Method Article

항체 염색법에 C. 엘레 "동결 크래킹 사용"

DOI:

10.3791/50664

⸱

October 14th, 2013

1Department of Biological Sciences, Ohio University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"동결 균열"선충 C.의 내부 조직을 노출시키는 방법 단백질의 지역화를위한 항체의 elegans는 보여줍니다.

Abstract

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C. 얼룩하려면 항체 엘레은 상대적으로 스며 들지 표피는 화학 물질 또는 기계적인 방법으로 우회해야합니다. "동결 균열은"물리적으로 두 개의 부착 슬라이드 사이에 선충을 압축을 동결하고, 떨어져 슬라이드를 당겨 선충에서 표피를 당겨하는 데 사용하는 한 가지 방법입니다. 동결 크래킹 화학적 처리없이 조직에 접근 할 수있는 간단하고 신속한 방법을 제공하고, 고정 제의 종류와 사용될 수있다. 그러나, 시편의 많은 손실로 연결하고 필요한 압축 기계적 샘플을 왜곡. 연습은 좋은 형태로 샘플의 회복을 극대화하기 위해 필요합니다. 동결 균열은 특정 고정 조건, 샘플의 복구, 또는 낮은 비특이적 염색에 최적화 된,하지만 모든 매개 변수에 대해 한 번에 할 수있다. 열심히 고정 조건을 필요로하고 화학적으로 표피를 투과하는 데 필요한 화학적 처리, treatmen를 허용 항체솔루션에 그대로 선충의 t는 바람직 할 수있다. 항체는 점화기 수정을 필요로하거나 최적 정착 조건이 알려지지 않은 경우에, 동결 크래킹 급속 항체을 검정하고 그 항원에 대한 특정 세포 내 및 세포 지역화 정보를 얻을 수있는 매우 유용한 방법을 제공하는 경우.

Introduction

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단백질의 세포 및 세포 내 현지화를 결정하기 위해, 과학자들은 전통적으로 구체적으로 특정 단백질 1을 인식하는 선택 항체와 조직을 표시했다. C와 같은 일부 모델 생물에서 엘레, 항체 염색은 종종 더 빠르게 결과를 얻을 분자 유전 학적 기술에 의해 대체되었습니다. 이들은 발기인 및 관심과 녹색 형광 단백질의 유전자의 코딩 영역 사이의 유전자의 융합으로 이루어진 구조로 변형 생물체 (가) 있습니다. 그러나, 분자 기술은 진정한 프로와 높은 사본 번호 (C. elegans의에서 통상의 기술) 2,3에서 구조의 발현의 변화를 알 수있는 문제를 포함하여 유물의 숫자로 될 수 있습니다. 따라서 항체 염색은 생체 내에서 단백질 기능을 연구 많은 과학자의 골이 남아있다.

항체와 조직을 염색하는 것은 어려울 수 있기 때문에tibodies는 특정 형태 1에서 자신의 항원을 인식 할 수 있습니다. 예를 들어, 항체는 특정 방식으로 고정 만 변성 또는 손상 항원을 인식 할 수 있으며, 현장에서 항원을 인식하지 못할 수 있습니다. 선충의 항체 염색의 문제는 선충의 표피 조직에 대한 항체의 액세스를 차단, 상대적으로 불 침투....

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Protocol

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참고 : 다중 프로토콜 단계를 설정 및 실험의 특정 조건에 따라 준비를위한 옵션이 표시됩니다. 이러한 경우, 다른 단계는 다른 단계와 프로토콜이 그림 1에 설명되어 있습니다 A, B, C 등으로 표시하고 있습니다.

1. 폴리 라이신 코팅 슬라이드의 준비

슬라이드의 세 가지 종류가 준비, 상대 밀착성, 및 항체의 비특이적 결합의 용이성 간의 희망 트레이드 오프에 따라 사용될 수있다. 슬라이드 준비 대안의 세부 밀착성 및 복잡성을 증가하는 순서의 단계 1A-1C에서 아래에 주어진다. 이러한 다양한 방법에 의해 제조 된 슬라이드는 하나의 실험을 위해 함께 사용될 수있다.

1A. 더 슬라이드 준비하지

상업적으로 이용 가능한 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드는 낮은 접착력과 낮은 배경을 제공합니다.

1B. 슬라이드 홍보메탄올, 아세톤 고정 용 eparation의 최적

중간 접착력과 낮은 배경.

  1. 슬라이드를 찍기 위해 폴리 라이신 솔루션을 준비 ....

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Results

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웜이 제대로 압축 금, 가볍게 고정하는 경우, 사실상 전체 웜 (그림 2 참조) 항체 염색법에 액세스 할 수 있습니다. DAPI 염색에 의해 표시된 바와 같이 핵의 위치는 웜의 일부 웜은 포름 알데히드 등 어렵게 정착액을 거치게 될 때의 부자연 물결 모양으로 된 것과 같이, 웜의 형태학 (그러질 그대로 나타냅니다 도 3A-D에있는 근육). 또 다른 일반적인 문제는 고르지 고정 또는 특정 조직의 침투이다. 이것의 예는 근육이 DNA 염색을 포함한 다른 염색의 존재는, (본체의 적어도 일부가 존재하는 것을 의미한다는 사실에도 불구하고, 오직 웜의 일부에 더러워도 3E-H에 도시된다 즉,) 동결 균열 중에 제거되지. 부분 얼룩의 발생 패턴은 쉽게 연습을 식별 할 수 있도록 전체 분배 블록염색에 단일 웜이 고르지 못한 염색을 표시도 확인할 수 있습니다.

동결 균열 어떤 고정 상.......

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Discussion

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동결 균열 프로토콜 C. 항체 염색을위한 여러 가지 방법 중 하나입니다 엘레. 그것은 벌레를 염색 할 수있는 비교적 간단한 방법을 제공하지만, 특정 시약을 필요로하고 최적의 결과를 위해 연습 않습니다. (그림 1에 나와있는) 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 슬라이드 준비 () 3 단계 참조 (2 단계와 3 단계) 빠른 고정을 참조하십시오 (1 단계와 선충의 2) 수동 압축을 참조하십시오. 첫째, 슬라이드에 선충의 밀착성을 최대화하기 위해, 대신 상업적으로 제조 된 슬라이드에 의존하는 고 분자량 (긴 중합체) 폴리 리신으로 슬라이드를 준비하는 것이 최상이다. 동결 균열 슬라이드는 전체 선충의 표피에 충실하도록 설계하는 동안 상용 슬라이드는 세포가 준수 할 수 있도록 폴리 라이신으로 코팅되어 있습니다. 둘째, 냉동 전에 슬라이드 사이에 벌레의 정확한 압축하는 절차는 매우 중요하다. 그것은 정확한 양을 사용하여 함께 슬라이드를 눌러 꾸준한 손과 연습이 필요개인 벌.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 그녀가 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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자금은 NSF CCLI 번호 0,633,618 및 오하이오 대학에 의해 제공되었다. 일부 변종은 Caenorhabditis의 유전학 센터에 의해 제공되었다. 대학원생 Reetobrata 바수는 비디오에 나타납니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
폴리 -L- 라이신 슬라이드 (ESCO 브랜드)Fisher12-545-78시그마 브랜드 슬라이드도 적합한
폴리 -L- 라이신 하이드로 브로마이드시그마P1524IMPORTANT:< / strong> 폴리리신 임계
단일 젖빛 가장자리 슬라이드Fisher48312-002다른 브랜드는
적합한 아지드 나트륨시그마입니다.S2002-25GTOXIC, 장갑과 마스크를 착용하고 분말의 무게를 달아 10%의 재고를 만드십시오. 원액
코플린 염색 항아리VWR47751-792다른 브랜드가 적합합니다
5-슬라이드 메일러전자 현미경 과학71549-01에 적합한 다양한 브랜드의 소형 슬라이드 홀더 중 하나
MK262159IMPORTANT: 일반 포르말린 용액(37% 포름알데히드)은 적합하지 않습니다. 1) 크라이사틀린 파라포름알데히드를 인산염 완충액에 용해시키고 냉동 상태로 작은 부분 표본에 보관합니다. 또는 2) 분취량에서 전자 현미경 등급 파라 포름 알데히드를 구입하십시오. 독성 - 장갑을 착용하십시오. 여분의 다운 싱크는 물과 함께 버리십시오.
글루 타르 알데히드 용액, 물 시그마G 5882< 강> 중 25 % 중요 : < / 강> 앰플에서 전자 현미경 등급 글루 타르 알데히드 구매; 독성 - 장갑을 착용하십시오. 여분의 다운 싱크는 물과 함께 버리십시오.
Triton X-100VWREM-9410다른 브랜드가 적합합니다
소 혈청 알부민피셔ICN820451다른 브랜드가 적합합니다
당나귀 혈청, 동결 건조Jackson Immunoresearch017-000-121다른 브랜드가 적합합니다
Cy3 당나귀 안티 마우스 IgG 다중 라벨링Jackson Immunoresearch715-165-150이 회사는 고품질 다중 라벨(affinity depleted) 항체에 권장됩니다. 적절한 염료와 항원(1차 항체를 형성하는 데 사용되는 동물)을 선택합니다.
n-프로필 갈레이트피셔ICN10274750다른 브랜드로는
적합한 DAPI, 4',6'-디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로라이드시그마D 9542. 장갑을 착용하고 작은 분취량에 분배하고 노출을 최소화하기 위해 피즈
하십시오. Whatman #1 15cm 직경 필터Fisher09805G
Coverslip #1 1/2 직사각형 24 x 60mmVWR48393-252#1 1/2 두께는 광학적으로 가장 좋습니다
. 현미경 슬라이드 폴더VWR48429-092다른 브랜드가 적합합니다.
의 브랜드 및 고분자량 를 배관할 때 장갑을 착용하십시오 파라포름알데히드 VWR 염색 독성이 있습니다

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Harlow, E., Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).
  2. Mello, C., Fire, A. DNA Transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  3. Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions.

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