제브라 피쉬, 작은 열대어, 척추 발달과 질병 중 유전자 기능 연구를위한 대중적인 모델이되고있다. 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현에 의해 결정될 수있다 현장에서 하이브리드. 우리의 향상된 프로토콜은 낮은 비 특정 배경 신호를 낮은 풍부한 성적 검출 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 문서에서는 제브라 피쉬 배아의 현장 하이브리드 화 (소원)의 전체 마운트에 초점을 맞추고 있습니다. 소원 기술은 조직의 분포와 발달 단계의 측면 모두에서 유전자 발현의 평가를 용이하게합니다. 프로토콜은 digoxigenin으로 표시 안티센스 RNA 프로브를 사용하여 제브라 피쉬 배아의 소원의 사용을 설명합니다. 프로브는 복제와 선형화 된 유전자 템플릿의 시험 관내 전사의를 통해 digoxigenin 연결된 뉴클레오티드를 통합하여 생성됩니다. 정의 개발 단계에서 수확 배아의 chorions는 특정 프로브를 배양하기 전에 제거됩니다. 여분의 프로브를 제거하는 세척 절차에 따라 배아는 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)와 결합 된 항 digoxigenin 항체 배양한다. 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)에 대한 발색 기판을 채용하여, 특정 유전자의 발현을 평가 할 수 있습니다. 유전자 발현의 수준에 따라 전체 절차는 2-3 일 이내에 완료 할 수 있습니다.
서론
제브라 피쉬 (Danio rerio)는 척추 동물의 개발, 질병, 행동의 연구를위한 강력한 동물 모델로 등장하고있는 약물 검사 1-3습니다. 제브라 피쉬 배아는 하나의 교차점에서 큰 숫자를 얻을 수 있습니다. 수정 및 개발 전 자궁 및 광학적으로 명확한 배아 신속하게 개발을 발생합니다. 중요한 발달 이벤트는 처음 48 시간 후 수정 (HPF) 동안 발생합니다. 이 기관 원기의 모양과 세포 분화의 시작을 포함합니다. 단백질의 최저 이상 발현은 안티센스 모르 (MO) 올리고 뉴클레오티드와 배아의 microinjection을 통해 달성하거나 하나 또는 두 개의 세포 단계 (825 HPF)에서 각각 mRNA의 할 수 있습니다.
제브라 피쉬 배아의 소원이 그 특정 유전자의 시공간적 표현의 연구를 용이하게합니다. 소원 기술의 응용 프로그램은 오버 EXPR을 발현 또는 MO와 배아의 microinjection에 따라ESS 또는 최저 특정 단백질 수준이 다른 유전자의 차등 규제를 보여준다.
유전자 발현 패턴의 변화는 표현형의 변화와 상관 관계와 초기 형성기 동안 표적 유전자의 기능을 표시 할 수 있습니다. 프로브를 준비하고 사전에 저장 될 수 있기....
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프로토콜
1. 제브라 피쉬 배아의 현장 하이브리드 화에서 전체 마운트
배아의 1.1 준비
- 필요한 발달 단계에서 배아를 수집합니다. 배아 단계에 대한 설명은 킴멜 등 5.를 참조하십시오.
- 수동 집게 (뒤몽 시계 제조는 않습니다. 5 포셉 없음)를 사용 chorions를 제거합니다.
- PBS에서 만든 파라 포름 알데히드의 4 % 용액 (PFA)에서 배아를 고정 4 ℃에서 하룻밤 (인산염 완충 식염수)
- 3 배 이상 실온에서 5 분 각각 PBS와 배아를 씻으십시오.
- 현장 하이브리드 화에서 전체 마운트를 포함하여 기술의 미래 응용 프로그램에 사용되는 때까지 -20 ° C에서 100 % 메탄올 (메탄올)에 보관 배아.
- 동결 -80 ° C.에서 RNA 추출 및 저장을위한 액체 질소에 배아를 개최
- 무대 배아에서 RNA를 추출하여 PCR 증폭 이후의 복제에 대한 cDNA를 합성.
Digoxygenin - 표시 RNA 프로브 1.2 합성
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결과
바구니 당 50 배아 (유전자 당 / 실험 조건 당)이 유전자의 발현 패턴이 하나의 실험에서 얻을 수와 프로토콜을 사용하여. 거의 모든 배아는 특정 유전자와 유사한 발현 패턴을 보여줍니다. 원위치 하이브리드 염색의 대표적인 예는 그림 3-6에 표시됩니다.
감각과 안티 센스 모두 riboprobes은 PC5.1에 해당하는 cDNA를, PC5.2 6 SCL/tal-1 7, GATA-1 8,9, FLK / kdrl 10, 쉿 11 dlx2 12 fkd7에서 합성 하였다 / foxa1 13, 인슐린 14,15, 트립신 16 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소를 사용하여 전체 길이의 mRNA의 세그먼트를 증폭하여 구성하고, pCRII-TOPO (I.......
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토론
우리는 높은 해상도로 RNA를 시각화하는 개선 된 방법을 개발했습니다. 현장 하이브리드 절차는 다공성 바닥 (그림 1) 간단한 사용자 정의 - 만든 바구니를 사용하여 수행됩니다. 배아는 무균 조건 하에서 상온에서 6 - 웰 플레이트에서 RNase가없는 솔루션을 사용하여 처리됩니다.
분리 할 배아 바구니는 다른 색깔 에펜 도르프 튜브에서 만들어집니다. 또는 테두리없이 바구니는 쉬운 방향으로 사용되며 특정 프로브에 해당하는 등 바구니에서 배아를 식별 할 수 있습니다.
65 Prehybridization 70 ° C 및 하이브리드 ° 50 %의 탈 아미드와 C는 고해상도 신호를 얻기 위해 특히 중요한 것으로 밝혀졌다. 또한 15 분 포스트 PBST에 대한 알칼리 트리스 버퍼를 두 번 배아를 배양하는 안티 - DIG 항체와 BCIP의 면전에.......
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Taq 중합효소 | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA 클로닝 키트- 이중 프로모터 pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ 미니 플라스미드 정제 키트 | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 및 HindIII 제한 효소 | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| 완충액 포화 페놀, 초순수 | Invitrogen | 15513039 | 4°C에서 보관하십시오. 눈, 피부 및 호흡기 자극성 물질 및 발암 물질이 의심되는 물질. 취급하는 동안 주의해야 합니다. |
| 클로로포름 | Fisher | C607-1 | 독성 및 발암 의심 물질. 흄 후드 아래에서 작업하십시오. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | 작은 부분 표본을 준비하고 -20°C에서 보관합니다. |
| Sp6, T7 및 T3 RNA 중합 효소 | Roche | 11277073910 | |
| RNase 억제제 | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M 아세트산 나트륨 (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100 % 에탄올 | 상업용 알코올 | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC는 눈, 피부 및 호흡기 자극제입니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 보안경, 장갑, 마스크를 사용하십시오. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 m (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| 파라포름알데히드(PFA) | Sigma | P6148-1KG | -20°C에서 준비하고 보관하십시오. C는 나중에 사용할 수 있도록 40ml 분취량으로 사용합니다. PFA는 독성이 있습니다. 보안경, 장갑, 방진 마스크를 사용하십시오. |
| 페닐티오카르보마이드(PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC는 독성이 강합니다. 보안경, 장갑, 방진 마스크를 사용하십시오. |
| 메탄올 | 피셔 | A947-4 | |
| Dumont (시계 제작자 ' s) 겸자 패턴 번호 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| 바구니는 나일론 메쉬와 Eppendorf 튜브로 만들어집니다 | 사내 준비 | 바구니를 만들려면 테두리가 있거나 없는 Eppendorf 튜브(1.5ml)를 잘라 원뿔형 끝을 제거합니다. 나일론 메쉬를 크기에 해당하는 작은 조각으로 자릅니다. Eppendorf 튜브의 절단된 끝단. 절단된 끝을 덮는 나일론 메쉬가 있는 튜브를 전기 튜브와 나일론 메쉬가 서로 달라붙을 때까지 핫 플레이트(흄 후드에서 수행). 바구니에서 여분의 메쉬를 잘라내고 사용할 때까지 100% 메탄올에 보관하십시오. | |
| 폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트(트윈 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| 단백질분해효소 K | 발효 | EO0491 | |
| 아세트산 무수물 | 시그마 | 242845 | |
| 트리에탄올아민 | 시그마 | 90279-100ML | |
| 포름아미드, 고순도 등급 | 시그마 | F9037 | |
| AG501-X8 수지 | 바이오 라드 | 142-6424 | |
| 구연산 일수화물 | 시그마 | C0706-500G | |
| 헤파린 나트륨 소금 | 시그마 | H3393-25KU | |
| 식염수-구연산나트륨 완충액(SSC) | 시그마 | S6639 | |
| 베이커스 효모 X형 | 시그마 | R5636-1ML | |
| NaCl | 피셔 | S640-500 | |
| Tris-HCl | 피셔 | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| 레바미솔 염산염 | 시그마 | 31742 | |
| N,N-디메틸포름아미드 무수(DMF) | 시그마 | 227056 | 자극성, 독성, 가연성 및 기형 유발 물질이 의심됩니다. 장갑과 고글을 포함한 적절한 안전 복장으로 취급하십시오. |
| 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP) | Sigma | N6639 | 이 용액을 빛으로부터 보호하십시오. |
| 니트로블루 테트라졸륨(NBT) | Sigma | 840W | 이 용액을 빛으로부터 보호하십시오. |
| 소 혈청의 알부민, 정제 분획 V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg (mnx1 : GFP) ml2 / Tg (hb9 : GFP) ml2 | ZIRC | Tg (mnx1 : GFP) ml2 | |
| 인스턴트 오션 | 아쿠아리움 시스템 | N/A |
참고문헌
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
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