Summary
Epidermal Melanin wird durch die topische Anwendung von Forskolin in einem murinen Modell der hellhäutigen UV-empfindliche Menschen verursachte. Pharmakologische Manipulation von cAMP-Konzentrationen in der Haut und Epidermis stark verdunkelt Schutz gegen UV-vermittelte Entzündungen (Sonnenbrand), wie durch die minimale erythematöse Dosis (MED)-Assay gemessen.
Abstract
Fairness der Haut, UV-Empfindlichkeit und Hautkrebsrisiko alle korrelieren mit der physiologischen Funktion des Melanocortin-1-Rezeptor, einen G s-gekoppelten Signalprotein auf der Oberfläche der Melanozyten gefunden. Mc1r stimuliert Adenylatzyklase und cAMP-Produktion, die wiederum, up-reguliert melanozytären Produktion von Melanin in der Haut. Um die Mechanismen, durch die Signalisierung Mc1r schützt die Haut vor UV-Schädigung zu untersuchen, diese Studie basiert auf einem Maus-Modell mit "humanisiert Haut", basierend auf epidermalen Expression von Stammzellfaktor (SCF). K14-SCF-transgenen Mäusen behalten Melanozyten in der Epidermis und haben daher die Fähigkeit, Melanin in der Epidermis abzuscheiden. In diesem Tiermodell, Wildtyp-Status Mc1r Ergebnisse in robuster Ablagerung von schwarzem Eumelanin Pigment und einem UV-geschützt Phänotyp. Im Gegensatz dazu K14-SCF Tiere mit defekt Mc1r Signal Fähigkeit zeigen eine rot / blonde Pigmentierung, sehr wenig Eumelanin in der Haut undein UV-sensitiven Phänotyp. Argumentation, dass Eumelanin Ablagerungen durch topische Mittel, die Mc1r Signalisierung imitieren verbessert werden, fanden wir, dass die direkte Anwendung von Forskolin Extrakt auf die Haut Mc1r mangel hellhäutigen Mäusen führte robust Eumelanin Induktions-und UV-Schutz ein. Hier beschreiben wir die Verfahren zur Herstellung und Anwendung eines Forskolin haltige Naturwurzelextrakt zur K14-SCF hellhäutigen Mäusen und berichten über eine Methode zur Messung der UV-Empfindlichkeit durch die Bestimmung minimale erythematöse Dosis (MED). Mit diesem Tiermodell ist es möglich zu untersuchen, wie cAMP epidermalen Induktion und Melanisierung der Haut beeinflussen physiologische Reaktionen auf UV-Exposition.
Introduction
Die Inzidenz von Melanomen, die tödlichste Form von Hautkrebs, hat sich in den letzten Jahrzehnten in den Vereinigten Staaten vor allem bei hellhäutigen Personen gestiegen. Starke molekularen und epidemiologischen Beweise bringen UV-Strahlung als Hauptursache Umweltfaktor 2-5. Erhöhte UV-Strahlung in Form von Sonneneinstrahlung und Solarium Benutzung geeignet ist, für viel der Anstieg der Melanom-Inzidenz 6-7 verantwortlich zu sein. Melanom-Risiko scheint besonders mit Sonnenbrand 8, vor allem in frühen Lebens 9-10 verknüpft. Sonnenbrandgefahr verbunden ist, nicht nur Dosis und Intensität der UV-Belichtung, sondern auch durch Faktoren, die vererbte kutanen Reaktion auf UV-Strahlung beeinflussen. Pigmentierung der Haut ist eine der wichtigsten Determinanten der UV-Empfindlichkeit, Sonnenbrandrisiko und Krebsrisiko. Melanom im Vergleich zu dunkelhäutigen individua tritt etwa zwanzig mal häufiger bei hellhäutigen Personenls 11-13.
Melanin, ein Pigment von Melanozyten in der Epidermis produziert wird, ist die wichtigste Determinante der Teint. Melanin wird in zwei Hauptarten: (1) Eumelanin, eine dunkelbraune / schwarze Pigment wirksam beim Absorbieren der Energie der UV-Strahlung, und (2) pheomelanin, eine rötlich / blonde Pigment weniger effektiv bei der Verhinderung des Eindringens der UV-Photonen in die Haut. Hautfarbe, UV-Empfindlichkeit und Melanom-Risiko weitgehend von epidermalen Eumelanin Inhalt 14-15 bestimmt. Je mehr Eumelanin in der Epidermis können die weniger UV-Photonen in die Haut eindringen. Wegen der niedrigen Niveaus der angeborenen Eumelanin sind hellhäutige Menschen viel anfälliger für akute und chronische Wirkungen von UV-Strahlung 16-18.
Die Pigmentierung der Haut, Melanom Risiko und die Fähigkeit, "tan" nach UV-Belastung korrelierten mit der Signalisierung Fähigkeit des Melanocortin-1-Rezeptor (Mc1r), einen G S-gekoppelte sieben Trans surface Rezeptor auf Melanozyten 19-22. Wenn Mc1r bindet seinem verwandten hochaffinen Liganden α-Melanozyten-stimulierendes Hormon (α-MSH), gibt es die Aktivierung von Adenylatzyklase und die Produktion des second messenger cAMP-23. Die normale physiologische Reaktion der Haut nach UV-Exposition umfasst epidermalen Herstellung von α-MSH durch Keratinozyten 24-29. Wir und andere vermuten, dass Keratinozyten stamm α-MSH bindet an Mc1r auf epidermalen Melanozyten, die Einleitung nachgelagerten Produktion des second messenger cAMP durch Aktivierung von Adenylatzyklase 30. cAMP-Spiegel kontrollieren viele Bereiche des Melanozyten-Differenzierung, einschließlich Überlebenswege, DNA-Reparatur und Pigmentsynthese. Mc1r Signal-und cAMP-Pigment Eumelanin Enzymwerte und Produktion deutlich zu induzieren. Wenn Mc1r Signalisierung ist intakt und melanozytären cAMP-Spiegel robust sind, wird Eumelanin produziert und die Haut dunkler. Wenn jedoch Mc1r Signalisierungs defekt ist undcytoplasmatische cAMP-Spiegel niedrig bleiben, wird pheomelanin statt 1 hergestellt. Eumelanin-Synthese kann pharmakologisch durch Mittel, die cAMP-Spiegel erhöhen 1,14,31-35 stimuliert werden.
Da die Mc1r Protein ist ein wichtiger Regulator der Melanom-Risiko bei Menschen von 36 bis 46, wir sind interessiert an Mechanismen, durch die Melanozyten Mc1r schützt vor UV-induzierten Krebsentstehung. Als Grundlage für unsere Studien erzielten wir eine transgene Mc1r-Variante Mausmodell auf einem reinen C57BL / 6 genetischen Hintergrund ein. In diesem Modell, Stammzellfaktor (SCF) wird konstitutiv in der basalen Epidermis und epidermale interfollikuläre Melanozyten in der Haut im Laufe des Lebens 47 gehalten wird, im Gegensatz zu den nicht-transgenen Mäusen, in denen Melanozyten zu lokalisieren, um die Dermis in den Haarfollikeln. Mit dem K14-SCF-Transgen integriert, wird die Epidermis mit der besonderen Eigenschaft der Melaninpigmente Pigments pigmentiertBelastung des Tieres ein. K14-SCF-Mäuse auf dem C57BL / 6 genetischen Hintergrund mit Wildtyp-Signal Mc1r haben tiefschwarze Haut, die durch sehr hohe Pigment Eumelanin charakterisiert. Nicht überraschend sind diese Tiere sehr UV-beständig. Im Gegensatz dazu genetisch angepasst K14-SCF C57BL / 6 Tiere, die eine mutierte inaktive Mc1r Hafen fast keine Eumelanin in der Epidermis. Stattdessen diese "Erweiterung" Tieren (Mc1r e / e) haben eine helle Haut Teint durch Ablagerung von Pigment Phäomelanin (Abbildung 1A) verursacht und sind viel mehr UV-empfindliche 48-49.
Pharmakologische Verbindungen mit chemischen Eigenschaften, die das Eindringen in die Haut ermöglichen, haben nachweislich eine starke induzieren Eumelanin in der Verlängerung (Mc1r e / e) K14-SCF-Tiermodell durch direkte Manipulation cAMP-Spiegel in epidermalen Melanozyten in der Haut. Melanin Hochregulation in diesem Modell ist rvon Adenylylzyklase Aktivierung 1 sowie Phosphodiesterase-4-Hemmung 35 eported. In diesem Artikel zeigen wir die Vorbereitung und die topische Anwendung von Forskolin in Verlängerung (Mc1r e / e) K14-SCF Tiere, welches Modell die hellhäutigen UV-empfindliche Menschen. Wir zeigen, dass zweimal tägliche Anwendung des Medikaments fördert beschleunigte Melanisierung aufgrund epidermale Ablagerung von Melanin, dass die Haut dunkler ist, und dass induzierte epidermale Melanin schützt vor UV-bedingten Sonnenbrand durch Messung der "minimal gerötete Dosis" (MED) 48.
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Protocol
1. Herstellung von Forskolin für die topische Verabreichung von einem Rohöl-Wurzel-Extrakt der Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) Pflanzen
- Protokolle für Maus-Experimente folgten die Leitlinien für ethisches Verhalten in der Pflege und Verwendung von Tieren und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Universität von Kentucky (Protokoll # 00768M2004) zugelassen. Der Wurzelextrakt wird bei 40% Gewicht / Volumen in einem Standard dermatologische Grund 70% Ethanol, 30% Propylenglykol.
- Wiegen Sie 200 g rohe Forskolin-Wurzel-Extrakt und übertragen sie in ein Becherglas. Zu 500 ml einer 40% (w / v) Lösung zu resuspendieren 200 g rohes Forskolin Wurzelextrakt durch Zugabe meisten, aber nicht das gesamte Volumen des Fahrzeugs (70% Ethanol, 30% Propylenglykol) und bringen die Lösung etwa 450 ml.
- Rühre eine Stunde bei Raumtemperatur. Die Lösung wird etwas viskos sein und manuellen Rühren auf "Lift" der Extrakt in Lösung vor erforderlichder Rührstab in der Lage ist, zu übernehmen.
- Nach einer Stunde Rühren wurde die Mischung in einen Meßzylinder und bringe das Volumen auf 500 ml mit Fahrzeug, das verwendet wurde, um "ausspülen" Becherglas, das verwendet wurde, um die Aufschlämmung zu rühren (zu Rückgewinnung von Forskolin aus dem Becherglas zu maximieren) .
- Übertragen der Aufschlämmung auf 50 ml Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen. Zentrifuge (1.500 g, Raumtemperatur, 15 min) mit einer Tischzentrifuge. An diesem Punkt wird das unlösliche Material ziemlich verdichtet werden, so dass der Überstand leicht abgegossen werden.
- Die Lösung wird durch ein 0,22 um-Celluloseacetat-Membran, um restliches unlösliches Material aus dem Extrakt zu entfernen. Wir verwenden eine Flaschenaufsatz-System für die Zellkultur entwickelt, zusammen mit der Verwendung von Pre-Filter, die mit dem Gerät kommen, um ein vorzeitiges Verstopfen der Membran von unlöslichen Bestandteilen des Wurzelextrakt zu verhindern. Bei der Herstellung großer Mengen des Extraktes, das Filter etwa 100 ml in einer Zeit, die Änderung der Vorfilter Wetteschen jedes zusätzliche Volumen.
- Wenn sie bei Raumtemperatur gelagert, der Extrakt hält biologische Aktivität für bis zu einem Jahr.
2. Vorbereitung der C57Bl / 6 K14-SCF-Mäuse für topische Behandlungen
- Entfernen dorsale Fell von den Tieren durch elektrische Scheren. Kurz gesagt, die Tiere zu betäuben mit inhalativen Isofluran Scher von Rückenfell mit Elektroschere mit einer 0,25 mm chirurgischen Vorbereitungs Kopf (Fisher Scientific) ausgestattet erleichtern. Vorzugsweise jeweils nur eine Art der Anästhesie (zB Ketamin / Xylazin) um das Risiko von Narkosedosis zu minimieren. Die gesättigte Inhalationskammer Berufsrisiko trägt, wenn sie außerhalb einer Abzugshaube verwendet und liefert unbekannten Mengen von Narkose zu Tieren. Idealerweise ein Präzisions Verdampfer verwendet werden.
- Um Resthaarstoppeln zu entfernen, die Pflege der Tiere mit einem chemischen Enthaarungscremes. Anästhesie verabreichen, um das Tier mit einer ip Injektion von Ketamin 40 mg / kg Xylazin und 4 mg / kg Sobald die Tiere angemessen (wie von Zehe Prise beurteilt) anästhesiert, gelten eine Fingerspitze große Menge Enthaarungscreme zu scherRückenHaut mit einem behandschuhten Finger. Reiben Sie die Creme in die Haut für 30-60 Sekunden oder bis Haare deutlich in der Creme zu sehen, wie es wird, bewegt werden. Lassen Sie die Creme auf die nur für die Mindestzeit für die Haarentfernung erforderlich, da bei längerer Exposition führt zu chemischen Verbrennungen der Haut, der Epidermis Zusammenbruch und Tod aus dem Verlust der epidermalen Integrität.
- Wischen Sie die Rückenhaut mit Wasser getränkten Gaze-Pads wiederholt, bis alle Creme entfernt wurde. Trocken Tiere mit weichen Papierhandtücher, und es ihnen ermöglichen, in einem warmen abgeschiedenen Lage (z. B. saubere Käfige auf einem Erwärmung Pad platziert) zu erholen. Enthaaren die Tiere ein-by-one und während des gesamten Verfahrens sorgfältig überwachen.
3. Die topische Verabreichung von Forskolin oder Vehicle Control
- Die Tiere sollten behandelt ein zu einer Zeit werden. Kurz mit einatmen betäubend Isofluran indem Sie die Maus auf einer form-Nylon luftdurchlässige Filter, unter denen wurde eine Isofluran-gesättigten Papiertuch in einem gesättigten Isofluran-Deckel klare Glas in einem Abzug gebracht. Setzen Sie die Maus, um Isofluran für eine ausreichende Zeit, um freiwillige Muskelbewegungen zu unterdrücken, sondern um Spontanatmung (in der Regel 10 bis 20 sec) zu bewahren. Verlassen Sie das Tier in Isofluran zu lang wird in der Atemunterdrückung und zum Tod führen. Es ist besser, auf der Seite des "going Licht" und mit neu setzen die Maus kurz auf mehr Isofluran und nicht an überbelichtet, das Tier auf die Droge und Risiko Tod irren.
- Entfernen Sie das Tier aus der Isofluran-Kammer und legen auf eine saubere, saugfähige Unterlage Bank.
- Mit einer 1000 ul Mikropipette mit einem Einweg-Polypropylen-Spitze ausgestattet, erarbeiten 400 ul von 40% Rohprotein Forskolinextrakt (Fahrzeugkontrolltiere werden mit 70% Ethanol, 30% Propylenglykol allein zu empfangen).
- Übertragen Sie das Extrakt auf dieRücken des Tieres durch Eintropfen es auf die Haut und dann unter Verwendung der Seite der Pipettenspitze, Abstrich der Extrakt über die Rückenhaut bis die gesamte Haut bedeckt. Es besteht keine Notwendigkeit, um die Haut nach der Anwendung auslöschen.
- Bringen Sie die Maus, um seinem Käfig, und genau zu beobachten, bis er aus der Narkose erholt.
- Damit nicht-Pigment cAMP Effekte sollten nicht verwechseln UV-Empfindlichkeit Experimente, brechen alle topische Behandlungen 2 Tage vor der UV-Exposition (Pigment Wirkung hält über mehrere Tage letzten topischen Behandlung).
4. Hautfarbe Messung durch reflektierende Farbmetrik
- Kurz betäuben die Maus mit inhalativen Isofluran (siehe oben).
- Kalibrieren Sie einen Minolta-Kolorimeter, indem Sie den beweglichen Kopf auf dem standardisierten weiße Fläche mit dem Farbmessgerät zur Verfügung gestellt.
- Setzen Sie den tragbaren Messkopf des Colorimeter bündig mit der Rückenhaut des Tieres sicherzustellen, dass die 1 cm 2 runde AperturE ist vollständig auf die Haut gedrückt. Nehmen Sie sich mindestens drei separate Messungen in verschiedenen Bereichen der Rückenhaut.
- Berechnung der mittleren L *-Score ± SD pro Tier und pro Behandlungsgruppe. Reflexionsfarbmessung kann an jeder Stelle in dem Experiment durchgeführt werden.
5. Bestimmung der UV-Empfindlichkeit durch Berechnung der "Minimal Erythematöse Dose" (MED)
- Verwenden Sie Tiere, die entweder mit Fahrzeug oder Forskolin, wie oben beschrieben vorbehandelt wurden. Betäuben Tiere intraperitoneale Injektion einer Standardmischung von Ketamin und Xylazin (siehe oben).
- Bereiten Sie ein Stück UV-Verschlussband für MED-Tests. Um Löcher in der Band zu erzeugen, verwenden Sie einen schweren Locher mit einem 1 cm 2 kreisförmigen Ausschnitt (2A und B). Löcher mit definierter Größe und symmetrische Anordnung in dem Band erleichtert das Erkennen von Veränderungen der Haut nach Bestrahlung. In jedes Loch in der Band, eine kleine, aber leicht lösbare Stück der Band, die zu definierten Zeitpunkten während der UV-Belichtung entfernt kann die Verwaltung von verschiedenen UV-Dosen zu ermöglichen.
- Sobald die Tiere ausreichend sediert, legen Sie das Band auf der Rückenfläche. Augen Schmiermittel sollte immer unter Vollnarkose eingesetzt werden.
- Schalten Sie die UV-Quelle, die aus zwei Westinghouse F15T8UV-B-Lampen mit einer Spitzenleistung von 313 nm und einem Bereich von 280-370 nm liegt. Lassen Sie die Lampe auf eine konstante UV-Leistung ins Gleichgewicht wie von einem UV-Photometer mit einem UVB Sensor gemessen (dauert in der Regel ein paar Minuten für die Lampen, um sich aufzuwärmen).
- Auf der Grundlage der UV-Durchlässigkeitsrate, wie durch die UV-Photometer gemessen wird, zu berechnen UV-Belichtungszeit für jede gewünschte Dosis. Zum Beispiel, UVB-Ausstoß Maßnahmen unserer Lampe 2,4 mW / cm 2. Daher zu verabreichen 5 kJ / m 2 wäre die Haut benötigen, um 208 sec der UVB-Strahlung (die 3 min und 28 s ist), wie nachstehend berechnet ausgesetzt werden:
upload/50670/50670eq1.jpg "/> - Zeigen sediert Tiere (jeweils mit Verschlussband in place) Bauchfläche nach unten, auch UV-Bestrahlung zu gewährleisten. Um die gewählten Dosierungen von UV-Strahlung zu verabreichen, nacheinander entfernen Sie die kleine Verschlussbänder für die Löcher auf 1 cm an die richtigen Dosen von Strahlung aus zwei Bereichen der Haut. Daher kann unter Verwendung des obigen Beispiels, wenn 40 kJ / m 2 ist die größte Dosis in dem Experiment, dann das Tier unter der Lampe für 27 Min. und 47 Sek. insgesamt und der Haut in der 40 kJ / m 2 Zustand sein würde kein darüberliegenden Band die ganze Zeit. Jedoch würde Band über der 5 kJ / m 2 Zustand entfernt werden, wenn es in der Belichtungs restlichen 208 sek. Zeitpunkt der Bandentfernung sollte getan werden, so dass jeder Zustand Enden gleichzeitig.
- Nach der UV-Exposition, ziehen Sie das Klebeband von der Rückenhaut vorsichtig, wobei nicht auf die Haut mit plötzlichen oder übermäßig kraftvolle Bewegungen rippen. Zeigen Tiere in einen warmen ruhigen Ort zu ermöglichenErholung von der Narkose.
- Überwachung der Mäuse 24-48 h bis zur diskreten Bereichen Erythem (Rötung), Ödem oder schauen (Quellung) entsprechend den anatomischen Stellen auf die spezifische Dosis der UV-Bestrahlung ausgesetzt. Dokumentieren Hautbefunde fotografisch.
- MED-Wert entspricht der minimalen Dosis von UV zu Entzündungen führt, wie durch Erytheme und / oder Ödeme der gesamten freiliegenden Kreis der Haut definiert. Beachten Sie, dass die Pigmentierung der Haut kann die Bestimmung der MED fordern jedoch, Erythem und Ödem kann immer noch in der Regel genau beurteilt, zum Teil dank der definierten Form der Öffnungen in der Band während der UV-Bestrahlung werden.
6. Statistische Analyse
Analysieren von Daten zwischen Kohorten von Mäusen durch eine ANOVA mit Bonferroni Post-Test (Graph Pad PRISM). P-Werte <0,05 werden als statistisch signifikant.
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Representative Results
C57BL / 6 Mäuse wurden am eumelanotic, pheomelanotic oder amelanotischen Hinter Einbeziehung der K14-SCF Transgen, wie beschrieben (Fig. 1A) erzeugt. Kohorten von hellhäutigen Erweiterung (Mc1r e / e, Tyr + / +) wurden die Mäuse mit topisch zweimal täglich entweder Fahrzeug (70% Ethanol, 30% Propylenglykol) oder 40% Rohprotein Coleus forskohlii Wurzelextrakt (80 uM pro behandelt Dosis) für 5 Tage (Abb. 2B). Wirkungen der topischen Behandlungen auf epidermalen Pigmentierung wurden sowohl durch visuelle Kolorimetrie und reflektierenden (1B) bestimmt. Die Anwendung des Wurzel-Extrakt wurde mit robusten epidermalen Verdunkelung in der K14-SCF-transgenen Hintergrund, aber nicht in genetisch angepassten nicht-transgenen Tieren verbunden. Wir deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass interfollikuläre epidermalen Melanozyten muss, um vorhanden sein pharmakologisch induzierte Melanin in der epidemiolo hinterlegtRMIS. Obwohl die Wurzel-Extrakt ist tief wegen der Anwesenheit von Pflanzen sekundäre Pflanzenstoffe neben Forskolin gefärbt, Dunkelfärbung der Haut kann nicht allein aufgrund einer Färben Wirkung von der Droge zu sein, als nicht-transgene Tiere nicht zu Haut Verdunkelung mit dem Wurzelextrakt (Abbildung 1B) aufweisen. Wenn sie in einer Weise zweimal täglich angewendet wird, kann melanizing Wirkungen von topisch aufgebrachten Forskolin in weniger als 2 Tagen aufgezeichnet werden, wobei die maximale Verdunkelung Nach mehreren Tagen (Abbildung 1C) realisiert. Grad Melanisierung ist dosisabhängig, wie von Fontana-Masson Melanin-Färbung von Rücken mit unterschiedlichen Konzentrationen des Medikaments (1D) behandelten Hautschnitte gezeigt.
Als nächstes wurde die Wirkung von topisch aufgebrachten UV-Empfindlichkeit auf Forskolin von MED-Tests in Mäusen Verlängerung (Mc1r e / e, Tyr + / +) bestimmt, wie oben beschrieben (Fig. 2 A und B) dargestellt. MED-Bestimmung wurde zwischen ani Vergleichmals mit einem beschleunigten medikamentöse Behandlung (zweimal täglich Verwaltung für 5 Tage, insgesamt 10 Dosen) im Vergleich zu einem Standardansatz (einmal tägliche Verabreichung für 15 Tage, 15 Gesamtdosen) behandelt. Nicht-transgene Mäuse wurden aufgenommen, um nicht-Melanin Arzneimittelwirkungen zu steuern. Beide Behandlungen führten in ähnlichen Mengen von Haut Verdunkelung in Forskolin behandelt K14-SCF Tiere. Insbesondere (weiß-schwarze Skala reflektierende Farbmetrik)-Werte für L * Forskolin-exponierten Tieren waren 31,9 ± 1,8 und 31,1 ± 1,6 für beschleunigte Anwendung vs Standard-Anwendung auf. Es gab keine offensichtlichen toxischen Wirkungen von Forskolin Exposition in beiden Behandlungsgruppen, so schlossen wir, dass beschleunigte Forskolin Verwaltung (zwei Mal am Tag für 10 Gesamtdosen, 80 uM pro Dosis) gefördert sicher Melanisierung der Rückenhaut so effektiv wie die bisher verwendeten (einmal täglich für insgesamt 15 Dosen, 80 uM pro Dosis).
Forskolin-induzierte epidermale Melanisierung führtetiefen UV-Schutz nach MED (2C-D) beurteilt. Während also meine MED für K14-SCF-Erweiterung für Mäuse zweimal behandelt für 5 Tage mit Fahrzeug betrug 5,0 ± 0,0 kJ / m 2, Durchschnitts MED für Kohorten mit topischen Forskolin behandelt wurden, war> 30,0 ± 0,0 kJ / m 2 (Abbildungen 2 A und C). In der Tat, eine Dosis von 30,0 kJ / m 2 wurde in diesem Experiment nicht ausreicht, um Erytheme zu erzeugen. Mit Standard-Forskolin Dosierung (einmal täglich für 15 Gesamtdosen, 80 uM pro Dosis), fanden wir, dass die durchschnittlichen MED für K14-SCF-Erweiterung Mäuse mit Forskolin behandelt betrug 50,0 ± 7,1 kJ / m 2 (Abbildung 2 B, D). Wichtig ist, dass Forskolin Vorbehandlung der Tiere nicht beeinflussen unfähig melanization Med, entweder wegen fehlender K14-SCF-vermittelten epidermalen Melanozyten (2C, D), oder weil der Tyrosinase-Mangel (Fig. 2E). Seit Forskolin Anwendungen waren disFortsetzung 2 Tage vor der UV-Exposition und wurden nach UV-Exposition nicht fortgesetzt, schließen wir, dass nicht-Pigment cAMP Auswirkungen hat eine Rolle in der MED-Ergebnisse nicht zu spielen. Vielmehr legen die Daten nahe, dass epidermale Melanisierung war der Mechanismus, durch den Forskolin induzierten UV-Schutz in diesem Modell.
Fig. 1 ist. Die topische Behandlung von Forskolin fördert Dunkelfärbung der Haut bei hellhäutigen Erweiterung (Mc1r e / e) Mäusen. (A) Fotografien von C57BL / 6 Tiere in dieser Studie verwendet. Tiere sind genetisch außer an der Melanocortin-1-Rezeptor (Mc1r) und Tyrosinase (Tyr) Loci abgestimmt. Beachten Sie, dass die Pigmentierung ist eumelanotic (schwarz), wenn Mc1r ist funktional, aber pheomelanotic (blondish), wenn Mc1r defekt ist, wie es der Fall mit derErweiterung (Mc1r e / e)-Mutante. Epidermal Pigmentierung hängt von Eigentums interfollikuläre epidermalen Melanozyten in der Haut durch die K14-SCF-Transgen und kann leicht in den Ohren zu sehen. (B) Fotos der Verlängerung (Mc1r e / e) K14-SCF-oder nicht-transgene Tiere mit behandelt 400 ul der Vehikelkontrolle (70% Ethanol, 30% Propyl Glykol) oder 40% w / v (80 uM) Forskolin zweimal täglich angewendet auf die rasierte Rückenhaut für 5 Tage, insgesamt 10 Anwendungen. Hautfarbmessungen von reflektierenden Farbmessung wurden für jede Gruppe durchgeführt. Reflexionsfarbmessung Ergebnisse sind als Mittelwert (± SD) Reflektometrie Einheiten auf der L * (schwarz-weiß) Farbe Achse angegeben. Beachten Sie, dass die topische Verabreichung von Forskolin robuste Haut verursacht Verdunkelung in K14-SCF-transgenen Tieren, nicht aber in nicht-transgenen Mäusen. (C) Zeitverlauf Experiment, Verdunkelung der Forskolin-behandelten Ohr des K14-SCFVerlängerungs Mäusen für die angegebenen Zeiten (Forskolin-behandelten Ohren sind durch blaue Dreiecke angezeigt). Fahrzeug wurde für den Vergleich mit dem rechten Ohr aufgetragen. (D) Fontana-Masson gefärbten Hautschnitten von Tieren, die mit den angegebenen Dosen von Forskolin behandelt wie beschrieben gemacht. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
2. Forskolin-induzierte Melanisierung schützt vor UV-vermittelten Entzündung durch minimale erythematöse Dosis (MED) Tests bestimmt. (A, B) Position der UV-okklusiven Klebeband und UVB-Dosen von Tieren zweimal täglich für 5 Tage (A, C) oder einmal täglich für 15 Tage (B, D, E) mit entweder Vehikel oder Forskolin behandelt. Th E letzten topischen Behandlung angewendet wurde 48 Stunden vor der Bestrahlung. Rückenhaut wurde unter Verwendung von UV-Verschließ-Band mit ausgestanzten 1 cm 2 kreisförmige Öffnungen und unterschiedlichen Belichtungszeiten, um die entsprechende Dosis zu ergeben, um verschiedene Dosen von UVB ausgesetzt. Nach der Bestrahlung wurden die Kreise der exponierten Haut mit einem Stift in einigen Experimenten gekennzeichnet. MED, von Erythem und / oder Ödem der ganze Kreis der exponierten Haut bis zu einer bestimmten Dosis definiert wurden 48 Stunden nach der Exposition bestimmt. Die MED ± SD Ergebnisse werden als kJ / m 2 UVB berichtet, * p ≤ 0,001. (E) Hautfarbe Reflektometrie und MED-Werte für Tyrosin-defizienten K14-SCF-Albino-Mäusen Verlängerung für 10 Tage mit Fahrzeug oder Forskolin behandelt. Klicken Sie hier, um Bild vergrößern Bild .
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3. Gesamtschema des Experiments. Kohorten Verlängerung (Mc1r e / e) K14-SCF oder nicht-transgene Tiere wurden durch Entfernen des Rückenfell mit elektrischen Scheren und / oder chemischen Enthaarung hergestellt. Die Tiere wurden dann mit topischen Anwendungen entweder Fahrzeug (70% Ethanol, 30% Propylenglykol) oder mit 40% Rohprotein Forskolinextrakt durch die angegebenen Dosierungsschemata behandelt. Auswirkungen auf die Pigmentierung der Haut wurden fotografisch dokumentiert, kolorimetrisch und von Fontana-Masson Melanin Färbung. UV-Empfindlichkeit wurde durch minimale erythematöse Dosis (MED) Tests bestimmt.
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Discussion
Mit einem Tiermodell der hellhäutige Mensch, finden wir, dass die topische Anwendung einer Forskolin reichen rohen Wurzelextrakt robust dunkelt die Haut durch die Stimulierung der Melaninproduktion in der Haut. Epidermalen Melanin hängt von der Expression von Stammzellfaktor in der basalen Epidermis, wie es in der menschlichen Haut auftritt, aber nicht in genetisch nicht modifizierten Mäusehaut. Die Rückenhaut von Mäusen genetisch nicht modifizierten fehlt eine ausreichende Zahl von interfollikulären Melanozyten Pigment auf der Haut zu vermitteln. Nur in der Einstellung der konstitutiven Expression eines Melanozyten-Wachstumsfaktor wie Stammzellenfaktor (kit-Ligand) oder Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF) kann Melanozyten in der Basalschicht der Epidermis während der gesamten Lebensdauer des Tieres 50-51 gehalten werden. Unser Tiermodell der hellhäutige Menschen auf Einbeziehung des K14-SCF-Transgens in der Verlängerung Pigment Variante der C57BL / 6 Maus-Linie basiert. Obwohl Tiere jeden Alters können seinverwendet wird, unsere Experimente beinhalten typischerweise jungen Erwachsenen (4-12 Wochen alt) Mäusen. Wegen eines Kegel Melanocortin-1-Rezeptor (Mc1r), die zum Verlust der cAMP-Signal führt, Verlängerungs Mäuse exprimieren pheomelanin bevorzugt in der Haut und Fell (in den K14-SCF oder HGF-Met transgenen Staaten) als Eumelanin 52-54. Als Folge der veränderten Expression Melanin, sind K14-SCF-Erweiterung Mäuse viel mehr UV-empfindlicher als ihre Mc1r-Wildtyp-Gegenstücke, die tiefschwarze Haut durch reichliche Ablagerung von Pigment Eumelanin epidermalen 1 haben. Wir vermuteten, dass seit Eumelanin Produktion ist stark in der Einstellung eines mutierten Mc1r vermindert, dass pharmakologische Stimulanzien, die Mc1r Signalisierung nachahmen könnte Eumelanin Produktion zu retten. Mc1r ist ein G s-Transmembran-Rezeptor gekoppelt, dass bei der Bindung der High-Affinitätsliganden α-Melanozyten-stimulierendes Hormon (α-MSH), überträgt pro-Differenzierung Signale an die melanocyte Zytoplasma über Adenylatcyclase-Aktivierung und die Produktion des second messenger cAMP. So stellten wir die Hypothese, dass die topische Anwendung von Forskolin, eine Zelle durchlässig Diterpenoid, die ein potenter direkter Aktivator der Adenylatzyklase ist, könnten zu Eumelanin-Produktion in der Mc1r-defekt, pheomelanotic Staat zu fördern.
Verwendung von gereinigtem Forskolin für diese Untersuchungen erwiesen sich jedoch als kostspielig. Frühe Experimente Bestimmung der minimalen Menge von Forskolin für den epidermalen Verdunkelung in der K14-SCF-Erweiterung erforderlich Modell vorgeschlagen, dass die maximale Verfinsterung trat bei der Verwendung eines 40% Gewicht pro Volumen Lösung mit Rohextrakt, die 20% enthalten (Gewicht pro Gewicht) von Forskolin. Wir berechnen, dass die Anwendung von 400 ul einer 8% Finale Forskolin (Gewicht pro Volumen, 40% x 20%) Lösung wäre in der Lieferung von etwa 80 uM Forskolin auf die Rückenhaut jede Anwendung führen. Natürlich viel von der abgegebenen Dosiswird nicht durch die Haut absorbiert wird, statt dessen durch umgebende Fell oder Abfallen des Tieres zum Zeitpunkt der Anwendung eingeweicht. Somit ist es schwierig, die genaue Dosis, die realisiert erhalten die Tiere bei jeder Anwendung des Arzneimittels zu melden. Dennoch, wenn in dieser Weise angewandt, Forskolin führt zu robusten Induktion von Enzymen Pigment in der Haut und die Produktion von Eumelanin. In der Tat zeigte K14-SCF-transgenen Tieren Erweiterung klar Verdunkelung der Haut nach der zweiten Anwendung (Abbildung 1C).
Obwohl wir bisher veröffentlichten Haut Verdunkelung mit täglichen Anwendung des Medikaments 1,48-49, hier zeigen wir, dass zweimal täglich Anwendung mit robusten epidermalen Verdunkelung und signifikante UV-Schutz assoziiert, was darauf hindeutet, dass pharmakologische bedingte Melanisierung kann durch Gabe von die optimiert werden Drogen häufiger als einmal pro Tag. Dunkelfärbung der Haut, die in der Epidermis durch Eumelanin Induktion ist, dauert solange als topische Behandlungen sind Forskolin fortgesetzt. Auch chronische Anwendung (über 3 Monate) schien durch die Mäuse 49 gut vertragen. Der Anstieg der Dunkelfärbung der Haut ist auf die Melaninsynthese statt Proliferation von Melanozyten in der Epidermis. 49. Sobald topische Behandlungen abgebrochen werden, nach und nach verblasst die Haut wieder in ihren Ausgangs hellen Teint (über 2-3 Wochen) als epidermale Melanin mit normaler Keratinozyten Verlängerung verloren. Verdunkelung der Haut kann durch einfache Sichtkontrolle der Mäuse festgestellt werden, aber die Hautfarbe objektiv mit reflektierenden Farbmetrik 55-56 quantifiziert werden. Diese Methode ist eine nicht-invasive schnelle und schmerzlose Methode zur Messung der Hautfarbe. Farbe kann mit dem L * a * b * (LAB)-Farbraum-Modell 57-58 genau beschrieben.
Für diese Versuche haben wir uns auf einem rohen Wurzelextrakt der Pflanze Coleus forskolii, der natürlichen Quelle der Forskolin. Diese Vorbereitungwurde wegen der hohen Kosten der Durchführung dieser Experimente mit gereinigten Forskolin verwendet. Dieses Experiment zum Beispiel benötigt etwa 2 g Forskolin Gesamt für zweimal tägliche Anwendung zu sechs Tiere für fünf Tage. 2 g der im Handel erhältlichen HPLC-gereinigte Forskolin würde mehr als 20.000 $ kosten, im Vergleich zu weniger als 5 $ für Rohextrakt. Obwohl gereinigten Forskolin induzierte epidermale Melanin in unserem Tiermodell ein, können wir nicht ausschließen, mögliche Auswirkungen von anderen pflanzlichen Verbindungen im rohen Wurzelextrakt einschließlich Alkaloide, Phenole und Tannine. In der Tat, vor der Arbeit mit Meerschweinchen oder menschliche Haut Explantate vorgeschlagen, dass Verbindungen in der rohen Wurzel-Extrakt kann die Wirkstoffabsorption von Forskolin 59 zu fördern. Bisher ist jedoch die Identität und den Mechanismus dieser Verbindungen sind unbekannt. So können wir nicht ausschließen, Modifizieren Auswirkungen der anderen natürlich in der rohen Wurzelextrakt vorliegenden Verbindungen.
Die compoundierte Mischung wird Forskolineine dunkelbraune Flüssigkeit mit einem attraktiven Gewürzartigen Aroma, das leicht auf die Haut für die topische Anwendung angewendet wird. Da die unlöslichen Materialien entfernt wurden, lässt die tägliche Anwendung keine Verkrustungen oder Ablagerungen einmal von der Haut aufgenommen. Obwohl das rohe Wurzelextrakt ist dunkelbraun, wenn auf diese Weise hergestellt werden, ist Dunkelfärbung der Haut durch das Medikament hervorgerufen nicht nur ein Farbstoff-Effekt, wie von der Tat gezeigt, dass die topische Anwendung der Verbindung auf die Tiere nicht in der Lage Melanisierung Haut (zB Mc1r e / e Tyrosinase Albino-defizienten Tieren oder nicht-transgene Mäuse, die epidermalen Melanozyten fehlen) hatte keinen Effekt auf die Haut verdunkeln (1B und 2E). Wir betrachten diese Versuche als Proof-of-Concept-Demonstrationen, dass eine Manipulation von cAMP in der Haut kann UV-Schutz dunkle Pigmentierung der Haut zu induzieren. Es ist jedoch unwahrscheinlich, daß eine topische Verabreichung von Forskolin ist ein praktisch durchführbar oder therapeutische Option wegen der nicht-spezifischen Natur des Arzneimittels. Ichndiscriminate und nicht gezielte Aktivierung von Adenylylcyclasen und Induktion von cAMP zu erwarten inakzeptable Toxizität führen kann. Wichtig ist, daß andere, dass die topische Verabreichung eines Phosphodiesterase-4 Inhibitor (Rolipram) gezeigt, potent hochreguliert Melanin in der K14-SCF Verlängerung Tiermodell bewiesen, dass Haut cAMP-Induktion und melanization durch alternative pharmakologischen Ziel 35 erreicht werden. Klar, vor aktuelle Manipulation von cAMP-Spiegel in der Haut könnte für den menschlichen Gebrauch übersetzt werden kann, wird seine Sicherheit müssen sorgfältig geprüft werden. Dennoch deuten stark darauf hin, dass unsere Daten pharmakologisch induzierte Melanisierung ist UV-Schutz wie durch minimale erythematöse Dosis (MED) Tests bestimmt.
Zusammenfassend topische Verabreichung von Forskolin, einem Adenylatzyklase Aktivator, führte zu einer starken Melanisierung der Epidermis von einem murinen Modell der hellhäutigen menschlichen basierend auf fehlerhaften cAMP Signal untenStrom von einem defekten Melanocortin-1-Rezeptor (Mc1r). Epidermal Melanisierung war UV-Schutz, da durch minimale erythematöse Dosis (MED) Tests gemessen. Wir vermuten, dass pharmakologische Manipulation cAMP kann nicht nur Rettungs UV-Schutz eumelanization der Epidermis, aber auch andere Mc1r abhängige UV-Schutz Antworten als gut.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Malinda Spry für die technische Unterstützung danken. Wir haben auch aktuelle und frühere Finanzierungsquellen zu bestätigen: das National Cancer Institute (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), der Wendy Will Fall Cancer Research Fund, der Markey Cancer Foundation, die Kinder-Wunder-Netz und die Jennifer und David Dickens Melanoma Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Coleus Forskoli extract 20% | Buckton Scott USA Inc. | n/a | Princeton, NJ |
| Isothesia, Isoflurane , USP | Butler Schein | NCD 11695-6776-1 | Dublin, OH, USA |
| Xylazine | Anased Injection | LA04612 | Shenandoah, Iowa, USA |
| Ketamine HCl, USP | Putney | NDC 26637-411-01 | St. Joseph, MO, USA |
| Ethanol | Decon Labs. | 2705 | |
| Propylene glycol | Adesco | 05751L | Solon, OH, USA |
| Depilatory cream, Nair | Church Dwight | JF-11 4381322 | Priceton, NJ |
| EQUIPMENT | |||
| Germicidal Hg Lamp UV-B | Westinghouse | F15T8UV-B | |
| Radiometer photometer | International light | 1LT400A | Peabody, MA,USA |
| Chromameter | Konica Minolta | CR-400 | Ramsey, NJ, USA |
| Data Processor for Chromameter CR-400 | Konica Monilta | DR-400 | Ramsey, NJ, USA |
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