복제 cDNA를 같은 유전자를 역 참조 방식에서 재조합 arenaviruses의 구조는 연구자 arenavirus의 생물학의 다양한 측면, 특정 바이러스 유전자 산물의 역할뿐만 아니라, 서로 다른 특정 도메인 및 잔류의 기여를 조사 할 수 있습니다 . 마찬가지로, 인간의 병원성 arenaviruses을 방지하기 위해 효과적이고 안전한 백신의 생성에 새로운 가능성을 제공하는 백신 개발을위한 FDA 승인 세포주 (베로)의 유전학 기술을 역으로 수행합니다.
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방법 논문
FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
arenavirus 역 유전학의 개발 및 구현 arenavirus 필드 4에있는 중요한 돌파구를 나타냅니다. 자신의 게놈 소정의 돌연변이와 재조합 전염성 arenaviruses를 생성하는 기능과 함께 셀 기반 arenavirus의 minigenome 시스템의 사용은 arenavirus 라이프 사이클의 다른 단계 바이러스 성 결정 요인의 기여에 대한 조사뿐만 아니라, 바이러스 호스트를 촉진했다 상호 작용과 arenavirus 병인 1, 3, 11의 메커니즘. 또한, trisegmented arenaviruses의 개발은 따라서 arenavirus 기반의 백신 벡터 애플리케이션 5의 가능성을 열어, 그 밖의 외국 유전자를 표현하는 arenavirus 게놈의 사용을 허용하고있다. 마찬가지로, 표현 리포터 유전자 할 수있는 단일 사이클 전염성 arenaviruses의 개발 highl 관련된 연구의 안전을 개선하기 위해 새로운 실험 도구를 제공합니다Y 병원성 인간 arenaviruses 16. 플라스미드 기반의 역 유전학 기술을 사용하여 재조합 arenaviruses의 세대는 지금까지 식품 의약품 안전청의 개발 (FDA) 허가 백신 또는 백신 벡터에 대한 몇 가지 장벽을 포즈 7,19 설치류 세포주의 사용에 의존하고있다. 이 장애물을 극복하기 위해, 우리는 FDA의 승인을 베로 세포에서 재조합 arenaviruses의 효율적인 세대는 여기에 대해 설명합니다.
서론
Arenaviruses는 Arenaviridae 제품군에 속하는 bisegmented, 음의 가닥 RNA 게놈 3 싸여 바이러스입니다. arenavirus 게놈은 두 개의 분리 된 바이러스 세그먼트 3에서 ambisense 패션 개의 단백질을 인코딩합니다. 대형 (L) 부분은 RNA 의존 RNA 중합 효소 (L) 및 바이러스 신진의 주요 원동력 역할을하는 작은 링 (정말 흥미로운 새로운 유전자) 손가락 단백질 (Z) 인코딩합니다. 소 (S) 부분은 바이러스 핵 단백질 (NP)와 표면 당단백 (GP) (그림 1)를 인코딩합니다.
Arenaviridae 가족의 몇몇 일원은 인간 3 치명적인 출혈열 (HF)에 대한 책임이 있습니다. 원칙적으로 문제의 입원 환자 8, 9에서 높은 사망률을 일으키는 것으로 알려져 있습니다 라사 바이러스 (LASV)와 후닌 바이러스 (JUNV가) 있습니다. 이 바이러스는 각각 서부 아프리카와 농촌 아르헨티나에 발병하지만은,증가 여행 10에 의한 비 발병 지역에 LASV 및 JUNV의 수입 증가 우려가 있습니다. 일반적으로 인간의 심각한 질병과 관련이없는 있지....
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프로토콜
1. Arenavirus 구조 형질
우리의 구조 시스템은 핵 단백질 (NP)와 RNA 의존적-RNA 중합 효소 (L), RNA 복제 및 arenavirus 게놈의 유전자 발현에 필요한 바이러스 횡단 행동 요소를 인코딩 중합 효소 II의 단백질 발현 플라스미드 모두의 사용을 기반으로 한 7, 19, 및 세포 S의 RNA 중합 효소 I (POL-I) 및 L antigenome RNA 종 7을 통해 세포 내 합성을 지시 할 수있는 플라스미드. 우리의 연구에서 우리는 내가 발기인 및 쥐 종결 서열 (그림 2) 인간의 효소를 사용 pCAGGs 단백질 닭 β-액틴 프로모터 및 polyadenylanation (PA) 신호 시퀀스를 사용하여 플라스미드 표현하고, 인간의 폴-I 플라스미드를 사용 . S와 L RNA 세그먼트는 HPOL-I에 의한 전사에 따라 게놈 RNA 세그먼트의 생성을 허용 할 antigenomic 방향 HPOL-I 플라스미드에 복제됩니다. 야생 타이의 구조에 대한PE 재조합 LCMV (rLCMV)와 몰래 # 1 (rCandid # 1) pCAGGs NP 각 바이러스의 L은 각각의 인간의 폴-I S와 L RNA 세그먼트 (그림 3)와 함께 ....
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결과
재조합 야생형 arenavirus의 성공적인 구조는 IFA (그림 5)를 사용하여 바이러스 항원의 존재에 의해 확인됩니다. 재조합 trisegmented 바이러스의 경우, 성공적인 바이러스 성 구조는 형광 현미경 (그림 6A)에서 GFP 발현을 관찰하여 평가 될 수있다. 성공적인 구조는 더욱 Gluc 표현 (그림 6B)를 평가하여 확인됩니다. 야생 유형과 trisegmented arenavirus의 성공적인 구조를 보여주는 대표적인 결과는 위에 표시된 프로토콜을 사용 하였다.
그림 1. Arenavirus 게놈 조직과 virion의 구조. Arenaviruses는 bis.......
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토론
플라스미드 기반의 역 유전학 기술을 사용하여 재조합 arenaviruses의 생성은 arenavirus 생물학의 여러 가지 측면의 조사를 위해 널리 사용되는 방법이되고있다. 여기에 우리가 arenavirus를 수행하여 현재 시스템에 중요한 개선을 문서화하는 것은 다른 전염성 질병에 대한 arenaviruses 백신 벡터에 대한 FDA의 승인 백신 후보의 잠재적 인 발생을 허용, 베로 세포에서 구출.
관련 실험 절차는 잘 설립 된 일반에 상당한 장애물을 제기하지 않아야합니다. 신중하게 일관된 성공을 보장하기 위해 모니터링해야 여러 가지 요인이, 그러나있다. 베로 세포의 적절한 유지 관리는 성공적인 바이러스 성 구조 매우 중요합니다. 또한, 재조합 arenavirus를 (적절한 세포 유지 보수 및 플라스미드 준비를위한 프로토콜 참조)를 생성하는 좋은 플라스미드 준비가 필수적이다. rLCMV 및 rCandi의 구조에 대한D # 1 야생형이나 베로 세포가 쉽게
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 arenavirus 역 유전학 기술과 플라스미드의 개발 및 개선을위한 JCT 및 LM-S 실험실에서 과거와 현재의 회원을 감사드립니다. 우리는 또한 기술 지원 Snezhana Dimitrova 감사합니다. JUNV NP (SA02-BG12)로 지정 단클론 항체는 BEI 자원 (NIAID의 바이오 디펜스 및 신흥 감염증 연구 자료 저장소)로부터 얻은 것입니다. BYHC는 기관 루스 L. 키르 국립 연구 봉사상에서 허가 번호 GM068411에 의해 지원되었다. EO-R은 Fullbright-Conicyt (BIO 2008)와 로체스터 백신 원정대 (2012)받는 사람이다. EO-R 현재 지원은 로체스터 대학의 교수 개발 및 다양성 사무실에서 다양성과 학문적 우수성에 대한 박사 원정대에 의해 제공됩니다. LM-S 실험실에서 연구는 NIH 보조금 RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, 인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수의 NIAID 센터 (HHSN266200700008C)에 의해 재정 지원, 그리고바이오 디펜스 면역 모델링 (HHSN272201000055C)를위한 로체스터 센터의 대학.
JCT 실험실에서 연구 보조금 RO1 AI047140, NIH에서 RO1 AI077719, 및 RO1 AI0....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 재료 및 방법 | |||
| 세포주 Vero E6 (아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포)는 37 °로 유지됩니다. C 인큐베이터, DMEM 10 % FBS 1 % PS 내에서 5 % CO2 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, 카탈로그 번호 CRL-1586)에서 구할 수 있습니다. Plasmids hpol-I L을 제외한 모든 플라스미드는 37°C에서 성장할 수 있습니다. C, 16-18 시간 동안. 우리는 hpol-I L의 배양액을 30 °에서 재배하는 것이 좋습니다. C 24시간 플라스미드는 제조업체의 권장 사항에 따라 플라스미드 맥시 키트(EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek)를 사용하여 제조하고 -20°C에서 보관합니다. 정제된 DNA 플라스미드의 농도는 260 nm에서 분광 광도법으로 측정되며, 순도는 260:280 nm 비율을 사용하여 추정됩니다. 1.8-2.0 260:280 nm 비율의 제제는 바이러스 구조 목적에 적합한 것으로 간주됩니다. 또한 플라스미드 농도 및 순도는 아가로스 겔 전기영동으로 확인해야 합니다. Viruses rLCMV(Armstrong 53b) 및 rCandid#1을 구하기 위해 설명된 프로토콜은 생물 안전성 수준(BSL) 2 조건에서 실행할 수 있습니다. TCS 및 세포를 포함한 오염된 물질은 폐기 전에 멸균해야 합니다. 다른 아레나 바이러스를 구하려면 더 높은 BSL 시설이 필요할 수 있으므로 적절한 안전/보안 조치를 따라야 합니다. 조직 배양 배지 및 솔루션 DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM), 소 태아 혈청(FBS) 50ml, 100X 페니실린/스트렙토마이신(PS) 5ml. 4 °C에 보관하십시오. 이 배지는 Vero 세포의 유지 관리에 사용됩니다. Infectious Media: OptiMEM과 DMEM 10 %FBS 1 %PS의 2:1 혼합물. 4°C에 보관하십시오. 이 배지는 바이러스 감염 중에 사용됩니다. 10X 인산염 완충 식염수(PBS): NaCl 80g, KCl 2g, Na<>sub2HPO4.7H2O, KH2PO4 2g. ddH2O를 최대 1리터까지 추가합니다. pH를 7.3으로 조정합니다. 오토클레이브로 살균하십시오. 실온에서 보관하십시오 . 1X PBS : < / 강한> ddH 2 < / sub >O로 10X PBS 1:10을 희석하십시오. 오토 클레이브로 살균하고 실온에서 보관하십시오 . < >2.5 % BSA< / 강> : 1X PBS의 97.5 ml에 BSA 2.5g. 4 °C에 보관하십시오. 이것은 IFA의 차단 솔루션으로 사용됩니다. |
참고문헌
- Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
- Barton, L. L.
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재인쇄 및 허가
