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방법 논문

자유롭게 마우스를 동작에 문제가있는 Perforant 통로 - 치아 이랑 (dentate gyrus) 시냅스의 장기 강화 작용

13.8K 조회수

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DOI:

10.3791/50642

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2013년 11월 29일

1Department of Engineering and Neuroscience Program, Trinity College

이 논문에서

요약

신경 질환의 유전자 변형과 녹아웃 마우스 모델은 정상 및 비정상 신경 생리학에있는 유전자의 역할을 공부하는 데 유용합니다. 이 문서는 장기 상승 작용, 유전자 변형에, 학습과 기억의 기초 및 신경 병리학의 마우스 모델을 행동 자유롭게 녹아웃 수있는 세포 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

초록

시냅스 효능의 장기 상승 작용의 연구는 잠재적 인 세포 메커니즘을 기본 학습 및 정보 저장 등이 매력적 특성을 갖는 활동에 의존하는 시냅스 현상은 오래 해마, 편도체의 다양한 신경 회로의 생리를 규명하는 데 사용되었습니다 및 기타 변연계와 대뇌 피질의 구조. 이 염두에두고, 신경 질환의 유전자 변형 마우스 모델은 학습, 감정과 정보에 관련된 신경 네트워크의 정상 및 비정상 시냅스 통신 유전자의 역할에 대한 이해를 개발하는 장기 potentiation (LTP) 연구를 수행하는 데 유용 플랫폼을 나타냅니다 처리. 이 문서는 안정적으로 자유롭게 행동 마우스에서 LTP를 유도하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법은 유전자 도입의 연구에 사용될 수 있고 자유롭게 신경 퇴행성 질환의 마우스 모델을 행동 녹아웃.

서론

유전자를 조작 할 수있는 기술의 개발은 거의 모든 신경 변성 및 신경 질환의 유전자 녹아웃 마우스 모델을 생산하고있다. 이것은 이전에 마우스 동물 모델에 큰 설치류에 사용되는 전기 생리학 연구 기법의 번역을 필요하게되었다. 하나의 신경 생리 학적 조사 기술은 여러 가지 신경 병리학 적 질환과 관련된 신경 세포의 네트워크 내에서 시냅스 연결의 효능을 테스트하기 위해 사용하는 장기 potentiation (LTP)입니다. 이 프로토콜은 자유롭게 마우스를 행동에 LTP의 믿을 수있는 전기 생리학 연구에 대한 기술에 대해 설명합니다. 기타 이상이 프로​​토콜의 장점은 간단하고 구현하기 쉬운이며 그것이 고가의 컴퓨터 제어 마이크로 드라이브 시스템 또는 이용 전계 효과 트랜지스터 headstages의 이용도를 요구하지 않는 한도 적은 비용이다하고, 우리의 지식, 만성 전기 생리 레코딩의 t의 첫번째 비디오 프로토콜O 자유롭게 마우스를 행동에 LTP를 공부합니다. 이를 위해, 우리는이 문서에서 자유롭게 행동 생쥐의 장기 상승 작용을 연구하기위한 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 쉽게 신경 병리학 적 질환의 유전자 녹아웃 마우스 모델로 번역 할 수 있습니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 3, 18 세 30 ~ 50 g을 대략 체중 개월)의 마우스에 적합합니다. 마우스는 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 얻을 수 있습니다. 모든 수술 및 실험 프로토콜은 트리니티 대학 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라되었습니다했다.

1. 동물 준비 및 외과 적 치료

  1. 케타민 (25 ㎎ / ㎖), 자일 라진 (2.5 ㎎ / ㎖) 및 아세 프로 마진 (0.5 ㎎ / ㎖)을 포함 마취 칵테일을 준비합니다. 그 후 페달 금단 휘어진하여 마취 깊이 안정을 유지하기 위해 0.2 ㎖ / kg 주입에 의해 매 45 분을 보충 복부의 우측 사분면에 1 ㎖ / kg 체중을 주입한다.
  2. 전기 면도기를 사용하여 두개골에 모피를 면도 수술 마취 마우스를 준비합니다. 면도 영역은 귀 중간에 눈의 중간 부분을 포함해야한다. whiske 면도하지 않도록하십시오그들은 마우스 배럴 감각 시스템의 일부로서 RS.
  3. 머리에 면도 영역에 베타 딘 다음에 이소 프로필 알코올을 적용하기 위해 면봉을 사용합니다. 이어서,도 면봉을 사용하면, 안구 건조를 방지하기 위해 눈에 미네랄 오일의 소량을 적용한다.
  4. 고정대 장치에 동물의 머리를 탑재 유아 쥐의 귀 팔목 대신 일반 귀 막대를 사용하십시오. 이렇게하려면, 먼저 왼쪽 귀 팔목의 왼쪽 귀를 탑재합니다. 부드럽게 부드럽게 한 손으로 동물의 머리를 지원하고 다른 손으로 귀 팔목을 진행하여 오른쪽 팔목에 오른쪽 귀를 완화. 다음, 동물의 신체하에 가열 패드를 배치하고 체온을 유지하기 위해 86 ° F로 설정.
  5. 그런 측면, 헤드 측 이동을 시도하여 양자 강성을 확인합니다. 헤드는 고정식 및 좌우로 이동 될 수 있지만, 간단하게 상하 요동과 때 동물 적절히 고정대에 장착된다.
  6. 부드럽게 휴식코 / 치아 표시 줄에 마우스의 주둥이 어셈블리 앞니 코 / 치아 바의 치아 구멍 내에서 조심스럽게 안전하게 쉬고 있는지 확인하고.
  7. 멸균 메스를 사용하여 귀 중간 눈의 중간부터 정중선 절개를. 메스는 45 ° 각도로 유지하고 과도한 출혈 원인이됩니다 두개골을 통해 기본 근막을 통해하지만 절단하기에 충분한 압력을 적용 할 수 있는지 확인합니다.
  8. 근막을 분리하여 두개골을 노출하기 위해 면봉을 사용합니다. 두개골 브레 그마 관광 명소 및 람다 (그림 1A) 명확하게 볼 수 있어야합니다. 동물 브레 그마 및 람다 랜드 마크 같은 dorsoventral (DV) 위치 (+ 0.1 mm)에 있는지 등 코 / 치아 막대를 조정하여 두개골 평평한 위치에 있는지 확인하십시오.
  9. 노출 된 지역에 멸균 식염수의 작은 금액을 적용하고 부드럽게 두개골을 청소 면봉을 사용합니다. 그런 다음 완전히 건조 공기에 두개골에 대한 2 ~ 3 분을 기다립니다진행하기 전에.
  10. 브레 그마 및 람다의 DV 위치를 측정하기 위해 왼쪽 정위 팔에 바늘을 장착합니다. 이 두 랜드 마크의 DV 위치는 서로 0.1 mm 이내이어야한다. 그렇지 않다면, 고정대의 노즈 바는 조정될 수 있으며, 다운이를 위해.
  11. 그 전후방 (AP), 측면 (LAT)와 dorsoventral (DV) 측정을 기록 브레 그마에 바늘을 배치합니다. 바늘이 바로 두개골을 접촉하고 침투하지 않는해야합니다.
  12. 람다에 비해 해마의 각 번들과 치아 이랑 (dentate gyrus) (DG)의 중간 perforant 통로 (MPP)를 : 같은 목표 구조의 좌표를 결정하기 위해, 1 "정위에서 마우스 뇌 좌표"로 마우스 뇌 아틀라스를 사용 브레 그마 및는 각각 (표 1 참조). 그런 다음, 두개골에 이러한 점을 표시하는 좋은 볼펜이나 연필을 사용합니다.
  13. 또한, 두개골의 반대쪽에 두 개 이상의 지점을 표시합니다. 이 점 wHICH 접지 (GND) 및 참조 (REF)이 될 것입니다 중간 선에서 약 3mm해야하며, (그림 1A, 표 1) 서로에 대해 길이 방향으로 위치.
  14. 왼쪽 정위 팔에서 바늘 마커를 제거하고 정위 마운트를 장착 한 전기 치과 드릴로 교체합니다. 표시된 각 지점에 드릴을 놓고 직경 약 0.5 mm의 작은 버 구멍을 만든다. 드릴링, 반복적 상하 움직임을 사용하고 드릴 뇌 표면을 노출 두개골을 관통 여부 자주 확인하는 경우.
  15. 부드럽지만 확실히 그들은 단지를 관통하지 않고 대뇌 피질의 표면을 만지지 않도록 (그림 1A (# 0-80 스테인리스 기계 나사의 1 / 8, 머리 납작 슬롯) 반대측 구멍 (GND와 REF)에 각각 나사 전극을 구동 ). 이 두 개의 나사 전극은 접지와 기준의 역할을한다.
  16. 전기 마운트의 자극 및 기록 전극드 좌우 정위 팔 홀더였다.
  17. 다음 전기 생리학 차동 증폭기 (1,000 이득, 대역 통과 필터 = 1 Hz에서 3 kHz에서) 및 유발 반응의 육안 검사를위한 디지털 오실로스코프에 현재의 고립과 기록 전극 단자와 전기 생리학 자극에 자극 전극 단자를 연결합니다. 또한, 차동 증폭기에 GND 및 REF 전극 단자를 연결한다.
  18. 부드럽게 천천히 시각적으로 600 ~ 800 개 uA의 자극 충격을 유발 반응을 모니터링하면서 0.5 mm 단위로 자극과 기록 전극 모두 낮은. 그들은 각각의 대상 DV 위치에 도달하고 틀에 박힌 신호 오실로스코프 (그림 1B)에서 관찰 될 때까지 각 전극을 낮추기 위해 계속합니다.
  19. 그 후, 장소에 전극 단자를 개최 모자를 만들기 위해 치과 아크릴 시멘트를 사용, 피부에 닿는 모든 치과 시멘트 닦아냅니다즉시. 치과 용 시멘트가 완전히 깨끗한 설치류 케이지에 고정대에서 동물을 전송 경화되면. 코어 온도를 유지하도록 가열 램프 또는 패드를 사용한다.
  20. 이 의식을 회복 할 때까지 동물마다 시간을 모니터링합니다. flunixin의 주입은 진통제로 투여 될 수있다.

2. LTP 유도

  1. 동물 5-7일 수술에서 회복 할 수 있습니다. 방음 소재로 장착 된 패러데이 케이지 (122cm X 43cm X 43cm)와 전극이 자극 / 녹화 설정에 이르게 연결하는 5 채널 회전 정류기로 구성된 기록 환경에서 동물을 놓습니다.
  2. 동물 (1.17 단계를 참조하십시오) 자극 및 녹음 기기에 전극을 연결하기 전에 녹음 환경에서 1 ~ 2 시간 동안 적응 할 수 있습니다.
  3. 출력 400 uA의에 자극 컨트롤을 설정하고 확인 일을 만드는 반응을 유발 (10)의 평균 진폭을 기록자극 사이에 적어도 10 초 경과에. 유발 반응을 정량화하기 위해 그림 1C에 도시 된 방법을 사용합니다. 600, 800, 1,000, 1,200, 1,400 개 uA에 대해이 절차를 반복합니다.
  4. 자극 강도 대 유발 반응의 평균 진폭을 플로팅하여 입력 / 출력 곡선 작도. 이 도표에서 측정 된 최대 진폭의 50 %에 해당하는 자극의 강도를 결정합니다. 실험의 나머지 50 %의 강도를 사용합니다.
  5. 그 후, 50 %의 자극 강도를 사용하여, 5의 평균 진폭 응답 15 분 동안 매 순간을 유발 기록하여 기준선을 구하십시오. 다시 확인 자극 사이에 적어도 10 초 경과 확인하십시오.
  6. 그 후 중간 perforant 통로 5 Hz의 버스트 속도 400 Hz에서 전달 10 펄스의 10 버스트로 구성된 파상풍의 자극을 제공합니다. 젖은 강아지 쉐이크 등의 발작의 표시를 밀접하게 동물을 모니터링합니다. 동물 발작에게 experim가있는 경우ENT가 종료되어야하고 그 동물의 모든 데이터는 연구 결과에서 제외되어야한다.
  7. 그런 다음, 5의 평균 진폭 응답 30 분 posttetanization에 대한 모든 분을 유발 기록을 계속합니다. 그 후,베이스 라인의 퍼센트 변화 (그림 2)을 계산하여 2.5 단계에서 얻어진 기준 진폭이 진폭을 비교합니다.
  8. 실험의 결론에 따라, 동물은 미국의 의학 협회의 안락사에 대한 가이드 라인과 일치 이소 플루 란 - 방법의 흡입에 의해 안락사된다.

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결과

. 표 1은이 프로토콜에서 사용되는 DG와 MPP의 좌표 그림 1A는 두개골의 대상 구조의 표시를 보여줍니다 보여준다. 또한 접지 전극과 기준 전극의 위치는 제시된 그림 1B는 담당자가 응답을 추적 모두 사전 되살려줍니다 와 같은 동물에서 posttetanization. posttetanization가 응답.도 1c는 응답 진폭을 정량화하는 데 사용되는 방법을 도시 LTP 유도 2 나타낸다 pretetanization 응답보다 큰 유발합니다. 사실, 그림 2는 모두 사전 및 posttetanization의 기간에 걸친 시간의 과정을 통해 응답 진폭의 퍼센트 변화를 보여줍니다. 이것은 LTP 피크 값이 100 %를 초과하는 것을 주목하여야한다. 향상된 응답 진폭 다음 tetanization의 이러한 결과는이 프로토콜은 LTP 공부를위한 성공적인 따라서 신뢰할 ...

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토론

이 프로토콜에서는, 우리는 자유롭게 행동 마우스에 DG에서 LTP 공부를위한 안정적이고 간단한 방법을 증명하고있다. 깨어있는 쥐에서 LTP의 많은 연구가 3,4를 수행하는 동안, 거의가 주로 생쥐의 제한 두개골 부동산 및 평균 체중을 기준으로 전극 headstages의 무게에 의해 제기 된 기술적 인 복잡성에 깨어 마우스에서 수행되었다 마우스 5. 자유롭게 마이크로 드라이브 전극 시스템 또는 접합 전계 효과 트랜지스터 반드시 동물 6-10 행 전극 페이로드에 추가 부담 headstage에 통합 (JFET) 프리 앰프 하나 살린 생쥐에서 행동 DG의 LTP를 보여준 몇몇 연구. 본 프로토콜의 의미는 그것이 마이크로 드라이브 전극 시스템의 사용 또는 headstage JFET의 일어나지 않도록 자유롭게 생쥐에서 행동 DG에서 LTP를 유도하기위한 기존의 방법에 비해 개선을 나타내고 있다는 것이다.

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

박사 조셉 Bronzino 박사 카 미스 아부 Hassaballah 씨 RJ 오스틴 LaFrance 및 양 제시카 Koranda : 저자는 다음을 인정하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
케타민(100mg/ml)Henry Schein10177
자일라진(20mg/ml)Henry Schein33197
아세프로마진(10mg/ml)Henry Schein2177
치과용 아크릴 분말, Lang Dental Manufacturing Co.1330CLR
치과 아크릴 액체Lang Dental Manufacturing Co.1306CLR
텅스텐 와이어 (0.127 mm)World Precision InstrumentsTGW0515
스테인레스 스틸 피하 튜브 (0.286 mm)World Precision Instruments832400
Flunixin (50 mg / ml)Henry Schein14165
EpoxilyteSuperior EssexEP 6001-M
스테인레스 스틸 와이어 인서트 (0.2 mm)World 정밀 기기792900
입체 프레임 장치Kopf InstrumentsModel 902
이어 커프 (이어 컵)Kopf Instruments모델 921
전기 생리학 자극기Astro-Med, Inc.S88
디지털 오실로스코프B K Precision Corp.2542
전류 절연 장치Astro-Med, Inc.PSIU-6
차동 증폭기World Precision Instruments, Inc.DAM-50
정류자플라스틱 1SLC6
치과 드릴Stoelting58650

참고문헌

  1. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).
  2. Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 331-356 (1973).
  3. Blaise, J. H., Bronzino, J. D. Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats. Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).
  4. Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats. Brain Res. 1193, 25-33 (2008).
  5. Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse. J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).
  6. Cooke, S. F., et al. Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse. J. Physiol. 574, 805-818 (2006).
  7. Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse. J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).
  8. Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior. Hippocampus. 11, 391-396 (2001).
  9. Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation. J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).
  10. Tang, J., Dani, J. A. Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine. Neuron. 63, 673-682 (2009).

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