PBF(BIO) 또는 Listerine Total Care(LTO) 구강 세정제 또는 기타 치료 방식을 추가하고 대조군 웰에 2.5ml 멸균 초순수를 추가합니다. 제조업체의 지침에 따라 표본을 60초 동안 담그면서 150rpm의 궤도 셰이커에서 플레이트를 교반합니다. 우물에서 구강 세척제와 초순수를 즉시 흡입하십시오.
3. 150rpm의 오비탈 셰이커에서 멸균 초순수로 세척당 5초 동안 표본을 5회 세척하고 각 세척 단계 후에 물을 흡입합니다.
4. 위의 단계 대신에, 확립된 프로토콜을 사용하여 다른 항균제를 테스트할 수 있습니다.

5. 염색

1. 생물막 분석을 위해 염색 희석액을 준비합니다.
   1. Concanavalin A, Alexa Fluor 647 conjugate (AF)의 5 mg/ml 원액을 0.1 M sodium bicarbonate pH 8.3에 준비합니다. -20 °C에서 일회용 부분 표본에 넣어 냉동 및 해동은 권장하지 않으므로 몇 달 동안 보관하십시오. 이 AF 원액을 사용하여 TC 완충액에 250μg/ml 희석액을 준비합니다.
   2. 제조업체에서 제공한 대로 TC 완충액에서 5mM Syto 9 스톡 용액(SY)을 사용하여 10μM 희석액을 준비합니다. 남은 SY 원액은 -20°C에서 몇 달 동안 보관하십시오.
   3. 제조업체에서 제공한 5,000x Sypro Red 원액(SR)을 사용하여 멸균 초순수에 10배 희석액을 준비합니다. 나머지 SR 원액은 -20°C에서 몇 달 동안 보관하십시오.
2. 손으로 소용돌이치는 동작을 사용하여 TC 버퍼(2.5ml/well)로 모든 바이오필름을 2회 세척하고 두 번째 세척이 실온에서 30분 동안 플레이트에 남아 있도록 합니다. 발음.
3. 각 생물막 표본에 50μl의 AF 염색 방울을 떨어뜨립니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 염색하십시오. TC 완충액(2.5ml/웰)으로 2회 세척하고 세척할 때마다 흡입합니다.
4. 이후 각 생물막 표본에 SY 염색 50μl 방울을 떨어뜨립니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 염색하십시오. 멸균 초순수(2.5ml/웰)로 2회 세척하고 세척할 때마다 흡인합니다
.
5. 마지막으로, 각 생물막 표본에 SR 염색 50μl 방울을 떨어뜨립니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 염색하십시오. 멸균 초순수(2.5ml/웰)로 3회 세척하고 세척할 때마다 흡인합니다.
6. 검체를 6웰 플레이트로 옮기고 웰당 하나의 검체를 6ml 멸균 초순수에 배치하여 컨포칼 현미경 검사를 용이하게 합니다.

6. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용한 이미징

1. 표 1에 표시된 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 설정을 사용하여 치료 및 대조군의 생물막 내에서 각 구성 요소(염색)의 이미지를 획득합니다. 이 연구에서는 working distance가 2.2mm인 0.9 numerical aperture의 63X dipping lens가 사용되었습니다.
   
   표 1. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 설정.

1. 정량 분석에 적합한 해상도로 CLSM 이미지를 획득하려면 스캔 크기를 250μm x 250μm로 설정하고 최소 픽셀 해상도를 512 x 512로 설정합니다.
2. SY 염색을 사용하여 생물막 이미지 스택의 상단 및 하단 지점을 설정한 다음 z-단계를 정량 분석에 적합하게 설정합니다(이 연구의 경우 0.6μm). 스캔을 수집하기 전에 QLUT 옵션을 사용하여 이미지 및 염색 매개변수(즉, PMT 전압 및 오프셋)를 최적화합니다. 색상 조회 테이블을 사용하여 3D 재구성에서 각 생물막 구성 요소를 더 잘 구별할 수 있도록 각 염색(SY의 경우 녹색, SR의 경우 빨간색, AF의 경우 파란색)에 의사 색상을 할당했습니다.
3. "스택 사이" 모드에서 순차 스캔을 사용하여 400Hz에서 CLSM 이미지를 수집하여 동일한 생물막 내 여러 염색 이미지 캡처를 최적화합니다.

7. 생물막 구조 분석

1. 생물막용 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수집된 CLSM 이미지를 분석합니다. 다음 단계는 수집된 생물막 이미지의 구조적 매개변수를 계산하기 위해 ISA3D 소프트웨어⁽¹²)를 사용하는 방법을 설명합니다.
   1. 소프트웨어 설명서에 지정된 대로 각 생물막에 대한 CLSM 이미지 파일을 Images 폴더에 복사합니다. 소프트웨어에 필요한 CLSM 파일에 대한 명명 규칙을 따르는지 확인하십시오. 이 소프트웨어를 사용하면 배치 모드에서 하위 폴더 내의 파일을 분석할 수 있으므로 동일한 실행에서 처리 및 대조군 생물막의 분석을 용이하게 합니다.
   2. CLSM 이미지의 x축, y축, z축 치수를 메인 대화 상자의 dxy 및 dz 필드에 입력합니다. 소프트웨어 설명서에 설명된 대로 임계값 및 거리 매핑 설정을 선택합니다(이 연구에는 각각 Otsu 및 Quasi-Euclidean이 사용됨). 결과 파일에 적합한 이름을 입력한 다음 프로그램을 실행합니다. 결과 파일은 ISA 폴더에 생성됩니다.
   3. 결과 파일을 보고 생물막 내 각 구성 요소(염색제)의 3D 분포를 정량화하는 바이오볼륨 및 평균 바이오필름 두께(이 연구에서 측정)와 같은 20개의 3D 구조 매개변수¹²에 대한 값을 얻습니다.

8. 생물막 구조의 시각화

1. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 생물막 내에 중첩된 구성 요소(염색)를 재구성합니다. 다음 단계에서는 Volocity 소프트웨어를 사용하여 3D 재구성을 만드는 방법에 대해 설명합니다.
   1. 설명서에 설명된 대로 CLSM 이미지 파일을 소프트웨어에 복사하여 각 생물막에 대한 라이브러리를 만듭니다.
   2. 3D 렌더러 메뉴 옵션을 사용하여 각 생물막의 CLSM 이미지에서 재구성된 3D 이미지를 생성합니다(이 연구에는 HR 불투명도 형식이 사용됨).
   3. 3D 이미지를 회전하여 x, y 및 z 좌표 축과 관련하여 유사한 방식으로 모든 생물막의 방향을 지정합니다. 올바른 방향의 생물막 재구성의 스냅샷을 캡처한 다음 스냅샷을 TIFF, JPEG 또는 기타 적절한 형식으로 내보냅니다.
2. 재구성된 이미지에서 생물막 내 EPS, 단백질 및 핵산 성분의 동시 분포에 대한 시각적 분석을 수행합니다.
3. Pearson의 상관 계수 및 Manders의 중첩 계수를 사용하여 여러 생물막 구성 요소의 공동 국소화 분석을 수행합니다(이 연구에서는 공동 국소화가 측정되지 않음).

9. 통계 분석

1. 별도의 혼합 모델 통계 분석을 사용하여 구강 세정제와 대조군 간의 구조적 매개변수의 평균값을 비교합니다(α=0.05). 본 연구에서는 SAS 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.

Results

치료제(구강세정제)와 미처리대조군에 대한 대표적인 결과가 표 2와 그림 1 및 2에 나타나 있습니다. 표 2는 ISA3D 소프트웨어를 사용하여 계산된 생물막 구조 매개변수 생물부피(μm³) 및 평균 생물막 두께(μm)의 평균 및 표준 편차 값을 표시합니다. 구강 세척제로 처리된 생물막의 구조적 매개변수는 대조군(p<0.05)의 생물막과 크게 달랐으며, 평균 및 표준 편차 값이 빨간색으로 강조 표시되어 있습니다. 혼합 모델 통계 분석의 결과는 구강 세정제 BIO가 두 수지 복합재에서 대조군(p<0.05)과 크게 다른 생물막 구조를 생성한 반면, 구강 세정제 LTO는 두 수지 복합체에서 상당한 차이(p>0.05)를 생성하지 않았음을 보여주었습니다. 결과는 두 가지 구강 세정제 치료 후 남아 있는 세포 및 세포 외 생물막 성분이 다르다는 것을 명확하게 보여줍니다. 또한 두 기질(PF 및 TP)에서 성장한 S. mutans 생물막은 유사한 조건에서 성장했고 두 기질이 유사한 연마재로 연마되었음에도 불구하고 3D 구조가 달랐다는 점에 유의해야 합니다.

생물막 내 EPS, 단백질 및 핵산의 동시 분포는 Volocity 소프트웨어를 사용하여 생성된 3D 재구성을 통해 시각화할 수 있습니다. 그림 1과 2는 각각 PF 및 TP 수지 복합재에서 성장한 대조군 생물막의 대표적인 재구성을 보여줍니다. 파란색 염색은 S. mutans 생물막 내의 EPS를 나타내고, 녹색 염색은 핵산을 나타내고, 빨간색 염색은 단백질을 나타냅니다. 그 사이의 공간은 물 또는 다른 비형광 표지된 생물막 성분에 의해 점유될 수 있습니다.

그림 1. 대조군의 PF 수지 복합재에서 성장한 S. mutans 생물막의 대표적인 3D 재구성(구강 청결제로 처리하지 않음). 단일 생물막 내에서 세 가지 염색의 동시 오버레이를 통해 S. mutans 생물막 내의 EPS(파란색 염색), 핵산(녹색 염색) 및 단백질(빨간색 염색) 구성 요소를 동시에 시각화할 수 있습니다. (1 단위 = 24 μm). 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 대조군의 TP 수지 복합재에서 성장한 S. mutans 생물막의 대표적인 3D 재구성(구강 청결제로 처리하지 않음). 단일 생물막 내에서 세 가지 염색의 동시 오버레이를 통해 S. mutans 생물막 내의 EPS(파란색 염색), 핵산(녹색 염색) 및 단백질(빨간색 염색) 구성 요소를 동시에 시각화할 수 있습니다. (1 단위 = 24 μm). 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

<테이블 테두리="1"> 수지 복합재 점 4 TPH3 구강 세척제 구성 요소 BV (μm³) MT (μm) BV (μm³) MT (μm) 비오텐 PBF 핵산 279,517±53,291명 9.32±2.80분 195,033±42,014 7.45±3.70분 주당순이익 344,902±56,386 35.22±17.19 197,840±62,351명 9.83±7.26분 단백질 298,796±62,868 54.21±21.65 216,033±66,654명 24.33±39.64 리스테린 토탈 케어 핵산 355,707±110,444명 26.45±14.21 273,296±47,323명 13.43±2.89초 주당순이익 494,099±180,592명 64.90± 26.68초 329,150±47,145명 34.35±30.32분 단백질 348,416±161,316명 58.68±47.28년 303,150±54,705 34.18±41.46 대조군(치료되지 않음) 핵산 388,375±42,152명 51.15±40.66초 327,809±39,400 17.08±1.65초 주당순이익 660,448±173,197명 91.37±74.84 363,850±67,612명 28.33± 15.07초 단백질 517,274±119,475 127.96±73.84 353,161±56,518명 21.17±4.41

표 2. BIO 또는 LTO로 처리되거나 처리되지 않은 상태로 방치된 생물막(대조군)의 생물부피(BV) 및 평균 생물막 두께(MT)의 평균 및 표준 편차 값. 구강 세척제로 처리된 생물막의 구조적 매개변수는 대조군의 생물막과 크게 달랐으며(p<0.05) 평균 및 표준 편차 값이 빨간색으로 강조 표시되었습니다.

Discussion

CLSM 이미지의 획득은 생물막의 정량화 및 공국소화 분석에 필요한 방식과 형식으로 수행되어야 하며, 각 이미지의 신호 강도 분포는 생물막 스택에서 각 형광색소의 분포를 안정적으로 표현합니다. 신호 강도는 노이즈 및 배경^(10,11)과 구별될 수 있어야 하며, 기판으로부터의 자가형광의 영향을 받지 않고, 사용된 형광색소¹¹ 사이의 스펙트럼 간섭으로 인한 블리드스루가 최소화되어야 합니다. 노이즈는 형광 현미경¹¹의 불가피한 한계이며, 이미지 품질은 때때로 기술적 또는 물류상의 이유로 제한될 수 있습니다. 스펙트럼 중첩이 최소화된 형광색소를 식별하는 것은 이 방법의 성공에 매우 중요하지만 복잡할 수 있습니다. 또한, 여러 형광색소의 정량화는 다인성 문제를 야기합니다. 따라서 생물막 구조 내에서 두 개 이상의 구성 요소의 동시 분포를 성공적으로 정량화한 조사가 거의 없다는 것은 놀라운 일이 아닙니다.

이 연구의 목적은 생물막 내에서 세 가지 세포 및 세포외 구성 요소의 동시 3차원 분포를 정량화하고 비교하기 위해 뚜렷하지만 상호 연결된 단계로 구성된 방법론을 보고하는 것이었습니다. 설명된 생물막 성장 분석은 표 1에 보고된 결과에 의해 입증된 바와 같이 관련 기질에서 생물막 성장을 허용하고 재현 가능한 생물막 구조를 생성합니다. EPS, 단백질 및 핵산 성분의 새로운 동시 염색과 3D 생물막 구조 매개변수 측정의 조합은 생물막 내 성분의 정량화 가능한 분포를 초래합니다. 생물막 내에서 EPS, 단백질 및 핵산의 동시 분포에 대한 정성적 시각적 분석은 각 생물막 내에서 겹쳐진 염색의 재구성을 통해 가능합니다. ISA3D 소프트웨어⁽¹² )에는 생물막의 3D 구조의 정량화를 향상시키기 위해 다공성 및 생물막 두께와 같은 전통적으로 측정된 매개변수 외에도 프랙탈 치수, 균질성 및 생물막 거칠기 계수와 같은 몇 가지 고유한 구조 매개변수가 포함되어 있습니다. 생물막 구조 매개변수의 통계 분석은 항균/방오 효능(예: 구강청결제로 치료한 후) 또는 시간 경과에 따라(시간적 효과)와 같은 특정 실험 조건에서 생물막의 관련 비교를 용이하게 합니다.

이 방법론은 관련 기질에서 성장한 S. mutans 생물막 내 세 가지 주요 구성 요소의 동시 3D 분포를 효율적이고 성공적으로 정량화하고 비교하여 생물막 구성 요소의 동시 평가에 대한 두 가지 과제를 극복했습니다. 이 방법은 또한 이 연구에서 구강청결제를 사용하여 표시된 것처럼 여러 생물막 성분에 대한 항균 처리 또는 방오 조치의 효능을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 위에서 설명한 프로토콜의 대부분은 관련 기질의 제조 및 관련 미생물의 생물막 성장 분석을 위한 프로토콜로 대체될 수 있습니다. 따라서 이 방법은 의학, 치과, 지질 및 해양 과학을 포함한 다양한 분야에서 시험관 내 및 생체 내 생물막의 3D 구조/구조를 쉽게 비교할 수 있기 때문에 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010
Bacto Todd Hewitt Broth	Becton, Dickinson and Company	249240
효모 추출물, 과립	EMD Millipore	1.03753.0500
Bacto Tryptone	Becton, Dickinson and Company	211705
OmniPur 자당	EMD Millipore	8510
염화칼륨, ACS 시약, 99.0-100.5%	Sigma-Aldrich	P3911-500G
인산칼륨, 일염기성, ≥ 99.0%, ACS 시약	Sigma-Aldrich	P0662-500G
염화나트륨	Sigma-Aldrich	S9888-500G
인산나트륨, 일염기성, 일수화물	EMD Millipore	SX0710-1
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99.8+%, ACS 시약	Sigma-Aldrich	252859-500G
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate	Invitrogen	C21421
Syto 9	Invitrogen	S34854
Sypro Red	Invitrogen	S12012 또는 S6653
Biotè ne PBF 구강 린스	GlaxoSmithKline	해당 없음
리스테린 토탈 케어	McNeil-PPC, Inc.	해당 사항 없음