방법 논문

세포 물질의 상호 작용 연구를위한 나노 기공 골드 패턴의 미세

DOI:

10.3791/50678

⸱

2013년 7월 15일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis , 2Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of California, Davis , 3Department of Biomedical Engineering, University of California, Davis

이 논문에서

요약

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우리는 스텐실 인쇄 및 석판뿐만 아니라 미세하게 패턴에 대한 배양 세포에 방법을 통해 micropattern과 나노 다공성 금 박막에 대한 기술을보고합니다. 또한, 우리는 물질과 주사 전자 및 형광 현미경 기술을 이용하여 배양 된 세포의 형태를 특성화하는 이미지 분석 방법을 설명합니다.

초록

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수십 나노 미터의 기능 크기를 가진 나노 구조 재료는 연료 전지, 바이오 센서, 생물 의학 장치 코팅 및 약물 전달 도구를 포함한 여러 기술의 성능을 강화했다. 나노 크기의 자기 조립 공정에 의해 생산 된 나노 기공 금 (NP-오)는 큰 효과 표면적, 높은 전기 전도도와 촉매 활성을 보여 비교적 새로운 소재입니다. 이러한 속성은 NP-오에게 과학 사회 매력적인 소재를 만들었습니다. NP-오에 대한 대부분의 연구는 거시적 규모의 표본을 고용하고 물질과 촉매, 센서 응용 프로그램의 기초 과학에 초점을 맞 춥니 다. 매크로 스케일의 표본은 생물 의학 장치를 포함하여 소형 시스템에서 NP-오의 잠재력을 제한 할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 처음에 딱딱한 기판 micropattern과 NP-오 박막의 두 가지 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은, 간편하게 조절할를 밀리미터 규모의 NP-오 패턴을 만들기 위해 직접 제작 한 스텐실 마스크를 고용E는 두 번째 방법은 본 서브 밀리미터 스케일 패턴 리프트 오프 리소그래피를 사용합니다. NP-오 박막 스퍼터링 증착 공정에 의해 얻을 수있다, 그들은 마이크로에 손쉬운 통합함으로써 의무가 기존의 미세 기술과 호환됩니다. 이러한 시스템은 높은 효과적인 표면적, 전기 전도도, 및 금 - 싸이 기반 표면의 바이오 콘쥬 게이션에서 해당 혜택을 전기적 주소 바이오 센서 플랫폼 (가) 있습니다. 우리는 몇 가지 바이오 센서에 대한 중요한 성능 매개 변수 포유 동물 세포와 NP-오의 상호 작용을 정량화 세포 배양, 면역 염색, 및 이미지 처리 기술을 설명합니다. 우리는 여기에 설명 된 기술은 다양한 길이 비늘 및 바이오 센서, 에너지 저장 시스템, 촉매 등 다양한 애플리케이션의 플랫폼에서 NP-오의 통합을 지원할 것으로 기대합니다.

서론

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재료 연료 전지 등 다양한 응용 프로그램을 향상에 약속을 보여 주었다 1 센서 2,3 생물 의학 장치 4,5. 비교적 새로운 재료는 나노 크기의 자기 조립 공정에 의해 생산되는 나노 기공 금 (NP-오)입니다. NP-AU에 선구자는 가장 일반적으로 원자의 비율이 60 %에서 80 %로 은색으로 구성된 금 합금이다. 짧게 특성을 오픈 기공 나노 실버가 강한 산에 의해 용해되는 클러스터의 금 원자의 재 배열 결과입니다 ( 예를 들어, 질산 70 %) 또는 전기 전위에 따라 6-8. 큰 유효 면적 등 여러 가지 바람직한 특성, 높은 전기 전도성, 잘 확립 된 표면 기능화 기술 및 생체 적합성에서 NP-오 혜택 9. NP-오에 대한 연구의 급속한 확장, NP-오의 기계적 특성에 초점을 맞출 대부분이있다하더라도 10,11 촉매 12, 그리고 생명 감지 성능 13-15. 바람직한 특성은 여러 가지 생물로 이용하실 매우 유용하지만 16, 17이 영역에있는 응용 프로그램이 제한되었습니다. 이것에 대한 한 가지 가능한 이유는 대부분의 연구는 주로 매크로 스케일의 표본을 사용하고있다 ( 예를 들어, 시트, 포일 및 잉곳)와 소형 시스템에서 NP-오를 통합하는 기술은 부적당 남아있다. 사실 NP-오 영화를 채용 기존의 미세 기술을 사용하여 예제의 소수에 불과있다 16-20. 소형화 기술과 새로운 생물 의학 도구에 대한 필요성의 출현으로, 그것은 장치에 새로운 자료를 통합 할 수있을 중요한되고있다. 이는 일반적으로 물질이 퇴적 기존의 미세 기술을 모방 할 수 있어야합니다. 또한, 세포 물질의 상호 작용의 신속한 정량은 새로운 재료의 생체 적합성을 평가하기 위해 일반적으로 필요합니다. 본 논문의 목적은 micropattern과 NP-오 영화에 대한 기본적인 기술을 설명하고 나노 구조 및 디지털 이미지 프로세싱을 통해 세포 물질의 상호 작용을 모두 정량화하는 것입니다.

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프로토콜

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1. 나노 다공성 골드의 제조

  1. 피라 냐가 솔루션 깨끗한 기판
    1. 결정화 접시와 열 ° C 열판에 65 혼합물의 100 ML 황산 (96 %)로 25 ML의 과산화수소 (30 %)를 추가합니다. 주의 : 액체 부식성하고주의하여 취급해야합니다. 그것이 폭발의 위험이 있으므로 소비 솔루션은 밀폐 용기에 저장하지 않아야합니다.
    2. 장소 내산성 집게 10 분으로 청소를 사용하여 혼합물로 3 인치 현미경 슬라이드 1 인치. 작은 coverslips는을 배치 청소를 위해 자기 면역 염색 보트를 사용합니다. 전에 용액에 침지 ~ 30 초 10 W에서 공기 플라즈마 작은 coverslips를 처리합니다.
    3. 3 분 동안 탈 이온수 (DI) 흐르는 물에 결정화 요리 청소 샘플을 씻어. 보풀이없는 수건에 질소 총 타격 - 건조 시료.
  2. 스텐실 마스크 (미리 미터 스케일 패턴을 만들기 위해 이것을 사용 방법 1) 준비
    1. 생검 펀치 및 / 또는 함께 펀치 250 μm의 두께의 실리콘 엘라스토머 시트는 반 경질 플라스틱 표면에 메스 지역을 절개. 질소 총 이소프로판올 건조 70 %의 가공 엘라스토머 시트를 청소합니다.
    2. 보풀이없는 클린 수건에 구멍을 뚫은 시트를 배치하고 스텐실에 직면 시료 표면에 스텐실을 통해 피 세정 coverslips를 맞 춥니 다.
  3. 본 리프트 오프 레지스트 (방법 2 : 서브 밀리미터 스케일의 패턴을 만들기 위해이 옵션을 사용)
    1. 척 회전에 피 세정 현미경 슬라이드를 삽입하고 질소 총을 가진 모든 입자를 날려. 플라스틱 피펫을 사용하여 유리 슬라이드에 접착 촉진제 (헥사 메틸 디실 아젠)의 1.5 ML을 분배. 30 초 동안 5 초 1,500 rpm을 위해 500 rpm에서 연속적으로 슬라이드를 회전하여 발기인을 확산. 7 분 동안 115 ° C에서 열판에 슬라이드를 구워 5 분 동안 식히십시오.
    2. 유리 슬라이드 위에 포토 레지스트 4 ML (3 인치 B 분배Y 1 인치). 접착 촉진제와 동일한 프로토콜을 사용하여 슬라이드를 회전시켜 포토 레지스트를 확산. 1.5 분 동안 115 ° C에서 열판에 포토 레지스트를 구워 10 분 동안 식히십시오.
    3. 15 초 동안 투명 마스크를 통해 : UV 빛을 가진 포토 레지스트 코팅 된 슬라이드 (22 mW의 / cm 2 세기)를 노출합니다. 1.5 분 동안 115 ° C에서 열판에 포토 레지스트를 구워 45 분 동안 기다립니다. 최소 3.5 분 동안 개발자에 노출 된 포토 레지스트를 용해. DI의 물로 씻어. 광학 현미경 개발 패턴을 검사합니다.
  4. NP-오 얇은 필름을 생산하기 위해 보증금 전구체 금속
    1. 독립적으로 금,은, 크롬을 증착 할 수있는 스퍼터링 기계로 샘플을로드합니다. 금속 증착을 시작하기 전에 25 mTorr의 아르곤 처리 분위기 하에서 50 W에서 90 초 동안 샘플을 스퍼터 - 청소합니다.
    2. 10 mTorr의 아르곤 하에서 300 W에서 10 분 동안 크롬 스퍼터. 400 W UN에서 90 초 동안 금 스퍼터데르 10 mTorr의 아르곤. 금은을 끄기 전에 소스를 약 10 초 스퍼터 끄고 100 W. 200 W와 오 전력에서 실버 10 분 동안 금과은을 공동 스퍼터 소스를 스퍼터.
  5. 전구체의 금속 micropatterns에를 얻을
    1. 20 초 초음파의 10주기와주기 사이에 2 분 정지를위한 포토 레지스트 스트리퍼 ~ 180 ㎖에 포토 레지스트 코팅 샘플을 초음파 처리. DI 물과 샘플을 씻어 질소 총을 건조. 현미경 금속 패턴을 검사합니다.
    2. 용착 금속을 나타 내기 위해 두 개의 핀셋을 사용하여 비 포토 레지스트 코팅 샘플에서 탄성 스텐실 껍질.
  6. 열처리를 통해 Dealloy 전구체 금속 및 수정 나노
    1. 질산 (70 %) 170 ml의 200 ML 유리 비커를 입력하고 열판에 55 ° C에서 용액의 온도를 유지합니다. 주의 : 질산 매우 부식성이 적절한 보호 장비를 처리해야한다.
    2. 이전의 질산으로 침수 30 초 10 W에서 공기 플라즈마 작은 coverslips를 처리합니다. 내산성 집게를 사용하여 비커에 3 인치 현미경 슬라이드로 장소 1 인치 dealloy 그 15 분. 작은 coverslips는을 배치 마크로에 대한 자기 면역 염색 보트를 사용합니다.
    3. 연속적으로 신선한 탈 이온수로 3 회 채워진 두 개의 비커에서 그들을 담가 dealloyed 샘플을 씻어. DI 물에 샘플을 보관하고 적어도 일주일 동안 매일 신선한 DI 물과 물을 교체합니다. 사용하기 전에 보풀이없는 수건에 질소 총 타격 - 건조 시료.
    4. 급속 열처리 장비 깨끗한 실리콘 웨이퍼에 샘플을로드합니다. 200 ° C와 450 ° C와 램프 속도 사이에 온도를 조정 ~ 10 ° C / 초. 질소 대기 하에서 10 분 동안 소정의 온도로 시료를 노출합니다. 챔버 식지 (<100 ° C) 및 샘플을 제거합니다. 또한, 천천히 열 트리트 위해 열판에서 샘플을 배치천만에.

2. 세포 배양

  1. 세포 배양을위한 NP-오 샘플을 준비
    1. 장소는 NP-오 폴리스티렌 요리 샘플 및 30 초 10 W에서 공기 플라즈마 처리 24 잘 조직 배양 플레이트에 샘플을 전송합니다.
    2. 각 well에 500 ㎕의 완전한 문화 미디어 (10 % 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 Dulbecco의 수정 된 이글 매체)를 추가합니다. 37 가습 배양기에서 저장 ° C와 세포를 (<1 시간) 파종까지 5 % CO 2.
  2. 유지 관리 통로, 그리고 종자 세포
    1. 문화 미디어 세포가 70 %의 합류이다 통로 T75 플라스크에 관심 세포를 (이 경우 3T3-NIH의 섬유 아세포 또는 생쥐 성상)을 유지한다.
    2. 셀과 Passaging를 들어, 술병에서 미디어를 제거하고, 10 ㎖ 인산로 두 번 세척 식염수 (PBS)는, 세포 분리 (~ 10 분)까지 1X 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화 2 ㎖를 추가 버퍼. 3 ML 신선한 매체를 추가하고3 분 동안 1,200 rpm으로 원심 분리기. 뜨는을 대기음 2 ML 매체에서 펠렛을 일시 중지합니다.
    3. 우물과 씨앗 25,000 세포 / 1 ML의 최종 볼륨 cm 2의 밀도에 유리 coverslips를 끌어 세포에서 보냈다 용지를 제거합니다. 샘플을 통해 세포의 균일 한 코팅을 보장하기 위해 앞으로 뒤로 좌우 문화 판을 흔들어. 매일 검사하는 동안 분석 될 때까지 세포를 품어.

3. 셀 및 재료 분석

  1. 골격과 핵을 시각화하는 세포를 얼룩
    1. 우물에서 보낸 미디어를 제거하고 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다.
    2. 1 % 소 혈청 알부민 PBS에서 300 nm의 알렉사 플 루어 488 Phalloidin의의 얼룩 솔루션을 준비합니다.
    3. PBS로 두 번 세포를 씻으, 5 분 동안 500 ㎕의 0.1 % 트리톤 PBS에서 X-100에서 그들을 permeabilize.
    4. PBS로 두 번 세포를 씻으 우물을 청소하도록 전송합니다. 오점 50-20 분 샘플과 어둠에 보관 상 200 μL 염색 솔루션입니다.
    5. PBS 5 분 동안 PBS에서 DAPI 3 m로 카운터 얼룩 세포를 씻으십시오.
    6. PBS로 세포를 씻어 투명 매니큐어와 설치 미디어 및 인감 커버 유리 슬라이드에 장착하기 전에 증류수에 담근다.
  2. NP-의 Au 표면에 NP-오 샘플 및 세포 배양의 이미지를 얻기
    1. 이미지 NP-오의 이차 전자 검출기를 사용하여 10 kV의 전자 에너지에서 50,000 X 배율과 전자 현미경 (SEM)을 스캐닝 표면.
    2. 적절한 필터 큐브 10X 배율에서 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 샘​​플에 다른 장소에서 복합 세포의 이미지를 캡처합니다.
  3. 프로세스 이미지는 모공 세포 형태를 결정
    1. ImageJ에와 해당하는 경우 각각의 채널로 분할 이미​​지 열기. 8 비트 이미지를 변환, 배경 빼기 및 중간 filteri하여 그들을 부드럽게NG. 수동으로 또는 기공 (빈 공간)와 세포 기관 / 핵을 강조하기 위해 알고리즘을 thresholding을 내장하여 임계 값을 조정합니다.
    2. 병합 모공이나 세포를 분리하는 유역 명령을 사용합니다. 입자 분석 매개 변수를 설정하고 입자 입자의 평균 영역 및 백분율 범위의 번호를 추출하는 명령을 실행합니다. %의 커버리지를 정량화 세포 계수 및 Phalloidin의 스테인드 세포의 이미지를 DAPI 염색 세포의 이미지를 사용합니다.
    3. 여러 이미지를 일괄 분석을 수행하기 위해 포함 된 매크로 파일을 수정합니다.

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결과

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그림 1은 배양 세포를 NP-오 패턴을 만드는 나노 구조를 정량화하고, 세포의 형태학의 특성을 포함하여 주요 절차 단계를 설명합니다. 그림 2a에서와 같이 탄성 스텐실 (TOP) 아래 이미지에서와 같이 NP-오 패턴을 만드는 데 사용됩니다. 그림 2B는 일괄 처리 시편 도자기 보트의 사진입니다. 그림 2C는 용착 금속 패턴의 색 변화를 표시 이전과 마크로 후. 은빛 마무리 (마크로 이전)는 실버가 풍부한 합금 내용 때문이다. 마크로에, 영화는 눈에 띄게 오렌지 - 갈색 색조를 얻습니다. 그림 2D는 금속의 포토 리소그래피 패터닝에 의해 생성 된 미세한 기능을 보여줍니다. 다른 기공 형태소 그림 3에서와 같이 NP-오 영화 9의 열 처리에 의해 얻을 수 있습니다. 단면 이미지 (그림URE 3) 필름은...

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토론

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우리는 마이크로 시스템즈 생물학 연구에서이 영화의 사용을 확장하는 micropattern과 NP-오 필름에 두 가지 방법을 보여줍니다. 스퍼터 코팅 금은 스퍼터링은 기존의 미세 공정과 합금 조성 및 두께는 쉽게 각 스퍼터링 건 힘의 변화에​​ 의해 제어 (금과은 대상에 대한) 될 수 있습니다와 호환이기 때문에, NP-오 패턴을 생성하는 다양한 방법 각각 증착 시간입니다. 전형적인 NP-오 필름은 200 nm의에서 2 μm의 범위를 두께. 생검 펀치와 메스를 사용하여 스텐실 방법 (방법 1, 그림 2A)는 포토 리소그래피에 대한 필요성을 우회 밀리미터 규모의 패턴을 만들 수 있습니다. 더 복잡한 패턴은 프로그래밍 레이저 절단기에 의해 생성 될 수 있습니다. 준수 실리콘 엘라스토머 스텐실 유리 표면에 자기 묻은하여 마스크와 증가하는 패턴 해상도 아래 금속 증착을 방지 할 수있다. 그러나 작은 F스텐실의 두께는 마스크의 구멍을 통해 균일 한 금속 증착을 방지로 eatures (<1mm)은 일반적으...

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공개 사항

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저자는 충돌하는 재무 적 이해 관계를 가질 수 없습니다.

감사의 글

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O. 쿠 르툴​​ 루스와 D. Dimlioglu는 캘리포니아 대학 실험실 비용 연구 프로그램 상 12 LR-237197에 의해 지원됩니다. P. Daggumati는 과학 및 엔지니어링 (RISE) 상에있는 캘리포니아 대학교 데이비스 연구 투자의 대학에 의해 지원됩니다. CA 채프먼은 국립 필요 원정대의 교육 대학원 지원 분야의 부서에 의해 지원됩니다. 이 작품은 UC 랩 수수료 연구 프로그램, UC 데이비스 상승 및 엔지니어링 창업 자금 UC 데이비스 대학에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
골드 타겟LeskerEJTAUXX403A2np-Au
크롬 타겟LeskerEJTCRXX353A2접착 층
실버 타겟LeskerEJTAGXX403A2np-Au 도자기 보트 생산을위한 합금의 전구체
Thomas Scientific8542E40작은 샘플 질산 처리에 사용
Sigma-Aldrich43873탈합금에 70%에서 사용
J.T Baker7664-93-9피라냐 청소에 96%에서 사용
과산화수소J.T Baker7722-84-1피라냐 청소에 30%에서 사용
검 펀치Ted Pella150xx여러 크기로 사용
실리콘 엘라스토머 시트Rogers CorporationHT 6240여러 두께로 사용 가능
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich440191-100ML포지티브 레지스트
Microposit MF CD26Shipley38490포지티브 포토레지스트 개발자
PRS 3000JT BakerJT6403-5포지티브 포토레지스트 스트리퍼
원형 유리 커버 슬립 (12mm)Ted Pella26023금속 패턴 및 세포 배양의 기판으로 사용
유리 슬라이드 (1 x 3 인치)Ted Pella26007금속 패턴의 기판으로 사용
Kapton 폴리이 미드 테이프VWR82030-950엘라스토머
투명 마스크출력 도시포토 리소그래피에 사용 http://www.outputcity.com/
플라즈마 클리너Harrick PlasmaPDC-32G유리 표면 활성화에 사용
스퍼터링 머신Kurt J. LeskerLAB18금속 증착에 사용
생산을위한 합금의 전구체 황산 생 확보에 사용

참고문헌

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  15. Shulga, O., Zhou, D., Demchenko, A., Stine, K. Detection of free prostate specific antigen (fPSA) on a nanoporous gold platform. The Analyst. 133, 319-322 (2008).
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  19. Lee, D., et al. Microfabrication and mechanical properties of nanoporous gold at the nanoscale. Scripta Mater. 56, 437-440 (2007).
  20. Seker, E., et al. The effects of post-fabrication annealing on the mechanical properties of freestanding nanoporous gold structures. Acta Mater. 55, 4593-4602 (2007).
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