Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

Summary

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Abstract

국소화 기반 초고해상도 현미경을 적용하여 수십 나노미터의 공간 분해능을 가진 샘플 내에서 개별 형광 표지된 단일 분자의 분포에 대한 공간 지도(이미지)를 얻을 수 있습니다. 관심 단백질에 융합된 광활성(PAFP) 또는 광전환성(PSFP) 형광 단백질 또는 항체 또는 기타 관심 분자에 접합된 유기 염료를 사용하여 형광 광활성화 국소화 현미경(FPALM)은 단일 세포 내에서 여러 종의 분자를 동시에 이미지화할 수 있습니다. 다음과 같은 접근 방식을 사용하여 많은 수(수천에서 수십만 개)의 개별 분자 집단을 단일 세포에서 이미지화하고 ~10-30nm의 정밀도로 국소화합니다. 얻어진 데이터는 세포 내의 여러 단백질 유형의 나노 크기 공간 분포를 이해하는 데 적용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점 중 하나는 공간 해상도의 극적인 증가입니다: 기존 광학 현미경 검사에서 회절은 해상도를 ~200-250nm로 제한하는 반면, FPALM은 한 자릿수 이상의 이미지 길이를 이미지화할 수 있습니다. 많은 생물학적 가설이 서로 다른 생체 분자 간의 공간적 관계와 관련되어 있기 때문에 FPALM의 향상된 해상도는 이전에 기존 형광 현미경으로 접근할 수 없었던 세포 조직 문제에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 샘플 준비 및 데이터 수집 방법을 자세히 설명하는 것 외에도 여기에서는 FPALM의 광학 설정에 대해 설명합니다. 초고해상도 현미경 검사를 수행하고자 하는 연구자가 고려해야 할 또 다른 사항은 비용입니다: 사내 설정은 대부분의 상업적으로 이용 가능한 이미징 기계보다 훨씬 저렴합니다. 이 기술의 한계에는 세포 샘플 내에서 관심 분자의 라벨링을 최적화해야 할 필요성과 결과를 시각화하기 위한 후처리 소프트웨어의 필요성이 포함됩니다. 여기에서는 고정된 세포에서 두 개의 단백질 종을 이미지화하기 위해 PAFP 및 PSFP 발현을 사용하는 방법을 설명합니다. 살아있는 세포에 대한 기술의 확장도 설명됩니다.

Introduction

세포 구조는 광범위한 공간 규모에 존재하지만, ~250nm보다 작은 길이 규모에서 세포 조직의 형광 이미징은 회절 한계의 물리적 제약으로 인해 기존 현미경 검사에서 제한됩니다. 이 한계는 형광 광활성화 국소화 현미경 검사법(FPALM¹) 및 유사한 기술^2,3의 출현으로 극복되었으며, 이는 ~10nm의 정밀도로 많은 수의 개별 분자를 국소화할 수 있어 수십 나노미터의 해상도를 가진 이미지를 생성할 수 있습니다. FPALM은 광학 제어를 사용하여 분자의 부분 집합을 활성화 및 비활성화하는 것을 기반으로 합니다(FPALM에 대한 전체 설명 및 이 이미징 시스템을 구현하는 방법에 대한 지침은 Gould et al.⁴). 이 기술을 사용하면 단일 분자의 전체 개체군의 공간 분포를 매핑할 수 있으므로 수십 나노미터에서 수십 미크론에 이르는 길이 규모에 걸쳐 생물학적 구조를 설명할 수 있습니다. 국소화 기반 초고해상도 현미경 검사(이하 국소화 현미경이라고 함)는 이제 다양한 생물학적 문제를 해결하기 위해 채택되었으며, 예를 들어 편광 FPALM 또는 P-FPALM⁵를 사용한 개별 분자 배향의 이미징, Biplane FPALM⁶ 또는 기타 기술^7-9를 사용한 3차원 단일 분자의 형광 이미징을 허용하는 기술 개발이 가능해졌습니다, 그리고 살아있는 세포에서 단일 분자의 초고해상도 형광 이미징^10-12. 국소화 현미경 검사는 고정 세포에서 여러 종의 이미징에도 적용되었습니다^13-16. 최근에는 고정 세포와 살아있는 세포 모두에서 FPALM으로 3개의 단백질 종이 동시에 이미지화되었습니다¹⁷. 국소화 현미경 검사는 다양한 방법으로 라벨링된 샘플을 이미지화할 수 있습니다. 예를 들어 PAFP 또는 PSFP 융합 태그로 발현된 단백질, 케이지 유기 염료로 표지된 항체 또는 분자 또는 기존 유기 염료가 있습니다. 기존의 형광 염료를 사용하면 융합 단백질 태그가 없는 경우 단백질을 라벨링할 수 있지만, 초고해상도 이미징에서 비케이지 유기 염료를 사용하는 데 일반적으로 필요한 조건에서는 샘플을 환원 완충액에 담가야 합니다². 또한 항체 염료 접합체의 세포 내 전달은 일반적으로 세포를 고정하고 세포막을 투과화해야 합니다. 또는 살아있는 세포가 전기천공법이나 다른 수단을 통해 투과될 수 있도록 해야 합니다. 완충액 조건 및 멤브레인 투과율화를 줄이기 위한 요구 사항은 라이브 셀 이미징에 대한 유기 염료의 적합성을 제한하지만, 최근의 개발로 인해 멤브레인 구조를 이미지화하기 위해 HaloTags 및 FPALM을 효과적으로 사용할 수 있게 되었습니다¹⁸.

FPALM은 살아있는 세포에 적용된 최초의 국소화 현미경 기법입니다¹⁰. 살아있는 세포에서는 표지된 분자의 위치에 대한 시간 의존적 공간 지도를 제공하는 것 외에도 FPALM은 여러 프레임에 걸쳐 단일 분자를 추적하고 밀리초의 시간 척도에 걸쳐 결정된 분자 궤적을 추적할 수 있습니다¹⁹. 따라서 FPALM은 상당히 짧은 시간 척도와 나노 단위 분해능에 대한 액세스를 제공합니다.

다색 FPALM은 광활성성 단백질 및 유기 케이지 또는 비케이지 염료를 포함한 다양한 프로브에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 두 가지 형광 단백질 종인 Dendra2 및 PAmCherry의 동시 이미징을 위한 프로토콜 및 설정에 대한 세부 정보를 제공합니다. NIH-3T3 섬유아세포에서 베타 액틴(PAmCherry-actin)에 접합된 PAmCherry와 인플루엔자 헤마글루티닌(Dendra2-HA)에 접합된 Dendra2를 이미징한 결과를 보고합니다. 설정에 설명된 구성 요소는 다른 프로브의 이미징에 더 적합한 다른 하드웨어로 교체할 수 있습니다. 이 경우, 우리는 본문에서 명시하려고 노력했습니다.

Multicolor FPALM은 살아 있거나 고정된 세포에서 여러 단백질 종의 공간 분포를 보고하는 데 이상적입니다. 이 기술은 나노미터 길이의 공간 스케일에서 공간 및/또는 동적 관계를 조사하는 데 특히 적합하지만, 이미지는 수십 나노미터에서 수십 미크론에 이르는 다양한 길이 스케일에서 국소화를 보고합니다. 다색 FPALM의 주요 장점 중 하나는 설정이 비교적 저렴하고 다양한 프로브 조합과 함께 사용할 수 있는 매우 유연하다는 것입니다. 구성 요소에서 시스템을 구성하고 보정하는 프로세스는 또한 데이터의 품질과 해석 가능성, 그리고 연구 결과를 손상시킬 수 있는 요인에 대한 상당한 이해를 제공합니다. 여기에서는 FPALM을 사용하여 PSFP 및 PAFP 융합 구조를 통해 여러 단백질 종의 광학 설정, 샘플 준비 및 데이터 수집 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 고정된 세포의 분석을 설명하지만, 이러한 절차는 살아있는 세포의 이미징에 쉽게 적용할 수 있습니다.

여기에 설명된 광학 설정은 PSFP Dendra2와 PAFP PAmCherry의 동시 이미징에 이상적입니다. 다른 많은 프로브가 다색 이미징에 사용될 수 있습니다. 그러나 필요한 정밀 구성 요소는 선택한 프로브의 여기 및 방출 스펙트럼에 따라 달라질 수 있습니다. dichroic mirrors, filters, laser wavelength의 선택은 이러한 고려 사항에 따라 이루어져야 합니다.

Protocol

참고: 이 프로토콜에서 참조되는 광학 구성 요소의 다이어그램 표현은 그림 1에서 찾을 수 있습니다.

1. 세포 시료 준비

1. 8웰 챔버의 웰에서 최적화된 밀도(NIH-3T3 세포의 경우 대략 2-5 x 10⁴ cells/cm²)의 플레이트 셀. 세포는 세포 유형에 적합한 완전한 배지로 도말해야 하지만, 배지는 항생제와 배경 형광에 기여하는 페놀 레드 없이 만들어야 합니다. 최적의 계대 수 범위와 같은 세포 실험 조건은 개별 세포주에 따라 다를 수 있습니다.
2. 세포가 커버슬립에 부착될 수 있도록 37°C 및 5% CO₂(또는 세포 유형에 적합한 조건)에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 두 단백질 종 구성물 각각에 대해 내독소가 없는 DNA로 세포를 transfection합니다(이 경우 PAmCherry-actin 및 Dendra2-HA용 DNA). 알루미늄 호일과 같은 가벼운 불침투성 재료로 샘플을 덮습니다. Transfection은 두 DNA 구조체를 모두 가진 well과 이러한 각 구조체 중 하나만 있는 well을 포함해야 합니다.
3. 완전한 배지(페놀 레드 없이 항생제 포함)로 변경하기 전에 4-6시간, 37°C 및 5% CO₂(또는 세포 유형에 적합한 조건) 동안 배양하고 세포가 원하는 단백질을 발현할 수 있도록 16-48시간 동안 추가로 배양합니다.
   1. 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 세척한 다음 PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA)(주의: 독성)로 RT에서 15분 동안 배양한 다음 PBS로 3회 더 세척하여 고정할 수 있습니다. 그러나, 관심 단백질에 따라, 이러한 고정은 여전히 운동성이 있는 태그가 지정된 분자의 상당한 풀을 초래할 수 있습니다. 이동성을 더욱 줄이기 위해, 대안적인 고정 방법은 25°C에서 >30분 동안 PBS에 냉각된 100% 메탄올 또는 0.2% 글루테알데히드 및 4% PFA를 사용하는 것을 포함한다²⁰. 두 방법 모두 위와 같이 PBS로 세포를 세척해야 한다. 글루테알데히드의 사용은 일부 이미징 조건에서 배경 형광 또는 자가형광을 증가시킬 수 있으며, 수소화붕소나트륨²¹을 사용한 고정 후 처리가 필요할 수 있습니다.
4. 샘플은 이미징 전 최대 7일 동안 4°C에서 보관하고, PBS에 담그고, 자체 밀봉 필름으로 밀봉할 수 있습니다.

2. 현미경 정렬

1. 현미경 스테이지에 보정 저울(레티클)을 놓습니다. 10X 대물렌즈와 램프 투과광을 사용하여 레티클을 시야(FOV)의 중앙에 놓습니다.
2. 쾰러 조명. Köhler 조명용 현미경 조정²². 시작하려면 필드 조리개를 닫고 접안렌즈를 통해 십자선에 초점을 맞춥니다. 자기장 조리개의 가장자리가 초점이 맞지 않으면 자기장 조리개와 레티클에 모두 초점이 맞춰질 때까지 콘덴서의 높이를 조정합니다.
3. FOV를 기준으로 중앙에 올 때까지 필드 조리개의 측면 위치를 조정합니다. 레티클의 중앙 그리드만 켜질 때까지 필드 조리개를 닫습니다.
4. 카메라 위치를 대략적으로 정렬하려면(즉, 설정을 처음 정렬할 때) 높은 l을 사용하십시오.amp 카메라 셔터를 닫은 상태에서 강도를 높이고 1단계에 도달할 때까지 상자 B(그림 2.5)에 구성 요소를 광학 경로에 배치하지 마십시오. 카메라를 처음 정렬할 때 L2와 L3을 감지 경로에 두지 마십시오. 카메라의 수직 및 수평 위치를 조정하여 레티클 이미지를 카메라 셔터의 중앙에 대략적으로 배치합니다(그림 2B). EM 게인을 비활성화하고 실내 조명을 끈 다음 카메라 셔터를 엽니다.
5. 램프 강도를 카메라 센서를 손상시키지 않는 수준으로 줄인 후 레티클 이미지의 빛을 카메라 센서에 직접 투사합니다(그림 2A). 현미경 초점 노브를 조정하여 십자선의 초점을 맞추는 동안 view 획득 소프트웨어 내에서 라이브 비디오 모드로 이미지. 카메라의 수직 및 수평 위치를 조정하여 레티클 이미지를 카메라 센서의 중앙에 놓습니다(그림 2B).
6. L2와 L3을 조리개와 카메라 사이의 감지 경로에 배치합니다(그림 2C). L2와 L3을 정렬하여 L2가 현미경 출구 포트의 초점에서 한 초점 거리이고 L3이 카메라 센서에서 한 초점 거리가 되도록 합니다. L2와 L3 사이의 거리는 이상적으로는 L2와 L3의 초점 거리의 합과 같아야 하지만 공간 제약을 수용하기 위해 다소 조정할 수 있습니다. 카메라와 렌즈는 출구 포트와 같은 높이에 있어야 합니다.
7. 현미경에서 방출되는 빛은 L2와 L3의 중심에 있어야 합니다. L2와 현미경 사이의 거리를 조정하여 레티클 이미지가 카메라와 접안구 모두에 선명한 초점이 맞도록 합니다.
8. 필요한 경우 L2 및 L3의 작은 평행 이동(예: <1mm)을 사용하여 레티클 이미지를 카메라 센서의 중앙에 배치할 수 있습니다.
9. 2색 모듈. 카메라 위치가 최적화되면 상자 B(그림 1)에 표시된 구성 요소를 감지 경로에 부착합니다. 이러한 구성 요소를 탈착식 마운트에 부착할 수 있으므로 멀티컬러 FPALM을 위해 전체 모듈을 삽입하거나 필요하지 않은 다른 FPALM 애플리케이션을 위해 제거할 수 있습니다.
10. 이러한 구성 요소를 처음 조립할 때 각 채널의 경로 길이를 동일하게 조정합니다. 레티클을 카메라 칩에 투사하고, M7 및 M9를 조정하고/하거나 감지 조리개(AP)를 닫아 두 채널 간의 공간적 중복을 방지합니다. 반사광 채널에서 십자선의 이미지에 초점을 맞춥니다.
11. 투과광 채널의 이미지에 초점이 맞지 않으면 두 채널에서 십자선 이미지의 초점이 동시에 맞춰질 때까지 M9를 변환하고 필요한 경우 회전합니다. 두 채널은 서로 측면으로 이동해야 합니다(그림 2D). 이 변위는 수평 또는 수직에 관계없이 획득 속도에 영향을 줄 수 있습니다. 자세한 내용은 카메라 사용 설명서를 참조하십시오.
12. 십자선 스케일의 스냅샷을 기록합니다(나중에 전체 배율을 계산하는 데 사용). 카메라 소프트웨어를 사용하여 원하는 관심 영역을 선택합니다. 더 높은 프레임 속도는 일반적으로 더 작은 관심 영역에서 가능합니다.

3. 레이저 정렬

1. 판독 및 활성화 레이저를 켭니다. (주의: 레이저는 작업자가 레이저 안전 교육을 받은 후에만 사용해야 합니다.) 실험실의 모든 문은 닫혀 있어야 하며, 레이저가 정렬되는 동안 훈련된 필수 인력만 실험실 내부에 있어야 합니다. 셔터 SH1 및 SH2를 사용하여 사용하지 않을 때 각각 판독 빔과 활성화 빔을 차단하고 ND 필터를 사용하여 레이저 출력을 안전한 수준(<1mW)으로 감쇠합니다. 안전을 위해 필요한 조명을 제외하고 정렬하는 동안 모든 실내 조명을 최소화하는 것이 도움이 됩니다.
2. 활성화 및 판독 빔을 차단합니다. 레이저 경로에서 L1을 제거합니다.
3. 흰색 카드를 M4와 같은 높이로 놓습니다. 대부분의 상업용 복합 현미경에는 들어오는 조명을 차단하기 위해 셔터가 내장되어 있습니다. 가능한 경우 현미경 셔터를 열고 레티클 이미지가 M4에 투사될 때까지 초점을 맞춥니다. 내부 현미경 셔터를 사용할 수 없는 경우 모든 레이저 빔이 현미경으로 들어오는 것을 차단하는 편리한 위치에서 외부 셔터를 사용하십시오.
4. FOV에서 판독 레이저를 중앙에 배치합니다. 판독 빔의 차단을 해제합니다. M1을 조정하여 판독 빔을 M4의 십자선 이미지 십자선 중앙에 배치합니다.
5. 십자선 이미지를 M5에 투사하고 빔이 M5의 이미지 십자선의 중심이 될 때까지 미러 M4를 조정하여 판독 빔이 M4 및 M5 모두에서 십자선 십자선의 중심에 오도록 합니다. 판독 빔을 차단합니다.
6. FOV의 중앙 활성화 레이저. 레티클 이미지를 M3에 투사하고 레이저 경로에서 빔 익스팬더(BE)를 제거합니다. 활성화 빔의 차단을 해제합니다.
7. M2를 조정하여 활성화 빔이 M3에 있는 십자선 이미지의 십자선의 중앙에 오도록 합니다. 중앙에 배치되면 BE를 M2와 M3 사이로 교체하고 빔이 M3에 있는 레티클 이미지의 십자선의 중앙에 올 때까지 BE의 위치를 조정합니다.
8. 10X 대물렌즈를 사용하여 십자선 이미지를 M5에 투사하고 초점을 얻기 위해 필요한 경우 현미경 초점 손잡이를 조정합니다. 활성화 빔이 십자선 이미지의 중앙에 올 때까지 DM1의 각도를 조정합니다. 두 빔을 모두 차단합니다.
9. 대물렌즈가 없고 현미경 셔터가 열린 상태에서 현미경의 후면 조리개를 통해 판독 레이저를 투사합니다. (주의: 이 단계는 차단되지 않은 수직 경로로 평행 레이저 빔을 유도하여 레이저 안전 위험을 생성합니다.) 빔이 현미경에서 바로 나와 바로 위의 천장에 떨어지거나 포탑의 대물렌즈 마운트에 있는 카드의 중앙에 놓일 때까지 M5를 조정합니다.
10. 선택 사항: 용액 내 염료 샘플(이 경우 물 내 ~100μM의 로다민 B 또는 시각적 목적으로 >0.5cm 깊이의 메탄올)을 60X 대물 렌즈가 장착된 샘플 스테이지에 배치하여 올바른 정렬을 쉽게 결정할 수 있습니다. 빔이 올바르게 정렬되면 대물렌즈는 대물렌즈와 현미경의 축과 정렬된 형광 원뿔을 투사합니다. 대물렌즈 후면 조리개에서 레이저 빔 배치의 작은 편차로 인해 원뿔이 완전히 수직 정렬에서 멀어집니다.
11. 두 빔을 모두 차단합니다. 대물 렌즈의 후면 조리개에서 적절한 거리(즉, 하나의 초점 거리)에서 레이저 경로에 L1을 장착합니다. 60X 대물렌즈를 장착한 상태에서 판독 빔이 천장에 투사되도록 합니다. 빔이 현미경 위의 중앙에 올 때까지 L1의 수평 및 수직 위치(레이저 전파 방향에 수직)를 조정합니다. 참고: 이 단계에서 빔은 이전 단계보다 더 큰 스폿을 형성합니다.
12. L1의 축 위치와 초점 거리는 샘플에서 조명 영역의 크기에 영향을 미칩니다. 엄밀히 말하면, 샘플에서 조명 프로파일의 계산은 회절²³을 고려해야 합니다. 그러나, 대략적으로 말하면, 대물렌즈 후방 초점면으로부터 하나의 초점 거리 이외의 축 거리에 L1을 배치하는 것은 많은 경우에 L1이 후방 초점면으로부터 정확히 하나의 초점 거리에 있을 때보다 더 작고 더 강렬한 레이저 조명 프로파일을 유발합니다. 더 작은 조명 영역을 사용하여 예를 들어 고속 이미징과 같은 특정 응용 분야에서 더 높은 레이저 강도를 생성할 수 있습니다.
13. 판독 빔 프로파일의 측정. L1이 제자리에 있는 상태에서 적절한 농축 염료 용액 샘플(이 경우 물 내 ~100μM의 로다민 B)을 스테이지에 놓습니다.
14. 활성화 레이저가 차단된 상태에서 판독 레이저를 투사하고(노출된 모든 빔에 대해 <<1mW의 출력을 얻으려면 ND1 조정) 60X 대물렌즈를 통해 염료에 투사하고(EM 게인이 비활성화된 상태에서) 이 이미지를 카메라로 보냅니다.
15. 대물렌즈를 샘플에 집중합니다. 이 단계에서는 전체 빔 프로파일을 이미징할 수 있을 만큼 충분히 큰 조리개가 필요합니다.
16. 빔 프로파일의 중심과 AP가 동심원이 되도록 AP를 측면으로 변환합니다. 카메라 소프트웨어를 사용하여 두 채널을 모두 캡슐화하는 가장 작은 카메라 판독 영역을 허용하도록 관심 영역을 선택합니다. 이 좌표를 기록합니다. 단일 스냅샷을 기록합니다(판독 빔 프로파일).
17. 초점면에서 레이저 프로파일을 보다 정확하게 반영하는 이미지는 염료 용액 샘플이 가능한 한 얇을 때 얻을 수 있습니다. 이러한 얇은 샘플은 현미경 슬라이드와 커버슬립 사이에 ~5ul의 염료 용액 한 방울을 떨어뜨려 만들 수 있습니다.
18. Activation Beam Profile의 측정.판독 레이저를 차단합니다. 활성화 레이저를 샘플에 투사합니다. 이 이미지를 카메라에 투사합니다.
19. 필요한 경우 EM gain <100을 사용하고 빔이 각 FOV의 중앙에 올 때까지 DM1을 조정합니다. 활성화 빔 프로파일의 스냅샷을 기록합니다.
20. 각 빔의 힘을 측정합니다. 염료 용액을 제거하고 60X 대물렌즈(침지 매체 없음) 위에 파워 미터 센서를 놓습니다. 각 빔의 출력(활성화 및 판독)을 개별적으로 측정합니다. 방출된 모든 레이저 전력이 파워 미터 센서에 부딪히도록 파워 미터의 위치를 신중하게 조정해야 합니다.
21. 각 레이저에 대해 중성 밀도 필터(ND1 및 ND2)를 사용하여 실험에 적합한 샘플에서 강도를 생성하도록 출력을 조정합니다.
22. 이미지 획득을 위한 판독 레이저의 강도. 판독 레이저 강도는 몇 프레임의 시간 범위 내에서 단일 분자를 여기시키고 광표백할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다. 일반적인 값은 10^{3-10 4} W/cm²입니다(Gould et al. 참조).⁴). 샘플의 강도는 이미지 영역의 크기에 따라 달라지므로 원하는 강도를 달성하는 데 필요한 전력은 시스템마다 다릅니다.
23. 활성화 레이저의 강도. 활성화 레이저 강도는 주어진 획득 프레임에서 활성 분자의 수가 작은(예: 1-100) 선택되어야 합니다. 대략적으로 말하면, 활성 분자 사이의 가장 가까운 거리가 회절 제한 해상도보다 약간 클 때 원하는 밀도에 도달합니다(섹션 6, 이미징 참조). 비활성 단일 분자의 모집단이 감소함에 따라 활성화 레이저의 더 높은 강도가 필요합니다. 일반적인 강도는 ^{10-1-10 2} W/cm²입니다.
24. 쿼터 웨이브 플레이트를 최적화합니다. QWP(quarter wave plate)는 선택 사항이지만 QWP를 사용하여 판독 및 활성화 레이저의 원형 편광 정도를 높이면 최종 이미지에서 분자 밀도를 높일 수 있습니다. QWP를 최적화하려면 QWP와 M5 사이에 편광판을 배치하십시오. 활성화 레이저를 차단합니다. 판독 레이저를 건식 60X 대물렌즈 위의 파워 미터에 투사합니다.
25. QWP의 각도를 기록합니다. 편광판을 최대까지 조정하면 최소 전력에 도달합니다. 이러한 각 값을 기록하고 최소값/최대값의 비율을 계산합니다. QWP의 각도를 조정하고 이러한 측정을 반복합니다. 1.0에 가까운 값을 얻는 것이 바람직하지만 이미징에는 >0.8의 비율로 충분합니다.

4. 채널 정렬을 위한 내구성 있는 비드 샘플 만들기

1. 형광 비드 샘플(직경 40-100nm)을 HPLC 등급의 물에 1:70으로 희석합니다. 이 원액을 HPLC 물에 1:15로 더 희석하여 물 중 최종 부피 200μl bead suspension을 만듭니다.
2. 커버슬립에 액상 폴리-L-라이신을 코팅합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다. 용액을 제거하기 위해 흡인하고 HPLC 등급의 물로 커버슬립을 세 번 세척합니다. 커버슬립에서 물의 흔적을 모두 흡인하고 RT에서 건조시킵니다.
3. 비드 현탁액의 200μl를 커버슬립에 피펫으로 분사합니다. 이 커버슬립을 RT에서 20분 동안 그대로 두었다가 HPLC 물로 세 번 씻습니다. 또는 커버슬립 O/N을 RT로 두어 서스펜션이 건조될 수 있도록 합니다.
4. ~20μl의 HPLC 물 또는 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 유리 슬라이드에 장착합니다. 커버슬립의 주변을 투명한 매니큐어로 밀봉합니다. 광택제가 마르면 커버슬립(및 적절한 대물렌즈 침지 매체, 물 또는 오일)을 60X 대물렌즈에 놓습니다.

5. 이미지 획득: 검출 채널 정렬을 위한 이미징 비드 샘플

1. 판독 레이저 빔으로 비드 샘플을 이미징에 사용되는 것보다 약 10배 낮은 강도로 비춥니다. EM 게인을 100으로 설정하고 이미지를 카메라에 투사하고 두 채널에서 비드가 보일 때까지 초점을 조정합니다.
2. 비드가 어둡면 레이저 출력 또는 EM 게인을 높이십시오. 비드 이미지에서 노이즈를 최소화하는 것(많은 수의 광자, 즉 각 비드에서 총 5,000개 이상을 검출)은 정확한 채널 정합을 위해 매우 중요합니다. 후속 FPALM 이미징에 사용되는 것과 동일한 노출 시간으로 100프레임을 녹화하도록 카메라를 구성합니다.
3. beads가 채널의 중앙과 주변부 모두에 분포되어 있고 bead density가 충분히 낮아 개별 beads가 잘 분리되어 개별적으로 식별할 수 있는 영역을 검색합니다.
4. 이러한 비드 밀도에서 서로 다른 영역의 10-20개 세트의 이미지를 획득합니다. 채널 보정을 위한 비드 이미지 사용에 대한 자세한 내용은 결과 섹션을 참조하십시오.

6. 이미지 획득: 다색 FPALM

1. 각 구조체 중 하나만 transfection된 세포를 이미지화하는 것뿐만 아니라 모든 구조체를 가진 세포의 이미지를 기록하는 것이 중요합니다. 이러한 데이터는 사용된 각 프로브의 알파 히스토그램을 설정하는 데 도움이 되며 다색 데이터의 해석에 필요합니다.
2. 사용 중인 경우 광전환 가능한 프로브를 발현하는 세포를 찾습니다. 모든 실내 조명을 제거하십시오. 플립 마운트(FM)를 통해 수은 램프를 샘플(형질주입된 세포 포함)에 투사합니다. 터렛 필터 큐브를 적절한 이색성 미러/필터 조합을 포함하는 큐브로 변경하여 레이블의 사전 광전환 상태의 여기를 허용합니다. 예를 들어, 사전 광전환 Dendra2 또는 녹색 사전 전환 방출을 가진 프로브를 이미징하는 경우 DM4의 경우 청색광(<488nm)을 반사하는 이색성이고 F5의 경우 ~500-570nm의 빛을 통과시키면서 이 범위를 벗어난 빛을 차단하는 필터입니다.
3. 안구를 사용하여 전광염색된 프로브를 발현하는 세포를 검색합니다. 예를 들어, Dendra2를 발현하는 셀은 녹색으로 표시됩니다. 모든 프로브가 광전환이 가능한 것은 아니며, 사전 스위칭 방출 스펙트럼에 따라 여기에 나열된 것과 다른 DM4/F5 조합이 필요할 수 있습니다.
4. 세포가 선택되면 FM을 아래로 이동하여 레이저가 현미경으로 통과할 수 있도록 합니다(경로에서 수은광을 차단). 필터 터렛을 이미징에 적합한 이색성을 포함하는 터렛으로 변경합니다(이 경우 DM2는 더 긴 파장을 투과하면서 판독 레이저와 활성화 레이저를 모두 반사해야 하고, F1은 레이저의 빨간색으로 파장을 투과해야 하며 이상적으로는 레이저 파장에서 높은 억제를 특징으로 함).
5. 세포가 광전환 가능한 프로브를 발현하지 않는 경우, 이미지를 카메라에 투사하고 판독 레이저를 사용하여 샘플을 조명하여 세포를 검색합니다. 단일 분자는 많은 세포에서 볼 수 있을 것입니다(그림 3 참조).
6. 형질주입된 세포를 배경 형광(여전히 개별적으로 깜박이는 분자로 나타날 수 있음)과 구별하고 분자가 광활성성인지 확인하기 위해 활성화 레이저의 저출력(일반적으로 마이크로와트 정도)으로 샘플을 간략하게 조명합니다. 판독 빔 아래에서 볼 수 있는 광활성성 분자의 수는 극적으로 증가해야 하며 활성화 조명이 다시 한 번 차단된 후에도 짧은 시간 동안 높게 유지되어야 합니다. 다른 프로브는 밝기, 광 변환 효율 및 활성화에 필요한 레이저 출력^24-27에서 상당히 다를 수 있습니다.
7. EM 게인을 200으로 설정하고 원하는 프레임 수(일반적으로 5,000-10,000)와 노출 시간(일반적으로 10-30msec가 적절함)을 선택하여 키네틱 시리즈 획득을 위한 카메라 소프트웨어를 준비합니다. EM 게인은 200보다 높게 설정할 수 있지만 특정 지점을 넘어서면 EM 게인이 증가하면 노이즈가 증가할 수 있습니다.
8. 활성화 빔을 차단합니다. 판독 빔의 차단을 해제하고 조명이 켜진 셀의 이미지를 카메라에 투사합니다.
9. 세포가 transfection되었는지 확인합니다(6.6단계). 세포를 보면서 원하는 초점면이 시야에 들어오고 분자가 선명한 초점이 맞춰질 때까지 초점을 조정합니다.
10. 하단 세포막 근처에서 이미징하는 초점면을 선택하려면 개별 분자가 더 이상 보이지 않을 때까지 초점을 아래로 이동합니다. 그런 다음 분자가 처음 보일 때까지 초점을 점차적으로 위쪽으로 이동합니다.
11. 상단 세포막 근처에서 이미지를 얻으려면 현미경 초점 노브 또는 자동 초점을 사용하여 거리를 기록하면서 원하는 양만큼 초점을 계속 위로 이동합니다. 이 두 한계 사이의 초점 영역을 선택하면 이미징되는 세포의 중간에 영역이 생성됩니다.
12. 활성화 빔의 차단을 해제하고 샘플을 낮은 강도로 비춥니다(ND2 필터를 사용하여 빔을 매우 낮은 강도(샘플에서 약 <1 W/cm²)로 감쇠).
13. 데이터 수집을 시작합니다. 활성 분자의 고밀도가 바람직합니다. 그러나 분석 단계에서는 이러한 분자가 공간적으로 겹치지 않도록 하는 것이 중요합니다.
14. ND2를 조정하여 ~0.1-1 ^μm-2의 가시광선 광활성성 분자의 밀도를 유지하려고 시도합니다. 일반적으로 직경이 ~10-20μm인 이미지 영역의 경우 한 번에 ~10-100개의 분자를 볼 수 있습니다(참고로 그림 3 및 4 참조). 획득 과정에서 남아 있는 비활성 분자의 수가 감소함에 따라 활성화 레이저 출력은 밀도를 유지하기 위해 점진적으로 증가해야 할 수 있습니다.
15. TIRF 이미징이 필요한 경우*, M5 및 L1을 모두 단일 translation stage(TS, 그림 1)에 장착하여 측면으로(즉, 현미경 입구 바로 뒤의 레이저에 수직인 방향으로) 이동해야 합니다. M5 및 L1이 번역됨에 따라 샘플을 통해 대물렌즈에서 위쪽으로 나가는 레이저는 점차 한쪽으로 기울어집니다(주의: 레이저 안전 위험).
16. 레이저의 각도가 수직에서 90°에 도달하면 나오는 레이저 자체가 사라지고 들어오는 판독 레이저는 역반사되어 대물렌즈 후면 조리개에서 나오는 빔으로 나타나고 들어오는 빔과 반평행하고 측면으로 변위됩니다.
17. 동시에 배경 형광은 거의 완전히 감쇠되고 식별 가능한 집속된 단일 분자를 포함하는 샘플 영역의 두께가 크게 감소합니다.
    *TIRF는 커버슬립 위 ~100-500nm에 있는 샘플의 얇은 부분을 이미징할 수 있습니다. 샘플에 더 깊이 들어가는 초점면의 이미징은 광시야 조명(섹션 3)을 사용하여 쉽게 달성할 수 있지만 TIRF.
    에는 적합하지 않습니다
.
18. 획득이 완료되면 즉시 현미경 셔터를 닫고 두 빔을 모두 차단합니다. EM 게인을 비활성화하고, 한 프레임을 기록하도록 카메라를 설정하고, 카메라 판독 영역을 최대 크기로 설정합니다.
19. F3 또는 F4 위에 카드를 놓아 한 채널을 차단합니다. 현미경 램프에 장착된 롱패스 필터(>580nm)를 사용하여 샘플을 비추고 이 이미지를 카메라에 투사합니다. 셀의 스냅샷을 기록합니다.
20. 선택 사항: 하나의 채널이 여전히 차단된 상태에서 조리개를 열어 샘플의 넓은 영역이 투과광 조명으로 보이도록 합니다. 스냅샷을 기록합니다. 이러한 투과광 이미지는 해당 FPALM 이미지의 컨텍스트를 보는 데 매우 유용합니다.
21. 라이브 셀 이미징. 살아있는 세포를 이미지화하려면 1.1-1.3 단계에 따라 세포를 transfection하되 이러한 샘플을 고정하지는 마십시오. 대신, 위에서 설명한 대로 설정을 정렬하되, 샘플을 이미징하기 전에 37°C 및 5% CO₂에서 제거하고 PBS에서 3배 세척한 다음 이미징 매체(예: 20mM 포도당이 있는 PBS)에 샘플을 담그십시오. 배양 배지를 제거하고 세척하면 대부분의 세포 배지와 관련된 배경이 줄어듭니다.
22. 시료는 원하는 경우 고정 셀과 같이 RT에서 이미징하거나 현미경 스테이지에 장착된 배양 스테이지를 사용하여 37°C 및 5%_CO2에서 이미징할 수 있습니다. NIH 3T3 세포의 단일 샘플은 약 1시간 이상 이미징 배지에 담가야 합니다. 이러한 종류의 실험을 준비하기 전에 세포가 이미징 매체에 침지할 때 어떻게 반응하는지 모니터링하여 침지 시간을 최적화하고 잠재적으로 이미징 매체의 조성을 최적화하여 세포의 섭동을 줄이는 것이 도움이 될 수 있습니다.

Results

인플루엔자 헤마글루티닌(HA)은 수십 나노미터에서 마이크로미터 정도의 군집을 형성하며, 이러한 군집은 액틴과 다양하게 공동 국소화됩니다(그림 5). 이러한 공간 분포는 이 두 단백질의 더 거친 스케일 이미징²⁸ 및 액틴¹⁹에 대한 HA 공간 분포의 의존성을 확증합니다. 다색 FPALM 이미지는 이러한 클러스터의 밀도, 면적 및 둘레, 그리고 나노 및 마이크로 규모 모두에서 두 종 간의 공동 국소화 정도를 설명하는 데 추가로 사용될 수 있습니다. 얻어진 이미지의 해상도는 수십 나노미터^1,17 정도입니다. 여기에 제시된 렌더링된 이미지에서 이미지의 각 개별 지점은 20nm의 정밀도 내에서 단일 표지된 단백질 분자의 국소화를 나타냅니다. 투과된 광원을 사용하여 총 FOV의 이미지를 추가로 획득함으로써(그림 6), FPALM 이미지는 전체 셀과 그 주변 환경의 맥락에서 볼 수 있습니다.

Discussion

현지화 기반 초고해상도 이미징은 생물학적 이미징을 위한 많은 강력한 기능을 제공합니다. 테이블 위에 배치된 개별 광학 부품에서 생물학적 샘플에서 여러 형광 종을 동시에 이미징할 수 있는 기능적 초해상도 현미경까지의 경로는 여러 가지 문제를 제시합니다. 정렬의 일부 측면은 다른 측면보다 더 중요합니다. 우리는 아래에서 경로의 가장 어려운 측면을 다루는 잠재 사용자에게 지침을 제공하기 위해 노력합니다.

중요한 단계

FPALM 및 유사한 기술이 제공하는 향상된 이미지 해상도는 현미경의 안정화에 더 많은 주의를 기울여야 합니다. 기존의 현미경 이미지는 ~20-50nm 규모의 샘플 드리프트 또는 진동 운동(진동)에 의해 눈에 띄게 왜곡되지 않는 경우가 많지만, 초고해상도 현미경 이미지는 이러한 움직임에 의해 저하됩니다. 예를 들어, 원치 않는 움직임의 원인에는 현미경 및 샘플 내의 열 구배, 에어 테이블에 부착된 장비의 냉각 팬, 현미경 스테이...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabTek II 챔버	Nunc
형광 비드	Invitrogen	F-8801	보정용 비드
Tetraspeck 비드	Invitrogen	T-7279	보정용 4색 비드
대물렌즈 이멀젼 오일	Zeiss	518F	높은 NA 대물렌즈용 이멀젼 오일(대물렌즈 선택에 따라 다름)
HPLC water	Fisher Scientific	W5-4
Media	ATCC	30-2003	또는 Cellgro 10-090
항생제	GIBCO	15070-063
혈청	Thermo Scientific	SH30087.03
Lipofectamine	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
Trypsin	MPBiomedicals
파라포름알데히드	Fisher Scientific	AA433689M	주의: 독성