Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

Summary

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Abstract

국소화 기반 초고해상도 현미경을 적용하여 수십 나노미터의 공간 분해능을 가진 샘플 내에서 개별 형광 표지된 단일 분자의 분포에 대한 공간 지도(이미지)를 얻을 수 있습니다. 관심 단백질에 융합된 광활성(PAFP) 또는 광전환성(PSFP) 형광 단백질 또는 항체 또는 기타 관심 분자에 접합된 유기 염료를 사용하여 형광 광활성화 국소화 현미경(FPALM)은 단일 세포 내에서 여러 종의 분자를 동시에 이미지화할 수 있습니다. 다음과 같은 접근 방식을 사용하여 많은 수(수천에서 수십만 개)의 개별 분자 집단을 단일 세포에서 이미지화하고 ~10-30nm의 정밀도로 국소화합니다. 얻어진 데이터는 세포 내의 여러 단백질 유형의 나노 크기 공간 분포를 이해하는 데 적용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점 중 하나는 공간 해상도의 극적인 증가입니다: 기존 광학 현미경 검사에서 회절은 해상도를 ~200-250nm로 제한하는 반면, FPALM은 한 자릿수 이상의 이미지 길이를 이미지화할 수 있습니다. 많은 생물학적 가설이 서로 다른 생체 분자 간의 공간적 관계와 관련되어 있기 때문에 FPALM의 향상된 해상도는 이전에 기존 형광 현미경으로 접근할 수 없었던 세포 조직 문제에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 샘플 준비 및 데이터 수집 방법을 자세히 설명하는 것 외에도 여기에서는 FPALM의 광학 설정에 대해 설명합니다. 초고해상도 현미경 검사를 수행하고자 하는 연구자가 고려해야 할 또 다른 사항은 비용입니다: 사내 설정은 대부분의 상업적으로 이용 가능한 이미징 기계보다 훨씬 저렴합니다. 이 기술의 한계에는 세포 샘플 내에서 관심 분자의 라벨링을 최적화해야 할 필요성과 결과를 시각화하기 위한 후처리 소프트웨어의 필요성이 포함됩니다. 여기에서는 고정된 세포에서 두 개의 단백질 종을 이미지화하기 위해 PAFP 및 PSFP 발현을 사용하는 방법을 설명합니다. 살아있는 세포에 대한 기술의 확장도 설명됩니다.

Introduction

세포 구조는 광범위한 공간 규모에 존재하지만, ~250nm보다 작은 길이 규모에서 세포 조직의 형광 이미징은 회절 한계의 물리적 제약으로 인해 기존 현미경 검사에서 제한됩니다. 이 한계는 형광 광활성화 국소화 현미경 검사법(FPALM¹) 및 유사한 기술^2,3의 출현으로 극복되었으며, 이는 ~10nm의 정밀도로 많은 수의 개별 분자를 국소화할 수 있어 수십 나노미터의 해상도를 가진 이미지를 생성할 수 있습니다. FPALM은 광학 제어를 사용하여 분자의 부분 집합을 활성화 및 비활성화하는 것을 기반으로 합니다(FPALM에 대한 전체 설명 및 이 이미징 시스템을 구현하는 방법에 대한 지침은 Gould et al.⁴). 이 기술을 사용하면 단일 분자의 전체 개체군의 공간 분포를 매핑할 수 있으므로 수십 나노미터에서 수십 미크론에 이르는 길이 규모에 걸쳐 생물학적 구조를 설명할 수 있습니다. 국소화 기반 초고해상도 현미경 검사(이하 국소화 현미경이라고 함)는 이제 다양한 생물학적 문제를 해결하기 위해 채택되었으며, 예를 들어 편광 FPALM 또는 P-FPALM⁵를 사용한 개별 분자 배향의 이미징, Biplane FPALM⁶ 또는 기타 기술^7-9를 사용한 3차원 단일 분....

Protocol

참고: 이 프로토콜에서 참조되는 광학 구성 요소의 다이어그램 표현은 그림 1에서 찾을 수 있습니다.

1. 세포 시료 준비

1. 8웰 챔버의 웰에서 최적화된 밀도(NIH-3T3 세포의 경우 대략 2-5 x 10⁴ cells/cm²)의 플레이트 셀. 세포는 세포 유형에 적합한 완전한 배지로 도말해야 하지만, 배지는 항생제와 배경 형광에 기여하는 페놀 레드 없이 만들어야 합니다. 최적의 계대 수 범위와 같은 세포 실험 조건은 개별 세포주에 따라 다를 수 있습니다.
2. 세포가 커버슬립에 부착될 수 있도록 37°C 및 5% CO₂(또는 세포 유형에 적합한 조건)에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 두 단백질 종 구성물 각각에 대해 내독소가 없는 DNA로 세포를 transfection합니다(이 경우 PAmCherry-actin 및 Dendra2-HA용 DNA). 알루미늄 호일과 같은 가벼운 불침투성 재료로 샘플을 덮습니다. Transfection은 두 DNA 구조체를 모두 가진 well과 이러한 각 구조체 중 하나만 있는 well을 포함해야 합니다.
3. 완전한 배지(페놀 레드 없이 항생제 포함)로 변경하기 전에 4-6시....

Results

인플루엔자 헤마글루티닌(HA)은 수십 나노미터에서 마이크로미터 정도의 군집을 형성하며, 이러한 군집은 액틴과 다양하게 공동 국소화됩니다(그림 5). 이러한 공간 분포는 이 두 단백질의 더 거친 스케일 이미징²⁸ 및 액틴¹⁹에 대한 HA 공간 분포의 의존성을 확증합니다. 다색 FPALM 이미지는 이러한 클러스터의 밀도, 면적 및 둘레, 그리고 나노 및 마이크로 규모 모두에서 두 종 간의 공동 국소화 정도를 설명하는 데 추가로 사용될 수 있습니다. 얻어진 이미지의 해상도는 수십 나노미터^1,17 정도입니다. 여기에 제시된 렌더링된 이미지에서 이미지의 각 개별 지점은 20nm의 정밀도 내에서 단일 표지된 단백질 분자의 국소화를 나타냅니다. 투과된 광원을 사용하여 총 FOV의 이미지를 추가로 획득함으로써(그림 6), FPALM 이미지는 전체 셀과 그 주변 환경의 맥락에서 볼 수 있습니다.

Discussion

현지화 기반 초고해상도 이미징은 생물학적 이미징을 위한 많은 강력한 기능을 제공합니다. 테이블 위에 배치된 개별 광학 부품에서 생물학적 샘플에서 여러 형광 종을 동시에 이미징할 수 있는 기능적 초해상도 현미경까지의 경로는 여러 가지 문제를 제시합니다. 정렬의 일부 측면은 다른 측면보다 더 중요합니다. 우리는 아래에서 경로의 가장 어려운 측면을 다루는 잠재 사용자에게 지침을 제공하기 위해 노력합니다.

중요한 단계

FPALM 및 유사한 기술이 제공하는 향상된 이미지 해상도는 현미경의 안정화에 더 많은 주의를 기울여야 합니다. 기존의 현미경 이미지는 ~20-50nm 규모의 샘플 드리프트 또는 진동 운동(진동)에 의해 눈에 띄게 왜곡되지 않는 경우가 많지만, 초고해상도 현미경 이미지는 이러한 움직임에 의해 저하됩니다. 예를 들어, 원치 않는 움직임의 원인에는 현미경 및 샘플 내의 열 구배, 에어 테이블에 부착된 장비의 냉각 팬, 현미경 스테이.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabTek II 챔버	Nunc
형광 비드	Invitrogen	F-8801	보정용 비드
Tetraspeck 비드	Invitrogen	T-7279	보정용 4색 비드
대물렌즈 이멀젼 오일	Zeiss	518F	높은 NA 대물렌즈용 이멀젼 오일(대물렌즈 선택에 따라 다름)
HPLC water	Fisher Scientific	W5-4
Media	ATCC	30-2003	또는 Cellgro 10-090
항생제	GIBCO	15070-063
혈청	Thermo Scientific	SH30087.03
Lipofectamine	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
Trypsin	MPBiomedicals
파라포름알데히드	Fisher Scientific	AA433689M	주의: 독성