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방법 논문

문화의 세포에 대한 생존 분석 실험

46.2K 조회수

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DOI:

10.3791/50645

⸱

2014년 1월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

이 논문에서

요약

치료 화합물은 종종 첫 번째 생존 분석과 시험 관내에서 검사합니다. 인간의 관찰자에 의해 블라인드 세포 수는 세포 수의 작은 변화에 매우 민감 할 수 있지만 기능을 평가하지 않습니다. 컴퓨터 생존 분석, 여기에 설명 된대로 객관적인 구조와 기능을 모두 평가할 수 있습니다.

초록

현미경에서 수동 세포 수는 세포 생존 능력을 평가하는 중요한 수단이지만 시간이 많이 소요되므로 고가이다. 컴퓨터 생존 분석 장비의 측면에서 비용이 더 빠르고 더 객관적인 수동 세포 수보다 수 있습니다. 본 보고서는 이러한 세 생존 분석의 사용을 설명합니다. 이러한 분석의 두 적외선이며, 하나는 발광입니다. 두 적외선 분석은 16 비트 오디세이 이미 저에 의존하고 있습니다. 한 적외선 분석은 세포 기질에 대한 사파이어의 얼룩과 함께 핵의 DRAQ5 얼룩을 사용하고 700 nm의 채널을 시각화한다. 다른 적외선 분석, 인 - 셀 양식, 세포 골격 단백질 (α-tubulin의 또는 미세 소관 관련 단백질 2)에 대한 항체를 사용하여 800 nm의 채널을 레이블. 세 번째 생존 분석은 ATP를 위해 일반적으로 사용되는 발광 분석이지만, 우리는 비용을 절약하는 데 권장되는 볼륨의 내무반을 사용합니다. 이들 측정은 모두 선형 및 세륨의 개수와 상관 관계LLS 도금,하지만 감도에 따라 다릅니다. 세 가지 분석법은 시간 소모적 현미경을 회피하고 전체를 잘 샘플링함으로써 샘플링 에러를 감소시킨다. 마지막으로, 분석의 모든 쉽게 짧은 시간 프레임 내에서 수행되는 실험의 많은 수 있도록, 실험의 단부 중 하나 일 이내에 완료 될 수있다. 그러나, 그들은 모두 세포 수는 치료, 때때로, 특히 셀룰러 ATP에 대한 충족되지 않은 가정 후, 신호 강도에 비례하여 유지한다는 가정에 의존한다. 세포가 증가하거나 치료 후 감소 사이즈면 더욱이,이 세포 수에 영향을주지 않고 신호 강도에 영향을 미칠 수있다. 우리는 수동 계산을 포함한 모든 가능성의 분석은,주의 사항의 숫자에서 고통 결론하지만 컴퓨터 생존 분석은 초기 투자 가치가 있습니다. 세 가지 분석을 함께 사용하면 세포의 구조와 기능에 대한 포괄적 인 뷰를 생성합니다.

서론

생물 과학에서 가장 일반적인 생존 분석은 세포 수를 포함한다. 이것은 2013년 4월 29일 및 2013년 4월 30일의 키워드 중 하나 "시험관"또는 "문화"로 PubMed를 등장 최고 (가장 최근) (200) 출판물의 분석에 의해 입증된다. 이 간행물의 수동 세포 수의 계산을 포함하여 23.5 % 사용하는 세포 수의 분석은 자동화 된 세포 수는 이미징 소프트웨어를 사용하여 계산하고 트리 판 블루 배제. 라이브 / 데드 분석은이 책의 1 %에 사용되었다. MTT (3 - (4,5 - 디메틸 티아 졸 -2 - 일) -2,5 - 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드)하여 출판물의 개수 대사 생존력에 대한 분석은 11 %였다. 문학의이 조사는 또한 세포 수의 분석과 함께 같은 MTT 등의 분석을 사용하여 출판물의 수는 3.5 %였다 있음을 보여줍니다. 휴대폰 번호와 함께 세포 기능을 평가, 그 자체로 하나의 생존 분석을 사용하는 추세는 휴대 전을 평가하기위한 최선의 선택을 보인다에도 불구하고ntegrity. 나머지 세포가 기능 또는 그들이 잘 1,2에 존재에도 불구하고 건강한 수없는 경우가 있기 때문에 그 자체로 세포 수는 충분하지 않다. 반대로, 같은 ATP와 같은 기능적 수단 증가 또는 세포의 수가 병렬 변화의 부재에서 저하 될. 휴대폰 번호에서 대사 판독 값의 연결을 풀기는 ATP와 MTT 분석이 유일한 생존 분석으로 사용하지 말아야하는 것이 좋습니다. 본 보고서에서는, 세포 구조와 대사 기능을 모두 조사 세 생존 분석은 감당할 수있는 그 자체로 하나 분석보다 세포의 무결성을보다 포괄적 인 뷰에 대해 설명합니다.

우리의 분석의 두 개는 700과 800 nm의 채널에서 형광을 측정하는 적외선 이미 저를 필요로합니다. 잡음은 높은 신호 - 대 - 잡음 비 (3)에 이르는, 적외선 파장에서 낮다. 우리가 사용하는 오디세이 화상 카메라는 4.5 로그 동적 범위와 16 translatin의 비트 깊이적외선의 2 (16) 또는 65,536 그늘에 g. 이뿐만 아니라, 각각의 파장에 대해 색이 8 또는 256 음영을 수득 8 비트 컬러 이미징, 대조 할 수있다. 따라서, 16​​ 비트 영상은 미세한 해상도를 가지고 있습니다. 원래 적외선 이미지는 종종 프레젠테이션 게시 된 보고서에 (800 NM)과 적색 (700 nm의) 녹색 모조 착색되는 것을 주목해야한다. 오디세이 화상 카메라는 일반적으로 웨스턴 블로 팅과에서 셀 서부 4-7 모두에 사용됩니다. 에서 셀 포름 알데히드 고정 된 세포에 서부는 관심의 단백질에 대한 일차 항체를 사용하여 적외선 형광 보조 항체 차례로 레이블을 지정. 이 기술은 인산화 엔드 포인트 6에 특히 유용한 것으로 알려져있다. 우리의에서 셀 서부에서, 우리는 세포 골격 단백질 α-튜 불린 또는 800 nm의 채널에서 신경 미세 소관 관련 단백질 2 (MAP2)에 대한 고정 된 세포를 얼룩. 이들 단백질은 높은 신호 - 대 - 잡음 비를 수득 할 정도로 풍부하다. 우리는 또한 700에있는 우리의 판을 얼룩DRAQ5의 얼룩과 사파이어 얼룩 세포질에 대한 핵에 대한 나노 채널. 세포 골격 단백질과 DRAQ5 + 사파이어 얼룩 두 따라서 세포 구조를 반영합니다.

제 생존력 분석은 대사 기능을 측정하여 호출 "셀 역가 글로."이 루시페라아제 기반 분석에서, 발광 값 ATP 농도에 정비례한다. ATP 분석은 일반적으로 가능한 세포에게 8-12을 정량화하는 데 사용됩니다. 셀 당 ATP 출력 독소 치료의 함수로 변경할 수 있기 때문에, 분석의 이름으로 단어 "역가"를 포함하는 것은 다소 명칭이 잘못된 것입니다 및 휴대폰 번호 8에 비례하므로 항상이다. ATP 농도는 13 시간주기 리듬에 의해 세포 분열 (14) 및 세포 분화 (15)에 의해 영향을받을 수있다. ATP 대사의 강력한 측정하기 때문에 그럼에도 불구하고, 여기에 표시된 ATP 분석을 수행 간단하고 유용합니다생존 16-21, 자체 수를 셀하지 않을 경우. 서부 따라서 혼자 하나 분석보다 세포의 무결성을보다 포괄적 인 사진을 얻을 수에서 셀 적외선을 보완하기 위해이 분석을 사용하여.

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프로토콜

프로토콜의 개략도는도 1에 도시되어있다.

1. 셀 도금

다른 도금 밀도 (그림 2)에서 96 - 웰 플레이트에 플레이트 세포. N2A 신경 모세포종 세포주, 플레이트 2.5K, 5K, 10K, 3 또는 6 우물 / 그룹에 잘 당 15,000 세포에 선형성을 확인하십시오. 쥐의 기본 대뇌 피질의 뉴런, 플레이트 25K, 50K, 100K, 3 또는 6 우물 / 그룹에 잘 당 200K 세포에서 선형성을 확인하십시오. 세포주 또는 그 일차 전지는 다른 도금 밀도, 플레이트 그 세포 유형에 대한 최적의 세포 밀도의 주위에 건강한 보면.

주 : 본 연구에서는 N2A 세포가 낮은 증발을 위해 설계 플레이트에 200 ㎕의 미디어에 100 ㎕의 미디어 및 기본 대뇌 피질의 신경 세포에서 도금했다. 세포 처리, 미디어, 혈청, 항생제, 독소의 치료에 대한 자세한 내용은 Unnithan 등을 참조하시기 바랍니다. N2A의 CEL에 대한LS 8 Posimo 등. 기본 피질 문화 22.

    1. 제 96 - 웰 플레이트에 도금을 반복합니다. 하나의 플레이트 ATP (그림 2A)에 대해 분석하고, 적외선 분석 (그림 2B)와 다른 것입니다. 세포가 세포 내 ATP 측정을 위해 열린 용해되어야하기 때문에 하나는 ATP와 적외선 분석에 대해 동일한 플레이트를 사용할 수 없습니다.
    2. 최적의 도금 밀도 (; 그림 2B 2 열)에서 적외선 분석의 배경 빼기 적어도 3 여분의 우물을 판에해야합니다.
  2. 행과 H 및 열 1에서 12의 외부 우물에 더 저렴하게 세포가없는 미디어 나, 멸균 물을 추가합니다. 생존 미디어 증발 온도 구배의 영향으로 낮은 여기 자주로, 가장자리를 따라 우물의 데이터에 의존하지 마십시오. 마이크로 플레이트와 이러한 문제는 일반적으로 가장자리 효과 (23, 24)라고합니다. 비어있는이 우물을 보관하지 마십시오다음 행 B와 G 및 열 2 (11)는 가장자리 효과로 고통 때문이다.
    가장자리 효과는 CO 2 인큐베이터 (24)로 전송하기 전에 주변 조건에서 실온에서 갓 시드 플레이트 잠복기에 의해 감소 될 수있다. 또한, Carralot의 최근 연구는 단일 제어 칼럼 (23)를 사용하여 마이크로 플레이트에 대한 수학 보정 방법에 대해 설명합니다. 올리버와 동료는 열 구배 (25)을 줄이기 위해 특별히 설계된 강제 공기 microtitration 판 인큐베이터를 사용했습니다. 에지 효과가 중요한 관심사 인 경우, 마이크로 안정성 챔버 (예를 들어, BT & C 법인)은 높은 습도와도 온도 구배를 가진 균일 한 미세 환경을 만들기 위해 구입하실 수 있습니다.
  3. 추가적인 시약 희석액 이상의 도금 밀도가 테스트되기 때문에도 1에 도시 된 것보다 더 많은 웰이 필요한 경우, 배경 공제 에지 웰을 사용한다.
  4. 부착을 위해 밤새 대기세포 분석 및 후술 이튿날 아침의.

2. 발광 ATP 분석

  1. 버퍼 기판의 재구성 및 배양 시간에 대한 세포 역가 글로 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.
    1. 각각 도금 미디어의 100 또는 200 ㎕의 50 또는 150 ㎕의 매체를 제거합니다. 약간 적은 50보다 μL은 잘 배후에 남아있을 것입니다. 1:2 희석에 열을 2-6 (그림 2A)에 시약 (기판 플러스 버퍼)의 25 μl를 추가합니다.
      참고 : 제거가 차별적으로 우물을 통해 ATP 분석 시약을 희석 또는 농축 수 후 미디어의 가변 볼륨이 남아. 모든 멀티 채널 피펫 팁에있는 액체의 수준이 상당 수 있도록주의하십시오. 즉시 정확성을 보장하기 위해 ATP 분석 시약을 추가하기 전에 피펫와 함께 접시에 걸쳐 선택 우물에 남아있는 액체를 측정합니다. 높은 변동성 미디어 에바의 차등 요금에서 존재하는 경우플레이트의 표면을 가로 질러 ATION 모든 이전 미디어를 제거하고 즉시 ATP 분석 시약의 첨가 전에 모든 웰에 신선한 미디어 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 동일 부피를 추가한다. 판 증발의 변수 수준에서 고생하는 경우, 코스타 (Costar) 코닝의 낮은 증발 접시로 전환하려고합니다. 후자의 번호판,도 2에 도시 된 60 웰 내부는 0.995 %의 평균에서 0.41 미디어 증발 밤새 ± 고통. 분석시의 매체 볼륨 무시할 가변성 따라서있다.
    2. 위에 설명 된대로 열에서 7 ~​​ 11, 행 B D를 통해, 뒤에 50 μl를 떠나 충분한 용지를 제거하고, 1:1 희석 시약의 5​​0 μl를 추가합니다.
    3. 열에서 7 ~​​ 11, G 통해 행 E는 미디어 100 μl의 세포를 떠나 1:1 희석 다시, 시약 100 μl를 추가합니다. 이 회사는 시약 100 μL 미디어 100 μL에 1:1로 희석해야하는 것이 좋습니다.
      참고 : 위해비용을 절약하기 위해서는 볼륨에 희석 모두 이러한 권장 사항을 절단 할 수 있습니다. 그러나,이 일을하기 전에, 그것은 분석의 선형성과 민감도를 감소시키지 않도록.
    4. 하나의 특정 볼륨과 시약의 희석 배수가 만족스러운 것으로 판명되면, 이후의 모든 실험에서 그들과 함께 스틱. 만족스러운 데이터에 대한 기준은 결과 섹션에 설명되어 있습니다.
    5. 사용되지 않는 재구성 시약은 다시 냉동과 비용을 절약하기 위해 나중에 사용할 수 있습니다. 제조 업체에 따르면, 재구성 시약은 활동 ~ 3 % 손실 21 주 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. 2 분 또는 10 분 동안 경동 셰이커에 대한 궤도 셰이커에 접시를 놓습니다. 플레이트의 일부 다른 측정에 대해 분석되고 그것이 흔들릴 수없는 경우에만 그 우물에 단순 상하해서 피펫 팅으로 교반 매체. 그러나,이 공정 중에 생성 된 과도한 거품 르미을 방해nescent 출력.
    1. 10 분 시약을 첨가 한 후, 백색 96 - 웰 플레이트에 웰 내용물의 60 μl를 옮긴다. 그들은 위로 검출기를 향해 빛을 반사하기 때문에 발광 값은 명확한 또는 검은 색 판에 비해 흰색 번호판 높다.
      참고 : 우리의 경험에서, 세포가 다른 판에 비해 분명 코스타 (Costar) 판을 낮은 증발에 더 남아있다. 이러한 특정 번호판은 흰색 벽으로 판매하지 않습니다. 둘째, 벽 불투명하고 맑은 바닥 판은 완전히 명확 판보다 더 비싸다. 하나는 흰색 번호판에 발광 액체를 전송하는 경우, 흰색 번호판을 세척 할 수있는 모든 실험에 대한 새로운 흰색 번호판을 사용하는 비용 절감, 재사용. 액체를 전송하기 때문에 장기적으로 저렴 옵션입니다.
    2. 전에 플라스틱 전송 피펫 전구에서 강제 공기, 바람직하게는, 바​​늘 판을 읽거나 어떤 공기 방울을 팝. 1 초 적분 시간 (회사 추천!와 루미의 판 읽기NDS 0.25-1 초 충분한 적분 시간). ATP 분석 시약을 첨가 한 후, 판 10 ~ 12 분을 읽어보십시오. 길버트와 동료 (26)에 의해 그림과 같이 발광 신호, 빠른 붕괴 속도와 과도하기 때문에 타이밍, 다른 접시에 걸쳐 비교를 위해 중요합니다.
  3. (도 3 참조) 산점도에서 세포 수의 함수로서 플롯하고, 각 그룹에있는 3 또는 6 우물에서 발광 값을 평균. 해당하는 각 데이터 포인트에서 (11G - 2G, 우물 11B - - 11D, 11E 우물 우물 2B) 제 1 평균 적절한 빈 우물의 배경 발광 값을 뺍니다. 이 초기 실험 (그림 2A)에 각각 도금 밀도에 대한 세 가지 그룹이 될 것입니다. ATP 수준은 선형 적으로 이러한 그룹 중 하나 또는 모두에 세포 밀도와 상관 관계가 될 수있다. 여전히 비용에 저장하는 만족스러운 결과를 얻을 수 있습니다 시약의 높은 희석을 진행합니다. 만족스러운 결과에 대한 기준을 설명하는 난N 결과 섹션.
    주 : 본 연구에 사용 된 미디어로,이 분석 배경 값이 높지하고 빈 우물을 생략 할 수있다. 그러나, 제조 업체 프로 메가는 서로 다른 문화 매체와 발광의 차이를보고합니다. 본 연구는 HyClone 사 태아 클론 III, N2A 세포 및 기본 대뇌 피질의 문화에 대한 소 혈청에 대한 소 태아 혈청의 합성 버전을 사용합니다. 제조 업체에 따르면, 혈청은 발광 값을 감소하지만 분석의 감도를 감소하지 않습니다. 이것은 중요한 관심사 인 경우 그럼에도, 분석시에 PBS 대신 미디어 ATP 분석 시약을 희석.
    1. 세포가 밤새 열 걸쳐 고르게 성장을 표시하는 경우, 도금의 6 시간 내에서 시금보십시오. 그러나 분석의 보통 시간 (치료 후 예를 들어, 24 시간)의 밀도가 선형성을 달성해야하는 밀도는 것을 명심.

3. InfrareD의 분석 실험

  1. 도금 후 아침, 흄 후드에서 실온에서 제 2 플레이트에 세포를 고정합니다. 포름 알데히드는 발암 물질이기 때문에이 단계에서 장갑을 착용하고 화학 폐기물로 정착 처리해야합니다. 1:1 희석에서 기존 미디어에 0.1 M 인산 버퍼에 4 % 포름 알데히드와 4 %의 자당을 추가합니다. 매체는 또한 전체 강도 고정액에 고정하기 전에 PBS로 씻어 수 있습니다. 어느 기술이 잘 작동합니다.
    1. 20 분 동안 고정액에서 부화 후 정착액을 제거하고 200 μl의 PBS로 3 회 세척한다.
  2. 분석은 같은 날에 개최하지 않을 경우 4 ° C에서 0.2 % 나트륨 아 지드와 PBS에 접시를 저장합니다. 그렇지 않으면, 분석을 진행하고 항체의 비특이적 결합을 최소화하기 위해 차단 솔루션에있는 세포를 놓습니다.
    1. PBS에서 물고기 혈청 오디세이 블록 1:1로 희석하고 셀 permeabilizer로 0.3 % 트리톤-X 100을 추가합니다. 충분히 차단 솔루션뿐만 아니라 기본 및 보조 antibo을DY 솔루션 35 μl를 각 웰에 피펫 할 수 있도록. 거품이 많이 피펫 동안 관찰되는 경우, 그렇지 않으면 거품이 아래로 바인딩에서 세포와 블록 항체에 도달, 각 웰에 대한> 50 μl를 확인합니다. 과도한 비누 거품이 잘 중간에 흠 원형 반점으로 나타납니다. 이 경우 피펫을 조정하려고합니다.
    2. 실온에서 30-60 분 동안이 블로킹 용액에 배양한다.
      주 : 차 항체와 동일한 종에서 5 % 소 혈청 알부민 또는 정상적인 혈청 또한 물고기 혈청 블록의 선정에 저장 솔루션을 차단로서 사용될 수있다. 솔루션을 차단하는 항체의 성능에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 각각의 항체에 대한 최적의 블록이 가장 경험적으로 결정합니다.
      참고 : 일부 연구자들은 배양시 셰이 커에서 셀 서양 판 놓습니다. 그러나, 이것은 필요하지 않다.
  3. 항-α-tubulin에 대한 1:10,000 희석 : 기본 항체를 확인(마우스 단일 클론, 표 1) 및 안티 MAP2 (마우스 단일 클론, 표 1)에 대한 1:2,000 희석. 이 항체는 이러한 세포 모델에서 관심의 단백질에 특정한 특이도는 면역 세포 화학 염색을 위해 필수적입니다.
    참고 : MAP2는 신경 세포 마커와 혼합 된 아교 / 연결을 문화에 적합합니다. 성상 세포는 그들의 숫자는 초기 신생아시기 27, 28 년을 정점으로, 배아 일 18에서 먼저 표시하기 때문에 여기에 표시된 출생의 문화 또한 일부 아교 (~ 25 %)를 포함합니다. 하나는 성상 세포 및 신경 세포 ATP와 DRAQ5 + 사파이어 분석을 구별 할 수 없습니다. 별도 뉴런과 성상을 측정 Mullett와 동료 4,29에 의해 설명 된대로, 800 및 700 nm의 채널에서 동시 MAP2와 GFAP 염색을 사용, DRAQ5 + 사파이어를 떠나하기 ​​위해. 문화의 모든 세포가 평가되어야 할 경우, 같은 α-튜 블린, β-액틴, 또는 GAPDH로 팬 세포 마커를 사용합니다.
    참고 :이 희석은 N2A 및 기본 대뇌 피질의 세포에 최적화 된 모든 모델에 일반화되지 않을 수 있습니다. 따라서 적어도 2 차 항체의 희석, 플레이트의 왼쪽 절반에 하나, 오른쪽 절반에 하나 (그림 2B 참조)보십시오. 또한, 3 우물 각각 차 항체의 3-4 희석을 시도합니다. 예를 들어, 항체 인서트 시트 추천 희석은 두 가지 변화 형벌 수있다. 면역 세포 화학에 대한 추천 희석 1:500 인 경우 즉,도 1:250 및 1:1000 희석 인자를 시도한다.
    1. PBS와 0.3 % 트리톤-X를 추가 1:1 오디세이 블록에 항체를 희석. 비용을 절감하기 위해, 인큐베이션 마지막에이 용액을 제거하여 단계 3.2.1에서 셀에인가 된 차단 용액에 항체를 만드는 시도. 이 일을하는 동안 PBS에 세포를 유지, 그들은 건조하지 않아야합니다.
    2. 하나 1 ~ 2 시간 실온에서 하룻밤 또는 4 ℃에서 차 항체에 품다 약하게 B에 대한항체과 풍부한없는 단백질을 inding, 하룻밤 배양 신호를 높일 수 있습니다.
      참고 : 각 보조 항체 농도 (우물 2B-2D 및 우물도 2b에 2 E-2G)에서 배경 빼기위한 솔루션을 차단에 최소 3 우물을 남겨주세요. 어떠한 차 항체에이 우물을 노출시키지 마십시오. 이들은 차 항체에 의한 비특이적 결합의 정도를 공개하고 신호대 잡음 비율의 계산에 유용하다. 이차 항체는 비특이적 결합의 높은 수준을 초래할 것이라는 우려가있는 경우에, 또한 주 또는 보조하거나 항체에 노출되지만 세척의 같은 번호를 수신하지 않는 대조군 웰을 포함한다. 이러한 웰과 "보조 전용"웰 간의 차이만으로는 이차 항체로 인한 비특이적 결합의 정도를 밝힐 것이다. 마우스 N2A 세포에 대한 우리의 테스트에서였다 혼자 항 마우스 이차 항체와 신호 강도 0.557 ± 0.032, 안티 - 토끼 신호혼자 차 항체가없는 차 항체와 신호, 0.357 ± 0.003 0.533 ± 0.041이었다, 수 있으며, 1 차 및 2 차 항체 신호는 11.867 ± 0.911이었다. 마우스 세포에 대한 항 마우스 이차 항체를 사용하는 경우에도 우리는 이렇게 비특이적 결합의 높은 수준을 관찰하지 않았습니다. 여러 제조업체의 적외선 차 항체가있다, 우리는 고도의 상호 흡착 사람을 구입하는 것이 좋습니다. 이차의 IgG 항체의 농도가 소스에 따라 변할 수 있음을주의한다.
  4. 또한, 10 분 각 당 200 ㎕의 PBS의 3 세척과 기본 항체를 씻으십시오. 차 항체는 0.2 % 나트륨 아 지드에 몇 주 동안 4 ° C에서 저장 솔루션이 빛을 개최 할 때 파편의 작은 반점이 명백해질 때까지 재사용 할 수 있습니다. 이는 비용을 절감하기위한 것입니다. 비용이 문제가되지 않는 경우, 사용할 때마다 신선한 항체를 확인합니다.
  5. 1시 1분 오디세이 블록에 1:1,000 또는 1:2,000으로 차 항체를 희석 : 0.3 % 트라이와 PBSt-X (그림 2B). 판의 아래쪽에 접시와 1:2,000의 위쪽 절반에 1:1,000 희석을 추가합니다. 이 농도는 추가 비용을 저장할 수 있지만이에 커밋하기 전에 선형성를 확인하기 위해 감소 될 수있다.
    참고 : 배경 빼기 우물 (그림 2B에서 2 열)에 대한 적절한 보조 항체 솔루션을 추가해야합니다.
    1. 두 번째 단백질은 DRAQ5 + 사파이어, 마우스가 아닌 다른 종의 차 항체와 800 nm의 채널에서 700 nm의 염소 항 - 마우스 IgG와 두 번째 단백질 α-tubulin의 또는 MAP2 레이블 세포의 위치에 정량 할 것이다. 800 nm의 채널은 700 nm의 채널보다 배경이 관심의 가장 중요한 단백질에 예약해야합니다.
    2. 멀리 빛의 서랍에 실온에서 1 시간 동안 차 항체에 품어.
  6. 또한, 10 분 각 당 200 ㎕의 PBS의 3 세척과 보조 항체를 씻어.
  7. DRAQ5 + 사파이어 솔루션을합니다. 접시의 왼쪽 절반을, DRAQ5 1:10,000 (0.5 μM 최종 농도)를 희석 PBS의 사파이어 1:1000 0.3 % 트리톤-X와 (열 3-6, 그림 2B). 판의 오른쪽 절반을, DRAQ5 1:20,000 (0.25 μM)를 희석 사파이어 1:2000 (열 7 - 10 일, 그림 2B).
    주 : 대신에 5 밀리미터 주식의 1 ㎜의 주식에 판매하는 데 사용 DRAQ5을. 일부 이전에 발행 된 보고서는 따라서 DRAQ5 8 1:4,000 또는 1:2,000 희석을 사용했다.
    1. 이 판을 동시에 정량되는 경우, 비용을 절감하기 위해, 동일한 DRAQ5 + 사파이어 해법은 제 1 플레이트를 벗어 피펫 팅과 제에 추가, 시퀀스에서 두 플레이트에 이용 될 수있다. 같은 솔루션이 방법으로 두 번 사용되는 경우에, 1 일 안에 그들을 사용합니다. 희석 DRAQ5 + 사파이어 솔루션은 4 ° C에 저장하거나 나중에 사용하기 위해 냉동 할 수 없습니다.
    2. 멀리 F 실온에서 30 분 동안 이러한 솔루션에서 부화롬 빛. 시간이 짧고 DRAQ5 + 사파이어 솔루션 단계 3.5 차 항체 솔루션에 이러한 얼룩을 추가하고 1 시간 동안 품어, 다른 보조와 다른 접시에 재사용 할 수 없습니다됩니다.
      참고 :이 우물은 700 nm의 채널에 스테인드해서는 안대로 배경 빼기 우물 (그림 2B에서 2 열)에 DRAQ5 + 사파이어 솔루션을 추가하지 마십시오.
  8. 10 분 각 웰 당 200 ㎕의 PBS와 플레이트 배를 씻으십시오. 플레이트는 적외선 이미징이 완료된 후 다른 가시 범위 이차 항체로 염색하는 경우는 최종 PBS 세척에 0.2 % 아 지드 화 나트륨을 넣어.
  9. 오디세이 이미 저 플레이트를 검사합니다. 강도 5 및 169mm 해상도에서 접시를 검색하여 시작합니다. "중간 품질"또는 "낮은 품질"설정 하나는 충분하다. 이 회사는 자세한 여기 / 방출 필터 정보를 공개하지 않습니다. 그러나, 배출 필터는 약 20 nm의 폭이며 7 중심 아르제조 업체에 따라 20 ~ 820 nm의.
    참고 : 연구자가 다른 마커로 얼룩을 계속 할 수 있으므로 그것은 아직 젖어있는 동안 판을 스캔 할 수 있습니다. 그러나,이 회사는 건판이 덜 잘 - 투 - 잘 신호 확산 될 자사의 온라인 프로토콜에 제안합니다. 데이터를 비교하는 것은 젖은 후 건조 모두를 스캔하는 경우, 증발 후 남은 염 가장자리를 따라 높은 배경 형광으로 이어질 수 있기 때문에 우물에서 모든 PBS를 제거해야합니다.
    1. 오디세이 이미 저를 스캔하고 접시의 바닥을 통해. 우물의 바닥 판에 자신의 두께와 깊이가 다양 할 수 있기 때문에 다른 제조 업체의 후판 다른 초점 오프셋을 요구할 수있다. 다른 초점 오프셋에서 스캔을 시도하고 볼 위치를 가장 높은 신호 대 잡음 비율과 상쾌한 호주 (초점 대부분의) 신호가 달성된다 : 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm, 4.0 mm. findin을 확인하기 위해 통치자와 접시의 바닥에서 우물의 깊이를 측정하는 것도 시도오디세이에 GS. 우물의 바닥에있는 플라스틱 눈금자 측정을 추가로 높이를 추가 할 수 있음을 기억하십시오. 본 연구에 사용 된 코스타 (Costar) 플레이트는 4.0 mm의 오프셋 초점을 요구한다.
    2. 접시의 이미지에 오른쪽 크기의 격자를 배치 및 Microsoft Excel로 데이터를 내보낼 소프트웨어에서 셀 웨스턴 기능을 사용합니다. 가장 높은 형광 값을 찾기 위해 다른 초점 오프셋에서 같은 우물의 "통합 강도"값을 검사합니다. ( "아니오 차 음성 대조군"웰 대 면역 염색 웰스 신호) 높은 신호 대 잡음비를 산출 오프셋 초점 이하 선택할 하나이다.
    3. 오프셋 하나의 초점에 결정되면, 더 작은 단위로 다시 스캔합니다. 밝은 신호가 3.5 및 4.0 mm였다 예를 들어, 3.6, 3.7, 3.8에서 스캔을 시도하고, 3.9 mm 및 신호 강도가 더 개선이 있는지. 오프셋 초점이 잘못되면, 빈 (PL)의 12 열에서 신호 강도대신에 평평한 라인의 U 자형 곡선으로 표시됩니다 (모든 열이 동일한 신호를해야 할 때) 먹었다. 이 플라스틱 판에 문제가 계속되면, 유리 바닥 판을보십시오.
  10. 700 및 800 nm의 채널에있는 모든 해당 데이터 점에서, 배경 빼기 우물 (2G - - 2D 또는 우물 우물 2E 2B 그림 2B)의 통합 강도의 평균을 뺍니다. 이어서 웰의 각 그룹에 대해 통합 된 신호 세기의 평균. 셀 밀도에 대해 산점도로서 데이터를 플롯 (도 3 참조).
    1. 일차 및 이차 항체와 후속 실험 한 각 희석에 정착하는 DRAQ5 + 사파이어의 두 가지 희석액의 결과의 두 가지 희석액의 결과를 비교. 선형성이 달성되지 않으면, 다른 강도로 스캔을 시도한다. 강도 3 대신 5 7 다시 스캔하고 데이터를 다시 분석합니다. 데이터는 그 강도 중 한 곳을 개선하지만, 경우여전히 만족하지 그 강도 정도 씩 다시 검사.
    2. 소프트웨어가 우물에 흰 반점을 보여줍니다 이미지를 분석하지 않도록주의하십시오, 그 장소는 이미 저의 범위를 벗어나 포화 신호를 의미. 이 경우 낮은 강도로 스캔합니다.
    3. 선형성이 달성되지 않은 경우, 그들은 성장 또는 하룻​​밤을 다른 컬럼에 불균일하게 죽을 수 있기 때문에 도금의 6 시간 내에서 세포를 해결하기 위해 또한보십시오. 또한 다른 도금 밀도, 다른 검사 강도, 시약 희석 요인, 바닥이 유리 접시, 핵 전용 얼룩 등 자체 DRAQ5, 또는 항-α-튜 블린 또는 방지 MAP2 이외의 다른 항체의 추가 최적화를 시도합니다.

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결과

이들 실험에서 속도 제한 요인은 ATP 분석이 비교적 짧은 기간이기 때문에, 적외선 염색법이다. 적외선 분석을 위해, 우리는 여덟 96 - 웰 플레이트 (그림 1 참조) 4 판 각각의 압도적 인 두 개의 일괄 처리에 의해 하루 만에 염색 검사 할 수 있다는 것을 기대하고 있습니다. 이 추정은 고정의 20 분을 가정, 세탁 30 분, 세척의 3​​0 분 뒤에 2 시간 차 항체 배양을 차단 30 분, 액체의 30 분 뒤에 1 시간 차 항체 배양은 30 분 DRAQ5는 + 사파이어 30 다음 세척, 4 판에 대한 스캔 시간의 34 분의 분. 열 다섯 추가 분은 네 개의 개별 판의 엇갈린 피펫을 설명하기 위해 세척 그림 1에 반영됩니다. 데이터 분석을위한 시간이 추정에 포함되지 않습니다. ATP 분석 측정은 모든 적외선 플레이트 병렬로 발생하는 경우, 열두 판은 하루에 정량 할 수있다 - 적외선 얼룩 여섯s와 ATP 수준에 대한 여섯.

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토론

우리는 세 가지 생존 분석의 신호 강도가 선형 및 도금 밀도와 상관 관계가 있음을 발견했다. 그러나, 모든 분석은 2 배 또는 도금 밀도의 1.5 배의 변화에​​ 동등하게 구분합니다. N2A 세포의 경우, 적외선 분석은 특히 낮은 도금 밀도에서, ATP 분석보다 덜 민감하다. 적외선 분석이 ATP보다 덜 민감하지만, DRAQ5 + 사파이어 분석 및 α-튜 불린 분석은 그들이 N-아세틸 시스테인의 높은 보호에 미치는 영향을 밝혀 잘 일치합니다. 이 두 분석으로 적외선 신호의 투여 량 - 반응 손실이고 세 생존 곡선은 N-아세틸 시스테인으로 오른쪽으로 시프트 하였다. α-튜 불린과 ATP 분석이 DRAQ5 + 사파이어 분석 (Unnithan 등의 그림 4 참조보다 암모늄 클로라이드 등의 화합물에 더 민감하게 반응하는 것 등이 중첩는 항상 N2A 세포 치료의 모든 종류의 관찰되지 않습니다. 8 ). 따라서, 생존 phenotypES는 항상 동일하게 세 가지 분석으로 표시되지 않습니...

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공개 사항

저자 중에 공개 할 충돌이 없습니다.

감사의 글

우리는 ATP 분석에서 시약의 볼륨에 저장하는 아이디어 Juliann Jaumotte을 인정합니다. 우리는이 연구에 대한 재정 지원을 제공하는 메리 카루소, 뎁 WILLSON, 재키 파러의 약학 Mylan는 학교에 최상의 행정 지원에 대한 깊이 감사하고 있습니다. 감사는 또한 Hunkele 두려워한 질환 재단과 파킨슨 병 및 운동 장애 차 신경 세포 연구의 재정적 지원을위한 재단에 기인한다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Cell Titer GloPromegaG7572더 비싼 10ml 수량을 구입하는 대신 100ml 수량과 부분 표본으로 구입하십시오. 재구성되고 사용되지 않은 시약은 -20°C에서 재동결할 수 있습니다. C 최소 21 주 동안
18 % 포르말린써모 샨돈9990244이 정착제를 구입하면 포름 알데히드 분말의 무게가 측정되고 용액이 끓는 것을 피할 수 있습니다. 증기에 대한 노출은 그로 인해 최소화됩니다
자당시그마 - 알드리치S0389포름 알데히드 용액에 이것을 첨가하는 것은 필수적이지는 않지만 고정 세포의 외관을 향상시킵니다
오디세이 블록LI-COR927-40003이 피쉬 세럼은 대량으로 구매하고 -20 °에서 동결할 수 있습니다; 장기 사용을 위한 C
Triton-X 100Sigma-Aldrich21568우리는 10% Triton-X 100의 원액을 4°C의 멸균수에 저장합니다. C
인산나트륨 일염기성피셔S468PBS 정제 또는 10x PBS 용액도 구입할 수 있지만 더 비쌉니다
산나트륨 이염기성피셔S373위 참조
아지드화나트륨 (250x)Ricca Chemical Company7144.8-16아지드화나트륨은 독성이 매우 강하므로 분말을 구입하지 마십시오. 우리는 사용한 모든 항체를 1x 아지드화나트륨에 4°C로 저장합니다. C 파편으로 오염될 때까지
마우스 안티-알파;-튜불린Sigma-AldrichT5168이 항체는 비싸지만 크게 희석될 수 있으며 특이성이 매우 높습니다
마우스 anti-MAP2Sigma-AldrichM9942이 항체는 비싸지만 특이성이 높습니다(In-Cell Westerns의 전제 조건)
800nm 염소 안티-마우스 IgGLI-COR926-32210다른 회사들도 적외선 2차 항체를 판매합니다. 고도로 교차 흡착된 항체를 구입하고 IgG의 농도가 소스 DRAQ5 Bio DR50200 status에 따라 다를 수 있다는 점에 유의하십시오.
이 화합물은 LI-COR에 의해 1mM
사파이어LI-COR928-40022
광도계PerkinElmerVICTOR3 1420 다중 라벨 카운터
Odyssey ImagerLI-COR에서 판매되었습니다.9201-01
셰이커/믹서연구 제품 국제248555
인

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