감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에 설명 체외에서 정량.
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이 논문에서
요약
초록
혈관 내피 세포는 염증 반응에 중요한 역할을한다. 염증의 급성 단계 동안, 내피 세포 (내피)는 호스트 매개로 직접 보존 미생물 구성 요소 또는 호스트 파생 위험 분자에 의해 활성화됩니다. 활성화 된 내피 표현 사이토 카인, 케모카인 동원과 접착 분자는, 감염이나 부상의 사이트에서 백혈구를 활성화하고 유지합니다. 호중구 도착하는 최초의 백혈구이며, 두 세포의 표면에 존재하는 접착 분자의 다양한 통해 내피을 준수합니다. 호중구의 주요 기능은 직접 미생물의 위협을 제거하는 추가 요인의 출시를 통해 다른 백혈구의 채용을 촉진하고, 상처 복구를 시작하는 것입니다. 따라서 내피 세포에 자신의 모집 및 첨부 염증 반응의 개시에 중요한 단계입니다. 이 보고서에서, 우리는 사용하는 체외 호중구 접착 분석에 대해 설명합니다calcein 정적 조건에서 미세 혈관 내피 세포의 활성화 정도를 정량하는 인간의 기본 호중구 AM-레이블. 이 방법은 형광 분광 광도계로 정량 동일한 샘플을 직접 호중구 바인딩보다 질적 평가를 위해 형광 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 추가적인 장점이 있습니다.
서론
혈관 내피 세포는 혈액 순환과 직접 접촉에 있기 때문에, 그것은 유일하게 감염이나 부상시 신속한 염증 반응을 시작할 수 있습니다. 내피 세포 (내피) 보존 세균의 구성 요소와 위험 분자의 다양성을 인식하고 표현 패턴 인식 수용체, 그리고 TNFα와 같은 호스트에 염증 매개체에 대한 수용체. 이들 수용체의 활성화는 내피는 사이토 카인 (예를 들어, IL-6, IL-8, CXCL1 및 CCL2) 분비하고, 그들의 세포 표면 1에서 부착 분자 (예를 들어, E / P-셀렉틴, VCAM-1, ICAM-1)를 상향 조절을 유도 2. 이 분자는 모든 전염성 에이전트의 호스트를 삭제하고 조직 수선에게 3,4을 시작하기 위해 감염과 부상의 사이트에 백혈구의 국산화를 촉진한다. 감염 호중구 반응은 혈관 내피 세포와 응답 사이의 잘 조율 된 상호 작용을 포함 호중구. EC의 활성화에 따라, IL-8 분비 감염이나 부상 5,6의 사이트에 집으로 호중구 수있는 내피 세포에서 혈관 그라데이션을 형성하고 있습니다. E / P-셀렉틴를 중재 호중구 캡처 및 호중구 세포 표면에 glycomolecules 상대적으로 약한 연결을 통해 압 연입니다. 이러한 상호 작용은 그 동족 수용체 IL-8 바인딩과 함께, 강....
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프로토콜
1. 도금 및 미세 혈관 내피 세포의 유지 보수
- 해동 및 제조 업체에 따라 혈관 내피 세포 성장 지침을 제공. 이 프로토콜에서는, 세포는 EGM-2 MV 미디어 (론자)에서 재배되었고, 그것은 모든 실험은 통과 번호로 인한 변형을 최소화하기 위해 해동 후 2 주 내에서 수행하는 것이 좋습니다. HMVEC 폐를 가진 우리의 실험은 9-4 구절 사이에 수행됩니다.
- 1 일 : 세포가 80 % ~ 90 % confluency에 도달하면 trypsinize 및 ML 당 120,000 세포에 resuspend을. 48도, 폴리스티렌 조직 배양 플레이트 (들)에 플레이트 잘 당 36,000 세포 (0.3 mL를). 배경 형광 판독 값을 얻기 위해 백혈구와 함께 배양되지 않습니다 HMVEC의 우물이 (가) 있습니다. 특히 형광 분석, 교대 행 또는 열을 위해 디자인 된 48 - 웰 플레이트를 사용하지 않는 이웃 우물에서 어떤 빛 오염을 최소화 할 수 있습니다. 참고 : 웰스 폴리 라이시로 사전 코팅 할 수 있습니다NE, 콜라겐이나 fibronectin의.
- 주 2 : 신선한 매체를 추가합니다.
- 3 일 : 위상차 현미경으로 세포가 (즉, "조약돌"외관과 작은 세포 파편) 건강한 확인하고, 그들은 10....
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결과
호중구 바인딩 분석을 사용하여 신뢰성, 재현성 결과를 얻기 위해서는 그림 1 HMVEC 폐에 그림과 같이 건강과 미세 혈관 내피 세포의 confluency에이 분석의 날에 최적이다하는 것이 필수적이다. 또한, 낮은 통로 번호 혈관 내피는 (이하 9 구절 즉,)를 사용하는 것이 필수적이며, 따라서, 우리는 해동 2 주 이내에 모든 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 호중구의 건강은 세포가 어떤 방식으로 구성하는 경우 calcein AM은 형광 calcein 분자에 대사되지 않습니다 특히 이후, 또한 가장 중요합니다. 우리는 판 블루 배제 방식을 사용하며, 세포의 상당 부분 (즉, 스테인드) 죽은 경우 분석을 진행하지 않습니다.
이 밀도 기울기 및 항원 기반의 열 분리 방법 등 호중구를 분리하는 방법은 여러 가지가 있으며, 모든이이 절차에 충분합니다. 우리는 축 쉴드에서 Polymorphprep 기성품 밀도 기울기 솔루션.......
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토론
성공적으로 호중구 / 미세 혈관 내피 세포 접착 분석을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 낮은 통로 번호 (<10), 건강한 내피 세포의 사용, 낮은 밀도 (즉, <5 × 10 6 세포에서 분리 된 호중구를 유지 2) / ㎖) 및 분리 2 시간 이내에 그들을 사용하여, 각각 3) 까다로운 calcein AM-라벨 호중구의 세척 및 호중구에서 calcein의 EC 오염과 손실을 최소화하기 위해 적시에 calcein AM-라벨 호중구의 사용, .
우리는 조직 문화의 cm 2 당 8 × 10 5 호중구 잘 표면적 (즉, 60 호중구 잘 당 48 - 웰 플레이트)를 추가합니다. 우리는 60 호중구의 입력은 우리 분광 광도계의 선형 범위 내에 있는지 발견하고 상대 adherences 측정시 안정적으로 데이터를 재생합니다. 단, 호중구 바인딩 매우 유사한 감소에 관찰40,.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 작품은 마취와 수술 전후 관리의 UCSF 부에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | 모든 공급업체로 대체 가능 |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (페놀 레드 제외) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | 모든 공급업체로 대체 가능 |
| D-PBS (Ca2+ 및 Mg2+ 및 페놀 레드 제외) | UCSF 세포 배양 시설 | CCFAL003 | 모든 공급업체로 대체 가능 |
| RPMI-1640 (페놀 레드 제외) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) 재고 soln |
| Trypan 블루 솔루션 | 시그마-알드리치 | T8154 | |
| 40 μ M 필터 | VWR | 21008-949 | 모든 공급 업체로 대체 가능 |
| FLUOstar OPTIMA 분광 광도계 | BMG LABTECH- |
참고문헌
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al.
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재인쇄 및 허가
