방법 논문

생물막의 세포 및 세포 외 성분의 동시 정량화

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DOI:

10.3791/50639

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2013년 12월 10일

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1Department of Dental Materials, College of Dentistry, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Biostatistics and Epidemiology, College of Public Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Biological Sciences, School of Mathematics and Natural Sciences, The Copperbelt University

이 논문에서

요약

생물막 내 3개의 세포 및 세포 외 구성 요소를 동시에 정량화하고 비교하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법론에는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경, 생물막 구조 분석 및 시각화 소프트웨어, 통계 분석 소프트웨어의 사용이 포함됩니다.

초록

컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)은 생물막 조사를 위한 강력한 도구입니다. 1) 스펙트럼 겹침이 최소화된 형광 염료의 선택은 복잡하고 2) 여러 형광 색소의 정량화는 다요인 문제를 제기하기 때문에 생물막 내에서 두 가지 이상의 성분의 동시 분포를 성공적으로 정량화한 연구는 거의 없습니다. 목표: 관련 기질에서 성장한 생물막의 3가지 세포/세포 외 구성 요소의 동시 3차원 분포를 정량화하고 비교하는 방법론을 보고합니다. 방법: 이 방법은 생물막 성장, 염색, CLSM 이미징, 생물막 구조 분석 및 시각화, 구조 매개변수의 통계 분석을 포함하는 별개의 상호 연결된 단계로 구성됩니다. Streptococcus mutans (균주 UA159)의 생물막을 Point 4 및 TPH3 수지 복합체의 멸균 표본에서 48 시간 동안 성장시켰다. 그 후 검체를 Biotène PBF(BIO) 또는 Listerine Total Care(LTO) 구강 세정제 또는 물(대조군, n=5/그룹)에 60초 동안 담가두었습니다. 생물막은 CLSM으로 이미징하기 전에 세포 외 고분자 물질, 단백질 및 핵산에 대한 형광 색소로 염색되었습니다. ISA3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 계산된 생물막 구조 매개변수는 생체 부피와 평균 생물막 두께였습니다. 혼합 모델, 통계 분석, 구강 세정제와 대조군 간의 구조적 매개변수를 비교했습니다(SAS 소프트웨어, α=0.05). Volocity 소프트웨어를 사용하면 오버레이된 생물막 구성 요소(형광 색소)의 3D 분포를 시각화할 수 있었습니다. 결과: 구강 세척제 BIO는 두 수지 복합재 모두에서 대조군(p<0.05)과 크게 다른 생물막 구조를 생성한 반면, LTO는 두 제품 모두에서 차이(p>0.05)를 생성하지 않았습니다. 결론: 이 방법론은 관련 기질에서 S. mutans 생물막 내 세 가지 주요 성분의 동시 3D 분포를 효율적이고 성공적으로 정량화하고 비교하여 생물막 성분의 동시 평가에 대한 두 가지 과제를 극복했습니다. 이 방법은 구강 세정제를 사용하여 표시된 것처럼 여러 생물막 성분에 대한 항균/방오제의 효능을 결정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 게다가, 이 방법에는 다양한 분야에 있는 biofilms의 3D 구조/건축술의 비교를 촉진하기 때문에 넓은 응용이 있습니다.

서론

생물막은 자가 생산된 세포외 기질에 캡슐화되어 생물학적 또는 불활성 표면에 부착된 구조화된 미생물 군집입니다1. 생물막은 많은 박테리아의 일반적인 생활 방식을 나타내며 자유 부유(플랑크톤) 세포에서 복잡한 다종 군집으로 단계적으로 전환하여 형성됩니다. 항균제에 대한 생물막의 고유한 내성은 구강 생물막(치태)에 의해 입증된 바와 같이 많은 지속적이고 만성적인 박테리아 감염1,2의 근원입니다. 돌연변이 연쇄상 구균과 같은 충치 성 미생물은 자당 및 기타 탄수화물을 처리하여 세포 외 기질을 생성하고 치아 구조를 탈염시키고 충치를 유발할 수 있는 산을 생성합니다. 대부분의 생물막 매트릭스는 외다당류(EPS), 단백질 및 핵산과 같은 세포 및 세포 외 구성 요소로 구성된 생체 고분자입니다3,4.

형광 이미징에 가장 널리 사용되는 기술인 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)은 고정 없이 수화된 생물학적 구조의 3D 이미지를 수집할 수 있기 때문에 생물학에서 광학 이미징을 근본적으로 변화시켰습니다5,6,7. 이 비파괴 기술은 초점이 맞지 않는 빛의 기여를 제거하는 방식으로 표본의 관심 영역 내에서 얇은 부분의 이미지를 수집하는 것을 포함합니다. CLSM으로 캡처한 이미지의 품질과 해상도는 광시야 형광 현미경을 사용하여 달성할 수 있는 것 이상입니다. CLSM의 주요 단점 중 하나는 전체 이미지가 동시에 수집되는 광시야 현미경 기술보다 느린 속도로 이미지 스캔이 발생한다는 것입니다5. 그러나 형광 색소, 레이저 및 필터의 선택이 확대됨에 따라 CLSM은 다중 스펙트럼 이미징5,7을 위한 일반적인 기술 중 하나가 되었습니다.

이전 연구는 CLSM가 하나 또는 두 개의 형광 태그 또는 염색을 사용하여 생물막의 구조 또는 구조를 검사하는 데 유용한 도구임을 보여 주어 생물막 내에서, 특히 세포외 기질7,8 내에서 EPS 및 세포의 분포에 대한 더 나은 이해를 제공합니다. 이론적으로 여러 구성 요소의 형광 염색/라벨링은 생물막 내 세포 및 세포 외 구성 요소의 상세한 구조와 공동 국소화를 탐구하는 데 바람직합니다. 그러나 생물막 내의 다양한 성분을 동시에 분석하는 것은 1) 스펙트럼 중복이 최소화된 형광 염료의 선택이 복잡하고 2) 여러 형광 색소의 정량화가 다요인 문제를 제기하기 때문에 어려울 수 있습니다. 여러 형광 색소를 사용한 공동 국소화는 두 개의 형광 색소가 스펙트럼 피크에서 상당한 중복을 가질 때 발생하는 블리드 스루 효과를 피하기 위해 스펙트럼 간섭을 최소화한 매우 특이적인 염색을 사용해야 합니다9. 이상적으로는 겹치지 않는 여기 스펙트럼을 가진 형광 색소가 최상의 결과를 제공하지만 이 기준을 충족하는 염색을 찾는 것은 매우 어렵습니다. 대신, 방출 스펙트럼이 최소한의 중복을 갖는 형광 색소를 선택하여 염색 선택이 최적화되어 제한된 관찰 파장 대역9 내에서 염색을 하나씩 볼 수 있습니다.

형광 이미지의 중첩은 아마도 형광 색소의 동시 분포를 평가하는 데 가장 널리 사용되는 방법일 것입니다. 다양한 성분의 공동 국소화(colocalization)는 검사 중인 형광 색소에 의해 생성된 다중 채널을 통해 서로 다른 색상의 중첩으로 나타납니다10. 다중 채널 형광 이미지를 병합된 컬러 이미지로 표시하는 도구는 대부분의 CLSM 소프트웨어 및 생물학적 이미지 분석 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다. 이미지의 중첩은 공동 국소화의 공간 평가에 유용하지만 이미지는 시각적 분석을 통해서만 정성적으로 검사할 수 있습니다. 이러한 표현은 일반적으로 다른 실험 조건에서 공동 국소화를 정량화하는 데 도움이 되지 않으며 공동 국소화가 무작위 우연의 일치11를 초과하는지 여부를 결정하지 않기 때문에 제한된 양의 정보를 제공합니다. 지금까지 생물막 및 생물막 성분의 3차원 구조를 분석하기 위해 정량적 방법을 사용한 연구는 거의 없었으며, 생물막 성분에 대한 항균 처리 또는 방오 조치의 효과를 정량화한 연구는 더욱 적었습니다.

이 연구의 목적은 생물막의 3가지 세포 및 세포 외 구성 요소의 동시 3차원 분포의 정량화 및 비교를 위한 방법론을 보고하는 것이었습니다. 이 방법은 생물막 성장, 염색, 생물막의 CLSM 이미징, 생물막 구조 분석 및 시각화, 구조 매개변수의 통계 분석을 포함하는 별개이지만 상호 연결된 단계로 구성됩니다. 생물막 성장 분석은 관련 기질에서 생물막 성장을 허용하고 재현 가능한 생물막 구조를 생성합니다. EPS, 단백질 및 핵산 성분의 새로운 동시 염색과 3D 생물막 구조 매개변수 측정의 조합은 생물막 내 성분의 정량화 가능한 분포를 가져옵니다. 생물막 구조 매개변수의 통계적 분석은 다음 섹션에서 설명하는 것처럼 특정 실험 조건(예: 구강 세정제 처리 후)에서 생물막의 평가를 용이하게 합니다.

프로토콜

1. 배지 및 시약 준비

  1. 300 ml의 하룻밤 배양 배지(THY; 제조사 지침에 따라 준비한 3% Todd Hewitt Broth에 초순수로 0.3% Yeast Extract를 첨가)를 조제하고 오토클레이브 멸균한다. 실온에서 최대 2개월 동안 보관한다.
  2. 1 L의 THY agar(초순수에 3% Todd Hewitt Broth, 0.3% Yeast Extract 및 1.5% agar 함유)를 조제하고 오토클레이브 멸균한 후, 60 °C까지 식혀 페트리 접시에 붓는다. 4 °C에서 최대 3개월 동안 보관한다.
  3. 150 ml의 바이오필름 성장 배지(10 mM sucrose가 첨가된 0.5X TY; 초순수에 1.5% Tryptone, 0.5% Yeast Extract 및 10 mM sucrose 함유)를 조제하고 필터 멸균한다. 실온에서 최대 1개월 동안 보관한다.
  4. 1 L의 인산염 완충 식염수(PBS; 초순수에 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4 및 0.24 g KH2PO4 함유)를 조제하고 오토클레이브 멸균한다. 실온에서 수개월 동안 보관한다.
  5. 초순수에 10 mM CaCl2가 첨가된 600 ml의 10 mM Tris HCl 버퍼(TC 버퍼; pH 7.2)를 조제하고 오토클레이브 멸균한다. 실온에서 수개월 동안 보관한다.
  6. 1 L의 초순수를 오토클레이브 멸균한다. 실온에서 수개월 동안 보관한다.

2. 시편 제작

  1. Point 4 (PF) 및 TPH의 디스크 모양 시편을 제작하십시오.3 맞춤 제작된 스테인리스 스틸 몰드에 두 차례에 걸쳐 치과용 레진 복합체(TP)를 충전합니다. 각 충전물은 LED 광중합기를 사용하여 40초 동안 광중합합니다. 두 제품은 성분과 필러 함량이 약간 다르며, 이에 따라 바이오필름이 성장하게 될 서로 다른 표면 지형을 형성합니다.
    1. 단계 2.1 대신 타 분야의 기성 프로토콜을 사용하여 관련 기질의 시편을 제작할 수 있습니다.
  2. 시편을 허용 가능한 최종 표면 거칠기로 마무리하고 연마하십시오. 예: 반자동 연마기를 사용하여 연마합니다. 연마된 시편을 초순수로 헹구고 압축 공기로 건조합니다.
  3. 에틸렌 옥사이드 가스 또는 다른 멸균 방법을 사용하여 시료를 멸균하십시오.

3. 바이오필름 성장

  1. S. mutans의 단일 콜로니를 4 ml의 야간 배양 배지(단계 1.1)에 접종합니다. 37 °C에서 16-18시간 동안 야간 배양합니다. 배양액의 광학 밀도(OD600)는 ≥0.9여야 합니다.
    1. 더욱 일관된 바이오필름 성장을 위해, 원래 스톡에서 2회 계대 배양한 플레이트 배양물의 콜로니를 사용하는 것이 가장 좋습니다.
  2. 야간 배양액(단계 1.1)을 10 ml의 바이오필름 성장 배지(단계 1.3)를 사용하여 1:100으로 희석합니다.
  3. 멸균된 레진 복합체 시편(e.g. PF, TP)을 멸균된 12-well 플레이트로 옮깁니다.
  4. 처리군(구강세정제) 및 대조군 well에 희석된 배양 배지(단계 3.2) 2.5 ml를 첨가합니다. 멸균 대조군 well에는 접종되지 않은 멸균 바이오필름 성장 배지 2.5 ml를 첨가합니다.
  5. 미호기성 조건에서 바이오필름을 성장시킵니다. 37 °C 인큐베이터 내의 셰이커에 플레이트를 놓고 100 rpm으로 24시간 동안 배양합니다.
  6. 24시간 후, 모든 well에서 배지를 무균적으로 흡입하여 제거하고, 멸균된 PBS(단계 1.4; 2.5 ml/well)로 2회 세척하며, 각 세척 후 PBS를 흡입하여 제거합니다. 각 well에 신선한 바이오필름 성장 배지 2.5 ml를 다시 채우고, 이전 단계와 동일한 조건에서 24시간 더 배양하여 총 바이오필름 성장 시간을 48시간으로 맞춥니다.
  7. 위 단계 대신, 확립된 프로토콜을 사용하여 기질 위에서 다른 종의 바이오필름을 성장시킬 수 있습니다.

4. 항균/구강청결제 처리

  1. 바이오필름 성장이 완료된 후 배지를 흡입하여 제거한다.
  2. 처리군 웰에는 2.5 ml의 Biotène PBF (BIO) 또는 Listerine Total Care (LTO) 구강 세정제, 또는 기타 처리 수단을 첨가하고, 대조군 웰에는 2.5 ml의 멸균 초순수를 첨가한다. 제조사의 지침에 따라 궤도 쉐이커(orbital shaker)에서 150 rpm으로 플레이트를 흔들어주며 시편을 60초 동안 침지시킨다. 즉시 웰에서 구강 세정제와 초순수를 모두 흡입하여 제거한다.
  3. 궤도 쉐이커를 150 rpm으로 작동시킨 상태에서 멸균 초순수로 시편을 15초씩 5회 세척하며, 각 세척 단계 후에는 물을 흡입하여 제거한다.
  4. 위의 단계 대신, 확립된 프로토콜을 사용하여 다른 항균제를 테스트할 수 있다.

5. 염색

  1. 바이오필름 분석을 위한 염색액 희석액을 준비합니다.
    1. 0.1 M sodium bicarbonate pH 8.3에서 Concanavalin A, Alexa Fluor 647 conjugate (AF) 5 mg/ml 스톡 용액을 제조합니다. 동결 및 해동을 권장하지 않으므로, 1회 사용량씩 분주하여 -20 °C에서 수개월 동안 보관합니다. 이 AF 스톡 용액을 사용하여 TC buffer로 250 μg/ml 희석액을 제조합니다.
    2. 제조사에서 제공한 5 mM Syto 9 스톡 용액(SY)을 TC buffer로 희석하여 10 μM 희석액을 제조합니다. 남은 SY 스톡 용액은 -20 °C에서 수개월 동안 보관합니다.
    3. 제조사에서 제공한 5,000x Sypro Red 스톡 용액(SR)을 멸균 초순수로 희석하여 10x 희석액을 제조합니다. 남은 SR 스톡 용액은 -20 °C에서 수개월 동안 보관합니다.
  2. 손으로 가볍게 흔들어 섞는 방식으로 모든 바이오필름을 TC buffer (2.5 ml/well)로 2회 세척하며, 두 번째 세척액은 실온에서 30분 동안 플레이트에 그대로 둡니다. 이후 흡입하여 제거합니다.
  3. 각 바이오필름 시료에 AF 염색액 50 μl 한 방울을 떨어뜨립니다. 빛을 차단한 상태로 실온에서 30분 동안 염색합니다. TC buffer (2.5 ml/well)로 2회 세척하며, 매 세척 후 흡입하여 제거합니다.
  4. 이어서 각 바이오필름 시료에 SY 염색액 50 μl 한 방울을 떨어뜨립니다. 빛을 차단한 상태로 실온에서 30분 동안 염색합니다. 멸균 초순수 (2.5 ml/well)로 2회 세척하며, 매 세척 후 흡입하여 제거합니다.
  5. 마지막으로 각 바이오필름 시료에 SR 염색액 50 μl 한 방울을 떨어뜨립니다. 빛을 차단한 상태로 실온에서 30분 동안 염색합니다. 멸균 초순수 (2.5 ml/well)로 3회 세척하며, 매 세척 후 흡입하여 제거합니다.
  6. 공초점 현미경 관찰을 용이하게 하기 위해 시료를 6-well 플레이트로 옮기고, 웰당 하나씩의 시료를 6 ml 멸균 초순수에 넣습니다.

6. 공초점 레이저 주사 현미경을 이용한 이미징

  1. 표 1에 제시된 공초점 레이저 주사 현미경 설정을 사용하여 처리군과 대조군 바이오필름 내의 각 성분(염색) 이미지를 획득하십시오. 본 연구에서는 작동 거리 2.2 mm, 수치구경 0.9인 63X 침수 렌즈를 사용하였습니다.
    바이오필름 염색 도표; EPS, 핵산, 단백질에 대한 레이저 파장(nm) 및 방출 밴드(nm).
    표 1. 공초점 레이저 주사 현미경 설정.

  1. 정량 분석에 적합한 해상도로 CLSM 이미지를 획득하기 위해 스캔 크기를 250 μm x 250 μm로, 최소 픽셀 해상도를 512 x 512로 설정합니다.
  2. SY 염색을 사용하여 바이오필름 이미지 스택의 상단 및 하단 지점을 설정한 다음, 정량 분석에 적합하도록 z-step을 설정합니다(본 연구에서는 0.6 μm). 스캔을 시작하기 전, QLUT 옵션을 사용하여 이미지 및 염색 파라미터(i.e. PMT 전압 및 오프셋)를 최적화합니다. 3D 재구성 시 각 바이오필름 구성 성분을 더 쉽게 구분할 수 있도록 컬러 룩업 테이블을 사용하여 각 염색에 의사 색상(SY는 녹색, SR은 적색, AF는 청색)을 할당하였습니다.
  3. 동일한 바이오필름 내의 여러 염색 이미지를 최적화하여 캡처하기 위해 "between stacks" 모드의 순차 스캐닝을 사용하여 400 Hz에서 CLSM 이미지를 수집합니다.

7. 바이오필름 구조 분석

  1. 바이오필름용 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수집된 CLSM 이미지를 분석합니다. 다음 단계에서는 ISA3D 소프트웨어12를 사용하여 수집된 바이오필름 이미지의 구조적 파라미터를 계산하는 방법을 설명합니다.
    1. 소프트웨어 매뉴얼에 명시된 대로 각 바이오필름의 CLSM 이미지 파일을 Images 폴더로 복사합니다. 이때 소프트웨어에서 요구하는 CLSM 파일의 명명 규칙을 준수해야 합니다. 이 소프트웨어는 배치 모드에서 하위 폴더 내의 파일 분석을 지원하므로, 한 번의 실행으로 처리군과 대조군 바이오필름을 모두 분석할 수 있습니다.
    2. 메인 대화 상자의 dxy 및 dz 필드에 CLSM 이미지의 x, y, z축 치수를 입력합니다. 소프트웨어 매뉴얼에 설명된 대로 임계값(threshold) 및 거리 매핑(distance mapping) 설정을 선택합니다 (본 연구에서는 각각 Otsu 및 Quasi-Euclidean 방식을 사용함). 결과 파일의 이름을 적절하게 입력한 후 프로그램을 실행합니다. 결과 파일은 ISA 폴더에 생성됩니다.
    3. 결과 파일을 확인하여 바이오필름 내 각 성분(염색)의 3D 분포를 정량화하는 biovolume 및 평균 바이오필름 두께(본 연구에서 측정됨)와 같은 20가지 3D 구조적 파라미터12 값을 얻습니다.

8. 바이오필름 구조의 시각화

  1. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 바이오필름 내에 중첩된 구성 요소(염색)의 재구성을 생성합니다. 다음 단계는 Volocity 소프트웨어를 사용하여 3D 재구성을 생성하는 방법을 설명합니다.
    1. 매뉴얼에 설명된 대로 CLSM 이미지 파일을 소프트웨어로 복사하여 각 바이오필름에 대한 라이브러리를 생성합니다.
    2. 3D Renderer 메뉴 옵션을 사용하여 각 바이오필름의 CLSM 이미지로부터 재구성된 3D 이미지를 생성합니다(본 연구에서는 HR Opacity 형식을 사용하였습니다).
    3. 3D 이미지를 회전시켜 모든 바이오필름이 x, y, z 좌표축에 대해 유사한 방향을 갖도록 정렬합니다. 올바르게 정렬된 바이오필름 재구성의 스냅샷을 캡처한 후, TIFF, JPEG 또는 기타 적절한 형식으로 스냅샷을 내보냅니다.
  2. 재구성된 이미지에서 바이오필름 내 EPS, 단백질 및 핵산 성분의 동시 분포에 대한 시각적 분석을 수행합니다.
  3. Pearson 상관 계수와 Manders 중첩 계수를 사용하여 여러 바이오필름 구성 요소의 공국소화 분석(colocalization analysis)을 수행합니다(본 연구에서는 공국소화를 측정하지 않았습니다).

9. 통계 분석

  1. 구강 세정제 그룹과 대조군 간의 구조적 파라미터 평균값을 비교하기 위해 별도의 혼합 모델 통계 분석을 사용합니다(α=0.05). 본 연구에서는 통계 분석을 수행하기 위해 SAS 소프트웨어를 사용하였습니다.

결과

처치군(구강청결제) 및 무처치 대조군의 대표적인 결과는 표 2, 그림 1 및 그림 2에 제시되어 있습니다. 표 2에는 ISA3D 소프트웨어를 사용하여 계산한 바이오필름 구조 파라미터인 생물 부피(biovolume, μm3)와 평균 바이오필름 두께(μm)의 평균 및 표준 편차 값이 표시되어 있습니다. 대조군 바이오필름과 유의미한 차이를 보인(p<0.05) 구강청결제 처치 바이오필름의 구조 파라미터 평균 및 표준 편차 값은 빨간색으로 강조 표시하였습니다. 혼합 모델 통계 분석 결과, 구강청결제 BIO는 두 가지 레진 복합체 모두에서 대조군과 유의미하게 다른(p<0.05) 바이오필름 구조를 형성한 반면, 구강청결제 LTO는 두 레진 복합체 모두에서 유의미한 차이를 나타내지 않았습니다(p>0.05). 이러한 결과는 두 가지 구강청결제 처치 후 남아있는 바이오필름의 세포 및 세포 외 성분이 서로 달랐음을 명확히 보여줍니다. 또한, S. mutans 바이오필름이 두 가지 기질(PF 및 TP)에서 유사한 조건으로 배양되었고 두 기질 모두 유사한 연마제로 연마되었음에도 불구하고 3D 구조에 차이가 있었다는 점에 주목해야 합니다.

바이오필름 내 EPS, 단백질 및 핵산의 동시 분포는 Volocity 소프트웨어를 사용하여 생성된 3D 재구성 영상을 통해 시각화할 수 있습니다. 그림 1 및 그림 2는 각각 PF 및 TP 레진 복합체에서 성장한 대조군 바이오필름의 대표적인 재구성 영상을 보여줍니다. 파란색 염색은 S. mutans 바이오필름 내의 EPS를 나타내며, 녹색 염색은 핵산을, 빨간색 염색은 단백질을 나타냅니다. 그 사이의 공간은 물 또는 형광 표지되지 않은 다른 바이오필름 성분으로 채워져 있을 수 있습니다.

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그림 1. 대조군(구강청결제로 처리하지 않음)에서 PF 레진 복합체 상에 성장한 S. mutans 바이오필름의 대표적인 3D 재구성 이미지. 단일 바이오필름 내 세 가지 염색법을 동시에 중첩함으로써 S. mutans 바이오필름 내의 EPS(청색 염색), 핵산(녹색 염색) 및 단백질(적색 염색) 성분을 동시에 시각화할 수 있습니다. (1 Unit = 24 μm). 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

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그림 2. 대조군(구강청결제로 처리하지 않음)의 TP 레진 복합체에서 성장한 S. mutans 바이오필름의 대표적인 3D 재구성 이미지. 단일 바이오필름 내 세 가지 염색 결과를 동시에 오버레이함으로써 S. mutans 바이오필름 내의 EPS(청색 염색), 핵산(녹색 염색) 및 단백질(적색 염색) 성분을 동시에 시각화할 수 있다. (1 Unit = 24 μm). 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

레진 복합체Point 4TPH3
구강세정제성분BV (μm3)MT (μm)BV (μm3)MT (μm)
Biotène PBF핵산279,517±53,2919.32±2.80195,033±42,0147.45±3.70
EPS344,902±56,38635.22±17.19197,840±62,3519.83±7.26
단백질298,796±62,86854.21±21.65216,033±66,65424.33±39.64
Listerine Total Care핵산355,707±110,44426.45±14.21273,296±47,32313.43±2.89
EPS494,099±180,59264.90± 26.68329,150±47,14534.35±30.32
단백질348,416±161,31658.68±47.28303,150±54,70534.18±41.46
대조군 (미처리)핵산388,375±42,15251.15±40.66327,809±39,40017.08±1.65
EPS660,448±173,19791.37±74.84363,850±67,61228.33± 15.07
단백질517,274±119,475127.96±73.84353,161±56,51821.17±4.41

표 2. BIO 또는 LTO로 처리하거나 처리하지 않은(대조군) 바이오필름의 생체 부피(BV) 및 평균 바이오필름 두께(MT)의 평균 및 표준 편차 값. 대조군 바이오필름과 유의미한 차이가 있었던(p<0.05) 구강 세정제 처리 바이오필름의 구조적 파라미터의 평균 및 표준 편차 값은 빨간색으로 표시되어 있습니다.

토론

CLSM 이미지의 획득은 생물막의 정량화 및 공국소화 분석에 필요한 방식과 형식으로 수행되어야 하며, 각 이미지의 신호 강도 분포는 생물막 스택에서 각 형광색소의 분포를 안정적으로 표현합니다. 신호 강도는 노이즈 및 배경(10,11)과 구별될 수 있어야 하며, 기판으로부터의 자가형광의 영향을 받지 않고, 사용된 형광색소11 사이의 스펙트럼 간섭으로 인한 블리드스루가 최소화되어야 합니다. 노이즈는 형광 현미경11의 불가피한 한계이며, 이미지 품질은 때때로 기술적 또는 물류상의 이유로 제한될 수 있습니다. 스펙트럼 중첩이 최소화된 형광색소를 식별하는 것은 이 방법의 성공에 매우 중요하지만 복잡할 수 있습니다. 또한, 여러 형광색소의 정량화는 다인성 문제를 야기합니다. 따라서 생물막 구조 내에서 두 개 이상의 구성 요소의 동시 분포를 성공적으로 정량화한 조사가 거의 없다는 것은 놀라운 일이 아닙니다.

이 연구의 목적은 생물막 내에서 세 가지 세포 및 세포외 구성 요소의 동시 3차원 분포를 정량화하고 비교하기 위해 뚜렷하지만 상호 연결된 단계로 구성된 방법론을 보고하는 것이었습니다. 설명된 생물막 성장 분석은 표 1에 보고된 결과에 의해 입증된 바와 같이 관련 기질에서 생물막 성장을 허용하고 재현 가능한 생물막 구조를 생성합니다. EPS, 단백질 및 핵산 성분의 새로운 동시 염색과 3D 생물막 구조 매개변수 측정의 조합은 생물막 내 성분의 정량화 가능한 분포를 초래합니다. 생물막 내에서 EPS, 단백질 및 핵산의 동시 분포에 대한 정성적 시각적 분석은 각 생물막 내에서 겹쳐진 염색의 재구성을 통해 가능합니다. ISA3D 소프트웨어(12 )에는 생물막의 3D 구조의 정량화를 향상시키기 위해 다공성 및 생물막 두께와 같은 전통적으로 측정된 매개변수 외에도 프랙탈 치수, 균질성 및 생물막 거칠기 계수와 같은 몇 가지 고유한 구조 매개변수가 포함되어 있습니다. 생물막 구조 매개변수의 통계 분석은 항균/방오 효능(예: 구강청결제로 치료한 후) 또는 시간 경과에 따라(시간적 효과)와 같은 특정 실험 조건에서 생물막의 관련 비교를 용이하게 합니다.

이 방법론은 관련 기질에서 성장한 S. mutans 생물막 내 세 가지 주요 구성 요소의 동시 3D 분포를 효율적이고 성공적으로 정량화하고 비교하여 생물막 구성 요소의 동시 평가에 대한 두 가지 과제를 극복했습니다. 이 방법은 또한 이 연구에서 구강청결제를 사용하여 표시된 것처럼 여러 생물막 성분에 대한 항균 처리 또는 방오 조치의 효능을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 위에서 설명한 프로토콜의 대부분은 관련 기질의 제조 및 관련 미생물의 생물막 성장 분석을 위한 프로토콜로 대체될 수 있습니다. 따라서 이 방법은 의학, 치과, 지질 및 해양 과학을 포함한 다양한 분야에서 시험관 내 및 생체 내 생물막의 3D 구조/구조를 쉽게 비교할 수 있기 때문에 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다.

공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다. 이 기사에 대한 제작 및 무료 액세스는 라이카 마이크로시스템즈의 후원을 받습니다.

감사의 글

이 연구의 자금은 National Institutes of Health/NIDCR 보조금 1R15DE019566-01A1에서 제공했습니다. Jim Henthorn(OUHSC Flow and Image Cytometry Laboratory)은 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경에 대한 기술 지원을 제공한 공로를 인정받았습니다. Dr. Fernando Esteban Florez(치과 재료학과)는 이 비디오를 촬영하는 동안 기술 지원을 제공한 것으로 인정받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Bacto AgarBecton, Dickinson and Company214010
Bacto Todd Hewitt BrothBecton, Dickinson and Company249240
효모 추출물, 과립EMD Millipore1.03753.0500
Bacto TryptoneBecton, Dickinson and Company211705
OmniPur 자당EMD Millipore8510
염화칼륨, ACS 시약, 99.0-100.5%Sigma-AldrichP3911-500G
인산칼륨, 일염기성, ≥ 99.0%, ACS 시약Sigma-AldrichP0662-500G
염화나트륨Sigma-AldrichS9888-500G
인산나트륨, 일염기성, 일수화물EMD MilliporeSX0710-1
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99.8+%, ACS 시약Sigma-Aldrich252859-500G
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 ConjugateInvitrogenC21421
Syto 9InvitrogenS34854
Sypro RedInvitrogenS12012 또는 S6653
Biotè ne PBF 구강 린스GlaxoSmithKline해당 없음
리스테린 토탈 케어McNeil-PPC, Inc.해당 사항 없음

참고문헌

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
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  11. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).
  12. Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. Three-dimensional biofilm structure quantification. J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).

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