치료 화합물은 종종 첫 번째 생존 분석과 시험 관내에서 검사합니다. 인간의 관찰자에 의해 블라인드 세포 수는 세포 수의 작은 변화에 매우 민감 할 수 있지만 기능을 평가하지 않습니다. 컴퓨터 생존 분석, 여기에 설명 된대로 객관적인 구조와 기능을 모두 평가할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
현미경에서 수동 세포 수는 세포 생존 능력을 평가하는 중요한 수단이지만 시간이 많이 소요되므로 고가이다. 컴퓨터 생존 분석 장비의 측면에서 비용이 더 빠르고 더 객관적인 수동 세포 수보다 수 있습니다. 본 보고서는 이러한 세 생존 분석의 사용을 설명합니다. 이러한 분석의 두 적외선이며, 하나는 발광입니다. 두 적외선 분석은 16 비트 오디세이 이미 저에 의존하고 있습니다. 한 적외선 분석은 세포 기질에 대한 사파이어의 얼룩과 함께 핵의 DRAQ5 얼룩을 사용하고 700 nm의 채널을 시각화한다. 다른 적외선 분석, 인 - 셀 양식, 세포 골격 단백질 (α-tubulin의 또는 미세 소관 관련 단백질 2)에 대한 항체를 사용하여 800 nm의 채널을 레이블. 세 번째 생존 분석은 ATP를 위해 일반적으로 사용되는 발광 분석이지만, 우리는 비용을 절약하는 데 권장되는 볼륨의 내무반을 사용합니다. 이들 측정은 모두 선형 및 세륨의 개수와 상관 관계LLS 도금,하지만 감도에 따라 다릅니다. 세 가지 분석법은 시간 소모적 현미경을 회피하고 전체를 잘 샘플링함으로써 샘플링 에러를 감소시킨다. 마지막으로, 분석의 모든 쉽게 짧은 시간 프레임 내에서 수행되는 실험의 많은 수 있도록, 실험의 단부 중 하나 일 이내에 완료 될 수있다. 그러나, 그들은 모두 세포 수는 치료, 때때로, 특히 셀룰러 ATP에 대한 충족되지 않은 가정 후, 신호 강도에 비례하여 유지한다는 가정에 의존한다. 세포가 증가하거나 치료 후 감소 사이즈면 더욱이,이 세포 수에 영향을주지 않고 신호 강도에 영향을 미칠 수있다. 우리는 수동 계산을 포함한 모든 가능성의 분석은,주의 사항의 숫자에서 고통 결론하지만 컴퓨터 생존 분석은 초기 투자 가치가 있습니다. 세 가지 분석을 함께 사용하면 세포의 구조와 기능에 대한 포괄적 인 뷰를 생성합니다.
서론
생물 과학에서 가장 일반적인 생존 분석은 세포 수를 포함한다. 이것은 2013년 4월 29일 및 2013년 4월 30일의 키워드 중 하나 "시험관"또는 "문화"로 PubMed를 등장 최고 (가장 최근) (200) 출판물의 분석에 의해 입증된다. 이 간행물의 수동 세포 수의 계산을 포함하여 23.5 % 사용하는 세포 수의 분석은 자동화 된 세포 수는 이미징 소프트웨어를 사용하여 계산하고 트리 판 블루 배제. 라이브 / 데드 분석은이 책의 1 %에 사용되었다. MTT (3 - (4,5 - 디메틸 티아 졸 -2 - 일) -2,5 - 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드)하여 출판물의 개수 대사 생존력에 대한 분석은 11 %였다. 문학의이 조사는 또한 세포 수의 분석과 함께 같은 MTT 등의 분석을 사용하여 출판물의 수는 3.5 %였다 있음을 보여줍니다. 휴대폰 번호와 함께 세포 기능을 평가, 그 자체로 하나의 생존 분석을 사용하는 추세는 휴대 전을 평가하기위한 최선의 선택을 보인다에도 불구하고ntegrity. 나머지 세포가 기능 또는 그들이 잘 1,2에 존재에도 불구하고 건강한 수없는 경우가 있기 때문에 그 자체로 세포 수는 충분하지 않다. 반대로, 같은 ATP와 같은 기능적 수단 증가 또는 세포의 수가 병렬 변화의 부재에서 저하 될. 휴대폰 번호에서 대사 판독 값....
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프로토콜
프로토콜의 개략도는도 1에 도시되어있다.
1. 셀 도금
다른 도금 밀도 (그림 2)에서 96 - 웰 플레이트에 플레이트 세포. N2A 신경 모세포종 세포주, 플레이트 2.5K, 5K, 10K, 3 또는 6 우물 / 그룹에 잘 당 15,000 세포에 선형성을 확인하십시오. 쥐의 기본 대뇌 피질의 뉴런, 플레이트 25K, 50K, 100K, 3 또는 6 우물 / 그룹에 잘 당 200K 세포에서 선형성을 확인하십시오. 세포주 또는 그 일차 전지는 다른 도금 밀도, 플레이트 그 세포 유형에 대한 최적의 세포 밀도의 주위에 건강한 보면.
주 : 본 연구에서는 N2A 세포가 낮은 증발을 위해 설계 플레이트에 200 ㎕의 미디어에 100 ㎕의 미디어 및 기본 대뇌 피질의 신경 세포에서 도금했다. 세포 처리, 미디어, 혈청, 항생제, 독소의 치료에 대한 자세한 내용은 Unnithan 등을 참조하시기 바랍니다. N2A의 CEL에 대한LS 8 Posimo 등. 기본 피질 문화 22.
- 제 96....
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결과
이들 실험에서 속도 제한 요인은 ATP 분석이 비교적 짧은 기간이기 때문에, 적외선 염색법이다. 적외선 분석을 위해, 우리는 여덟 96 - 웰 플레이트 (그림 1 참조) 4 판 각각의 압도적 인 두 개의 일괄 처리에 의해 하루 만에 염색 검사 할 수 있다는 것을 기대하고 있습니다. 이 추정은 고정의 20 분을 가정, 세탁 30 분, 세척의 30 분 뒤에 2 시간 차 항체 배양을 차단 30 분, 액체의 30 분 뒤에 1 시간 차 항체 배양은 30 분 DRAQ5는 + 사파이어 30 다음 세척, 4 판에 대한 스캔 시간의 34 분의 분. 열 다섯 추가 분은 네 개의 개별 판의 엇갈린 피펫을 설명하기 위해 세척 그림 1에 반영됩니다. 데이터 분석을위한 시간이 추정에 포함되지 않습니다. ATP 분석 측정은 모든 적외선 플레이트 병렬로 발생하는 경우, 열두 판은 하루에 정량 할 수있다 - 적외선 얼룩 여섯s와 ATP 수준에 대한 여섯.
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토론
우리는 세 가지 생존 분석의 신호 강도가 선형 및 도금 밀도와 상관 관계가 있음을 발견했다. 그러나, 모든 분석은 2 배 또는 도금 밀도의 1.5 배의 변화에 동등하게 구분합니다. N2A 세포의 경우, 적외선 분석은 특히 낮은 도금 밀도에서, ATP 분석보다 덜 민감하다. 적외선 분석이 ATP보다 덜 민감하지만, DRAQ5 + 사파이어 분석 및 α-튜 불린 분석은 그들이 N-아세틸 시스테인의 높은 보호에 미치는 영향을 밝혀 잘 일치합니다. 이 두 분석으로 적외선 신호의 투여 량 - 반응 손실이고 세 생존 곡선은 N-아세틸 시스테인으로 오른쪽으로 시프트 하였다. α-튜 불린과 ATP 분석이 DRAQ5 + 사파이어 분석 (Unnithan 등의 그림 4 참조보다 암모늄 클로라이드 등의 화합물에 더 민감하게 반응하는 것 등이 중첩는 항상 N2A 세포 치료의 모든 종류의 관찰되지 않습니다. 8 ). 따라서, 생존 phenotypES는 항상 동일하게 세 가지 분석으로 표시되지 않습니.......
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공개 사항
저자 중에 공개 할 충돌이 없습니다.
감사의 글
우리는 ATP 분석에서 시약의 볼륨에 저장하는 아이디어 Juliann Jaumotte을 인정합니다. 우리는이 연구에 대한 재정 지원을 제공하는 메리 카루소, 뎁 WILLSON, 재키 파러의 약학 Mylan는 학교에 최상의 행정 지원에 대한 깊이 감사하고 있습니다. 감사는 또한 Hunkele 두려워한 질환 재단과 파킨슨 병 및 운동 장애 차 신경 세포 연구의 재정적 지원을위한 재단에 기인한다.
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참고문헌
- Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
- Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G.
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재인쇄 및 허가
