방법 논문

기록 개인과 성인 Zebrafish의 떼에 자동 3D 추적 시스템을 사용하여

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DOI:

10.3791/50681

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2013년 12월 5일

 ,  , 
1R&D, xyZfish

이 논문에서

요약

제브라피쉬의 개별 및 그룹을 추적할 수 있는 3D 자동 비디오 시스템의 사용에 대해 설명합니다. 응용 사례로, NMDA 수용체 길항제 MK-801이 제브라피시 떼에 미치는 영향을 조사합니다.

초록

많은 수생 동물과 마찬가지로 제브라피쉬(Danio rerio)는 3D 공간에서 움직입니다. 따라서 3D 기록 시스템을 사용하여 거동을 연구하는 것이 좋습니다. 제시된 자동 비디오 추적 시스템은 미러 시스템과 광이 물에서 공기로 전환됨에 따라 발생하는 상당한 오류를 수정하는 보정 절차를 사용하여 이를 수행합니다. 이 시스템을 사용하면 성인 제브라피쉬의 단일 및 그룹을 모두 기록할 수 있습니다. 사용하기 전에 시스템을 보정해야 합니다. 이 시스템은 기록(Recording), 경로 재구성(Path Reconstruction) 및 데이터 처리(Data Processing)의 세 가지 모듈로 구성됩니다. 세 가지 모듈을 교정하고 사용하기 위한 단계별 프로토콜이 제시되어 있습니다. 실험 설정에 따라 이 시스템은 신 공포증, 백인 혐오, 사회적 응집력, 운동 장애, 새로운 물체 탐사 등을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 특히 약물이나 돌연변이가 기본 행동 패턴에 미치는 영향을 연구하기 위한 첫 번째 단계 도구로 유망합니다. 이 시스템은 제브라피시의 수직 및 수평 분포, 운동학적 매개변수의 xyz 구성 요소(예: 이동, 속도, 가속도 및 회전 각도)에 대한 정보를 제공하고 여울을 테스트할 때 사회적 응집력을 위한 매개변수를 계산하는 데 필요한 데이터를 제공합니다.

서론

얼룩말은 생물학 및 약리학 연구의 중요한 모델이 되었습니다1-3. 개별 제브라피시와 제브라피시 떼의 움직임과 공간 분포 패턴을 추적하는 것은 매우 중요합니다. 이전 연구에서는 기록된 이미지를 기반으로 수동 정량화를 적용합니다4. 이제 2D 자동 비디오 추적 시스템이 일반적으로 사용됩니다5. 그러나 제브라피시를 비롯한 많은 수생 및 비수생 동물이 3차원 공간에서 움직이기 때문에 3D 시스템에 대한 관심이 높아지고 있습니다6. 설명된 3D 시스템은 20077년에 처음 발표되었습니다. 기술 세부 사항 및 다른 시스템과의 비교는8을 참조하십시오. 다른 시스템과 비교했을 때 이 시스템의 기본적인 장점은 미러링 시스템을 사용하여 2개(선택적으로 3개)의 동기 및 독립 보기를 획득하고 2단계 보정 프로토콜을 사용한다는 것입니다. 첫 번째 단계에서는 스테레오 시스템의 3D 형상(카메라와 미러에 의해 형성됨)이 보정됩니다. 두 번째 단계에서는 빛의 굴절로 인해 발생하는 비선형 오류가 수정됩니다. 수생 동물을 연구할 때 보정하지 않고 방치하면 빛 굴절의 영향이 상당할 수 있습니다. 지금까지 발표된 다른 시스템(심지어 최신 개발9)은 2단계 교정 절차를 생략합니다. 물체 식별, 다중 물체 추적을 통한 폐색, 지깅 노이즈 등에 대한 기술적 세부 정보. 독자는 원본 출판물8,9를 참조한다. 이 시스템은 불안과 유사한 행동 반응10,11, 얕은8,11,12 및 예비 연구에서 제브라피시13의 적대적 행동에 대한 연구를 위해 검증되었습니다. 또한 다른 물고기 종(금붕어8, 쇠꼬리, 호랑이 미늘)과 생쥐9에 대해서도 테스트되었습니다.

다음에서는 시스템 보정 및 사용을 위한 프로토콜이 설명되며, NMDA 수용체 비경쟁 길항제 MK-801이 제브라피시에 미치는 영향을 테스트하는 실험 결과를 대표적인 예로 제시하여 시스템으로 얻을 수 있는 데이터 유형을 보여줍니다.

자연 환경과 수족관 모두에서 제브라피쉬는 일반적으로14번 떼에서 수영합니다. 떼를 지어 다니는 것에 대한 선호도는 사육, 성별, 식량 가용성과 같은 몇 가지 요인에 의존하는 것으로 보인다14,15. 흥미롭게도, 암초에 있는 개별 제브라피시 사이의 거리는 경보 페로몬16 또는 참신함11과 같은 잠재적 위험 신호가 존재할 때 작아집니다. 따라서 떼를 짓는 패러다임은 불안 완화제를 테스트하는 데에도 사용되고 있습니다17. 지배 계층(Dominance hierarchies)18과 사회적 학습(social learning)19은 제브라피시 행동의 흥미로운 측면이다. 고도로 발달된 사회적 행동 특성으로 인해 제브라피쉬는 자폐증 연구에서도 관심을 갖게 되었습니다20,21.

MK-801은 제브라피시5,22,23의 사회적 행동을 변화시키는 것으로 보고되었으며, 이는 포유류24에 대한 영향을 연상시킵니다. 그러나 MK-801은 다른 행동(예: 수영 행동, 억제 회피 및 장소 선호25-27)에도 많은 다른 영향을 미칩니다. 따라서 초기 실험에서는 기본 관찰에서 가능한 한 많은 정보를 얻는 것이 중요합니다. 이것은 보다 표적화된 실험을 설계하기 위한 기초를 제공할 것입니다.

녹음 장치 및 소프트웨어 조사

현재 구성에서는 제브라피쉬를 담고 있는 관찰 컨테이너(25 cm x 25 cm x 18 cm, L x W x H)가 관찰실(91 cm x 46 cm x 56 cm, L x W x H)에 위치합니다. 챔버에는 카메라, 용기 위 약 >45° 각도로 매달려 있는 거울, LED 조명 막대도 포함되어 있습니다. 그림 1은 단순화된 다이어그램을 보여줍니다. 카메라는 정면 뷰와 평면도(미러)를 모두 기록하여 제브라피쉬의 x, y, z 좌표를 결정하여 제브라피쉬의 3D 궤적을 구성합니다. 방향을 위해 좌표 벡터는 관찰 컨테이너의 왼쪽 전면 모서리(카메라를 기준으로 한 위치)에 표시되며, 이는 경로 재구성 모듈(아래 참조)에 의해 생성된 3D 뷰(예: 그림 15)에 표시된 벡터에 해당합니다. 샘플링 속도는 카메라와 컴퓨터에 따라 다릅니다. 이 실험에서는 약 40프레임/초(fps)입니다. 기록된 프레임의 공간 해상도는 640 x 480 픽셀입니다(이 구성은 공간 해상도와 시간 해상도 간의 최적 균형으로 선택되었습니다). Windows XP 이상이 필요합니다.

첫 번째 기록 전에 시스템을 보정하여 용기 벽과 수면의 위치를 결정하고, 기록된 프레임의 스케일링 팩터를 결정하고, 물에서 공기로 통과할 때 빛의 굴절로 인해 생성되는 상당한 오류를 조정해야 합니다. 원칙적으로 캘리브레이션은 초기 설치 중과 카메라 또는 미러와 같은 설정 부품을 이동하거나 교체한 후에만 수행해야 합니다. 그럼에도 불구하고 교정이 여전히 올바른지 수시로 확인하고 필요한 경우 다시 교정하는 것이 좋습니다.

소프트웨어는 세 개의 모듈로 구성됩니다. Recordings Module은 프레임을 기록합니다(그림 2에 표시된 두 개의 예시 프레임). 궤적 모듈은 모든 제브라피시의 경로를 재구성합니다. 데이터 처리 모듈은 표준 운동학 및 공간 매개변수의 범위를 계산합니다. 추가 분석을 위해 데이터를 스프레드시트 또는 통계 소프트웨어로 가져올 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험은 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다.

1. 캘리브레이션

  1. 용기의 발이 올바른 정렬을 위해 제공된 구멍에 삽입되도록 챔버에 빈 관찰 용기를 놓습니다. 반투명 벽(구조의 목적은 반사를 줄이는 것)이 카메라의 먼 쪽과 오른쪽을 향하도록 컨테이너의 방향을 지정합니다.
  2. 녹화 모듈을 열고 '카메라 제어'를 선택한 다음 이미지가 선명하도록 '게인' 및 '셔터'(선택을 취소한 후 오른쪽 상자)를 조정합니다. 관찰 용기의 왼쪽에 사이드 미러를 약 45° 각도로 배치하여 컴퓨터 모니터에서 컨테이너의 측면 뷰가 완전히 보이도록 합니다. 또한 용기의 전면 벽이 하나의 선으로 보이도록 거울을 정렬해야 합니다(그림 3에서 화살표로 표시된 대로).
  3. 캘리브레이션 패널을 카메라 카드의 병렬 포트에 연결하고 레코딩 모듈의 'LED 패널 켜기/끄기' 버튼을 눌러 LED를 켭니다.
  4. 그림 3과 같이 컴퓨터 모니터의 전면, 상단 및 측면 보기에서 5개의 LED를 볼 수 있도록 빈 관찰 용기에 보정 패널을 놓습니다(때때로 케이블이 시야를 차단합니다. 이 경우 이동). 또한 LED가 수위 표시 아래에 있는지(이 표시는 탱크 내부 바닥에서 135mm의 관찰 용기에 새겨져 있음) 패널의 위치가 안정적인지(1.9단계에서 용기에 물을 채울 때 움직이지 않도록).
  5. 관찰실의 조명을 끄고 커튼을 닫습니다(보정 패널의 케이블이나 사이드 미러를 만지지 않도록 주의).
  6. '데이터 위치' 버튼을 누르고 캘리브레이션 파일을 저장할 폴더를 만들거나 선택합니다. 이 파일은 재보정이 필요할 때까지 모든 후속 녹음(또는 실험)에 사용됩니다. 따라서 이상적으로는 교정 데이터를 교정 폴더 이름의 일부로 만드는 것이 좋습니다.
  7. 컴퓨터 화면에서 세 개의 빨간색 상자를 조정하여 각 상자가 세 가지 보기 중 하나에서 5개의 LED를 포함하도록 합니다(그림 4, 왼쪽 패널). 다시 '카메라 제어'에서 '게인'과 '셔터'를 사용하여 그림 4의 오른쪽 패널과 같이 다른 조명 점(용기 벽의 노이즈, 반사 또는 물방울로 인한)의 이미지 없이 LED의 선명한 이미지를 얻습니다.
  8. LED를 끄고 '물 없이 보정 수집' 버튼을 누릅니다. 컴퓨터 화면에 0-4까지 번호가 매겨진 5개의 태그('x')가 나타납니다. 패널을 켭니다. 태그의 위치는 LED와 일치해야 합니다. 그렇지 않은 경우 1.7단계를 반복합니다(왼쪽 패널의 잘못된 태그 할당과 오른쪽 패널의 올바른 태그 할당에 대한 그림은 그림 4 참조).
  9. 관찰 챔버에 표시선까지 물을 채웁니다. LED는 수위 아래에 있어야 합니다(1.4단계에서 설명함). 수위보다 높으면 용기를 비우고 1.4단계로 돌아갑니다. 용기에 물을 채울 때 LED 패널이 움직이지 않도록 주의하세요. 그러나 이 경우 컨테이너를 비우고 1.4단계로 돌아갑니다. 이는 보정이 물이 없는 경우와 물이 있는 경우 기록된 LED 위치 간의 차이를 결정하는 것을 기반으로 하기 때문에 중요합니다.
  10. 'Collect calibration w. water' 버튼을 누릅니다. 다시 말하지만, 1.8단계에서와 같이 5개의 태그가 화면에 나타나며, 대부분의 경우 물 없이 보정하는 동안 얻은 태그와 약간 오프셋됩니다. 이 단계에서는 게인과 셔터를 다시 조정해야 할 수 있습니다. 태그가 LED 상단에 올바르게 배치될 때까지 반복합니다(그림 4, 오른쪽 패널 참조).
  11. 관찰실에서 조명을 켜고 게인과 셔터('카메라 제어' 아래)를 조정하여 이미지가 너무 밝지 않도록 합니다.
  12. 그림 5는 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 순차적으로 선택해야 하는 6개의 점을 보여줍니다. 점이 지정된 선에 있는지 확인하십시오: 1. 정면 전망 수위, 2. 평면도에서 컨테이너의 왼쪽 상단 능선, 3. 측면에서 전면 벽의 윤곽을 그리는 수직선. 선의 길이는 필수가 아닙니다. 위치 1과 2, 3과 4, 5와 6을 클릭하면 직선이 나타납니다(숫자는 실제로 화면에 나타나지 않음). '컨테이너 정보 수집'을 눌러 이 정보를 저장합니다.
  13. 사이드 미러와 LED 패널을 모두 제거하고 표시까지 물을 정확히 채웁니다. '녹화 시작'을 선택합니다. 새 창에서 지속 시간(분)을 묻습니다. 현재로서는 1분이면 충분합니다. OK를 누릅니다.
  14. 기록 후 기록 모듈을 종료하고 궤적 모듈을 연 다음 '데이터 위치'를 사용하여 보정 폴더(1.6단계에서 만든)를 선택합니다(파일을 로드하는 데 시간이 걸릴 수 있음). 이 폴더에는 보정 파일과 방금 기록된 데이터 파일이 들어 있습니다(1.13단계).
  15. '배경 가져오기' 버튼을 누릅니다. 새 창이 열리면 아무 것도 변경하지 않고 OK(확인)를 누릅니다. 관측 탱크의 (거꾸로) 이미지가 모니터에 나타날 때까지 기다립니다. 그런 다음 '배경 로드'를 누릅니다. 배경 그림이 수정됩니다. 상자 조정을 요청하는 새 창이 열립니다. 확인을 누르기만 하면 됩니다.
  16. 세 번째부터 일곱 번째 버튼을 순차적으로 누릅니다: '물 없이 서신 로드', '가상 카메라 보정', '굴절된 서신 로드', '컨테이너 형상 수집', '동물 컨테이너 정보 검색'. 이 마지막 단계는 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 화면에 세 개의 흰색 선(1.12단계에서 그린 선)이 나타나면 완료된 것입니다. "컨테이너 정보 저장" 버튼을 누릅니다.
  17. '볼륨 수집' 버튼을 누릅니다. 이제 그림 6과 같이 직육면체인 수역의 8개 모서리를 연속적으로 표시합니다. 모든 점에 대해 먼저 정면 뷰에서 클릭한 다음 맨 위 뷰에서 클릭합니다.
  18. 창의 왼쪽 모서리에서 '3D'를 선택합니다. 이제 바닥이 흰색인 상자의 윤곽을 보여주는 새 창이 열립니다(그림 15와 같지만 궤적은 없음). 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 상자 뷰의 회전과 변환을 선택합니다. 이미지가 나타나지 않거나 이미지가 직육면체의 이미지가 아닌 경우(즉, 1.17단계에서 모서리를 잘못된 순서로 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 경우) 다음을 수행합니다: 궤적 모듈을 닫지 않고 나가는 동안 Windows를 사용하여 보정 폴더(1.6단계에서 만든)로 이동하여 'Animal container data' 하위 폴더를 선택하고 TankVertices라는 파일을 삭제하고 1.17단계를 반복합니다.
  19. 축하합니다, 보정이 완료되었습니다. 이상적으로는 모든 것이 잘 작동하는지 확인하기 위해 더미 물고기로 테스트 실행을 수행해야 합니다. 좋은 소식은 미러 또는 카메라의 위치가 (약간만이라도) 변경되었거나 추적에 문제가 있는 경우에만 재보정을 수행해야 한다는 것입니다(섹션 3 참조).

2. 녹음

  1. 표시자까지 물을 채운 관찰 용기를 관찰실에 놓아 용기의 발이 올바른 정렬을 위해 제공된 구멍에 삽입되도록 합니다. 반투명 벽(또는 이 예에서는 흰색 벽 - 토론 참조)이 카메라에서 볼 때 먼 쪽과 오른쪽을 향하도록 컨테이너의 방향을 지정합니다.
  2. 칸의 조명을 켜고 (실험용 또는 더미) 물고기를 용기에 넣고 커튼을 닫습니다. 참고: 시스템은 여러 물고기를 기록할 수 있습니다(대표 결과 섹션 참조). 그러나 먼저 한 마리의 물고기를 기록하여 시스템에 대한 경험을 쌓는 것이 좋습니다.
  3. 레코드 모듈을 엽니다. 화면에 컨테이너의 전면 및 상단(거울) 이미지 이미지가 나타납니다. 이미지가 이상적이지 않을 수 있으며(예: 그림 7과 같이 과다 노출) 물고기와 배경 사이의 좋은 대비를 얻기 위해 조정해야 할 수도 있습니다(다음 세 단계).
  4. '카메라 제어'를 선택하고 열리는 '일반 설정' 창에서 '셔터'와 '게인'을 조정합니다(오른쪽의 해당 상자를 선택 취소한 후 그림 9 참조). 이미지가 과다 노출되지 않고 물고기와 배경 사이에 좋은 대비가 있도록 합니다.
  5. '카메라 제어' 창의 왼쪽에서 '화이트 밸런스/색상'을 선택하고 새 창에서 '자동' 상자를 선택 취소하고 빨간색과 파란색 값(그림 10 참조)을 조정하여 전면 및 상단 view에서 최상의 색상 대비를 얻습니다.
  6. 최상의 카메라 설정을 얻기 위해 색상 조정('화이트 밸런스/색상' 아래)과 게인 및 셔터 조정('일반 설정' 아래) 사이를 몇 번 전환해야 할 수도 있습니다. 어떠한 조정 없이 만족하더라도 '셔터', '게인' 및 '자동' 상자를 선택 취소하는 것이 중요하며(2.4 및 2.5 단계에서 설명), 그렇지 않으면 녹음이 진행되는 동안 배경이 변동하여 궤적을 추출할 수 없습니다. 다른 설정은 변경하지 마십시오. 완료되면 '카메라 제어' 창을 닫습니다.
  7. 기록 모듈의 메인 메뉴에서 '데이터 위치'를 선택하여 이전에 만든 폴더를 만들거나 엽니다. 모든 녹음(예: 물고기 또는 여울)에는 자체 폴더가 있으며, 이상적으로는 실험 폴더의 하위 폴더여야 합니다.
  8. '녹화 시작'을 누릅니다. 녹음 시간을 분 단위로 묻는 창이 열립니다(정수만 입력). '확인'을 누르면 실제 녹음 세션이 시작됩니다.
  9. 녹음이 완료되면 프로그램을 종료합니다. 다음 물고기를 기록하기 전에 컴퓨터를 다시 시작하는 것이 좋습니다. Windows에서 다시 시작 옵션을 사용하여 카메라 설정을 유지합니다(2.4 및 2.5단계). 녹화 사이에 컴퓨터를 다시 시작해야 하는 이유는 카메라 카드의 몇 가지 문제 때문입니다.
  10. 경로 재구성을 위해 궤적 모듈로 이동하기 전에 보정 폴더(이 프로토콜의 섹션 1에서 생성)의 'Animal container data' 및 'Correspondence data' 하위 폴더를 복사하여 기록 중에 생성된 모든 폴더에 붙여넣습니다. 이 후자의 폴더에는 '원시 데이터'와 '타임스탬프'라는 두 개의 다른 하위 폴더가 있습니다. 전자에는 JPEG 형식으로 기록된 모든 프레임이 포함됩니다. 후자에는 총 프레임 수와 프레임 사이의 간격(msec)에 대한 정보가 포함되어 있습니다.

3. 경로 재구성

  1. Trajectory Module을 열고 'Data location'을 눌러 Record Module로 생성된 폴더를 선택한 다음 'System Setup' 버튼을 눌러 'Parameters'를 엽니다(그림 11 참조).
  2. 위쪽 및 아래쪽 뷰 색상 임계값을 선택합니다. 좋은 시작 값은 1,000입니다. 이 값이 낮으면 소프트웨어가 노이즈를 기록할 가능성이 더 높습니다. 그러나 값이 너무 높으면 물고기가 감지 범위 아래에 있을 수 있습니다. 나중에(3.11 및 3.12단계) 색상 임계값을 다시 조정해야 할 수 있습니다. 또한 위쪽 및 아래쪽 색상 임계값은 동일하지 않아야 합니다.
  3. 위쪽 및 아래쪽 뷰 크기 임계값을 선택합니다. 중간 크기의 제브라피쉬는 10, 매우 큰 제브라피쉬는 20, 매우 작은 제브라피쉬는 5로 시작하는 것이 좋습니다. 크기 임계값이 높을수록 노이즈가 포착될 가능성이 줄어듭니다. 그러나 너무 높으면 소프트웨어도 물고기를 감지하지 못할 수 있습니다. 다시 3.11 및 3.12 단계에서 크기 임계값을 다시 조정해야 할 수 있습니다. 또한 위쪽 및 아래쪽 크기 임계값은 동일하지 않아야 합니다.
  4. 'Upper Size Threshold'의 경우 일반적으로 3,000 값이 좋으며 'Specific Length'의 경우 220(이미 사전 설정됨)으로 둡니다. '물고기의 수'는 관측 수조에 있는 물고기의 수를 나타냅니다. 'Max num of Points'는 총 프레임 수를 나타냅니다. 이 숫자 또는 약간 낮은 숫자를 기억(또는 기록)합니다(예: 45,703은 45,000으로 기억될 수 있음). OK를 누릅니다.
  5. 'Load correspondence w/o water', 'Calibrate virtual camera(s)' 및 'Load animal container info' 버튼을 순차적으로 누릅니다. 보정 하위 폴더 'Animal container data' 및 'Corresponding data'가 현재 실험 폴더에 복사되지 않은 경우 오류 메시지가 생성됩니다(2.10단계 참조). 그렇다면 지금 해당 하위 폴더를 복사하여 붙여넣고 버튼을 다시 누르십시오.
  6. '배경 가져오기' 버튼을 누릅니다. 새 창에서 'from' 및 'to'를 각각 기본값 0과 100으로 입력하도록 요청합니다. 100을 최대 프레임 수로 변경합니다(3.4단계에 제공된 예에서는 45,000으로 단순화할 수 있음). OK를 누릅니다.
  7. (왜곡된) 이미지가 나타날 때까지 기다립니다. 그런 다음 '배경 로드'를 누르면 올바른 배경 이미지가 설정됩니다. 이 배경 이미지에서 물고기가 보이지 않아야 합니다. 물고기가 보이면 다른 기록 세그먼트에서 더 나은 배경을 얻으십시오(예: 3.6단계에서 0-1,000, 1,000-2,000 등 시도).
  8. 녹음 세션 동안 물고기가 전혀 움직이지 않은 경우 배경을 얻을 수 있는 유일한 방법은 물고기를 제거하고 물고기 없이 동일한 '카메라 컨트롤' 설정(중요)으로 새로운 짧은 녹음을 하는 것입니다. 배경을 획득하고 'Background data' 하위 폴더를 현재 실험 폴더에 복사합니다. 이제 '배경 불러오기'를 누르고 '배경 가져오기'를 누르지 마십시오. 커튼을 열고 닫으면 배경이 다소 변경되는 경우가 많으므로 소음을 줄이기 위해 3.2 및 3.3 단계에서 임계값을 조정해야 할 수 있습니다. 3.11단계에서는 노이즈를 확인하는 방법을 보여줍니다.
  9. 배경을 로드한 후 그림 12와 같이 세 개의 빨간색 상자(마우스 사용)를 조정합니다. 상자는 소프트웨어가 물고기를 찾고 있는 영역을 표시합니다. 왼쪽의 상자를 닫습니다(즉, 선 또는 점으로 축소) 측면 보기는 보정에만 사용되기 때문입니다(1.7단계에서 설명).
  10. 'Start generating trajectories' 버튼을 누릅니다. 시작 프레임 번호를 묻는 창이 열립니다. 기본값 '0'으로 이동합니다. '확인'을 누르면 '태그 할당' 창이 열립니다(그림 13 참조). 태그('X0')가 화면에 나타날 때까지 '앞으로 단계'를 누릅니다. 태그가 물고기 이미지에 배치되지 않은 경우 올바르게 배치될 때까지 '아니오'를 누릅니다. 그런 다음 '이동'을 누릅니다. 올바르게 할당되지 않은 경우 (또는 전혀) 어쨌든 '이동'을 누르고 문제를 찾으십시오 (다음 단계).
  11. 경로 재구성이 시작됩니다. 이상적으로는 태그가 항상(또는 적어도 대부분의 경우) 물고기의 이미지에 배치되어야 합니다. 자주 잘못 배치된 경우 '정보' 창(비디오 화면 위의 두 번째 선택)을 엽니다. 그림 14A는 물고기의 윤곽만 보이는 이상적인 경우를 보여줍니다. 그림 14B는 올바른 태그 할당을 방해하는 과도한 노이즈의 경우를 보여줍니다. 노이즈 없이 물고기의 선명한 이미지가 보이지만(그림 14A와 같이) 태그가 올바르게 할당되지 않거나 거의 할당되지 않는 경우 가장 가능성이 높은 이유는 보정이 꺼져 있기 때문입니다. 경로 재구성을 재보정하고 다시 실행합니다. 캘리브레이션 중에 미러와 카메라가 움직이지 않으면 이전에 수행된 녹화에 새 캘리브레이션 데이터를 사용할 수 있습니다.
  12. 과도한 노이즈의 경우(그림 14B 참조) 메인 메뉴에서 '중지'를 누르고 새 색상 및 크기 임계값을 선택합니다(3.2 및 3.3 단계). 또한 빨간색 상자 (3.9 단계)를 약간 줄일 수 있는지 확인하십시오 (예 : 상단의 물 움직임으로 인해 발생하는 소음을 제외하기 위해). 때때로 프로그램이 '멈춤'(태그가 전혀 할당되지 않은 경우)이 있음을 유의하십시오: 이 경우 프로그램을 다시 시작하십시오.
  13. 3D 화면에서 궤적을 확인합니다(화면 위의 세 번째 선택). 그림 15. 궤적의 예를 나타냅니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 3D 구성의 회전과 변환 사이를 선택합니다.
  14. 궤적이 완료되면 '저장' 버튼(궤적을 삭제하는 'Stop'이 아닙니다!), 'Trajectory clean-up' 및 'Trajectory smoothing' 버튼을 순차적으로 누릅니다. 평활화를 위한 필터 매개변수를 보여주는 새 창이 열립니다(그림 16). 시스템에 대한 더 많은 경험을 쌓기 전에 기본값을 변경하지 마십시오. '확인'을 누릅니다.
  15. 지금쯤이면 녹화하기 전에(2.4-2.6 단계 참조) 좋은 카메라 설정(물고기와 배경 간의 대비가 좋음)을 선택하는 것이 왜 그렇게 중요한지 분명해졌을 것입니다. 데이터 처리를 진행합니다.

4. 데이터 처리

  1. 먼저 물고기를 기록하는 데 사용된 폴더를 살펴보십시오(그림 17). 여기에는 보정 폴더(2.10단계)에서 복사된 'Animal container data' 및 'Correspondence data' 하위 폴더, 물고기를 기록하는 동안 생성된 'Time stamps' 및 'Raw data' 하위 폴더, 경로 재구성 중에 생성된 'Background data' 및 'Trajectories' 하위 폴더가 포함됩니다.
  2. 그림 17은 'Trajectories' 하위 폴더에 세 개의 파일이 포함되어 있음을 보여 줍니다. point.smoothed 파일은 추가 데이터 처리에 사용할 파일입니다. 여러 물고기 기록(예: 떼를 짓는 실험)의 경우 모든 물고기에 대해 별도의 point.smoothed-file이 생성됩니다.
  3. 그림 18은 point.smoothed-file 예제의 상단 부분을 보여줍니다. 첫 번째 줄은 샘플 또는 프레임의 총 수를 제공하고, 두 번째 줄은 녹화 시간(분)을 제공하고, 세 번째 줄은 카메라를 기준으로 수역 중심의 좌표(시퀀스: x, z, y)를 제공합니다. 그 다음에는 물고기의 x, y, z 좌표(mm)와 해당 샘플의 지속 시간(초)을 제공하는 모든 프레임에 대해 하나의 선이 옵니다.
  4. point.smoothed 파일에 제공된 데이터를 처리하는 방법에는 두 가지가 있습니다: 데이터 처리 모듈을 사용하거나 Excel 또는 MATLAB과 같은 다른 소프트웨어를 사용하여 데이터 처리 모듈에 (아직) 통합되지 않은 계산을 수행합니다.
  5. 데이터 처리 모듈을 열고 도구 모음에서 '프로젝트'를 선택한 다음 풀다운 메뉴에서 '새로 만들기'를 선택하고 실험 이름을 입력합니다. 도구 모음에서 '프로젝트 편집'을 선택하고 풀다운 메뉴에서 '프로젝트에 추가'를 선택한 다음 '새 그룹'을 선택하고 그룹 이름(예: '컨트롤')을 입력합니다. 현재로서는 프로젝트 및 그룹 이름이 실제로 사용되지 않지만 이름을 채워야 합니다. 생성된 폴더는 출력 파일을 저장하는 데 사용할 수 있습니다(4.10단계 참조).
  6. 오른쪽 창에서 그룹(예: '컨트롤')을 선택합니다(그림 19 참조). 도구 모음이 변경됩니다. '그룹 편집'을 선택한 다음 풀다운 메뉴에서 '그룹에 추가'를 선택한 다음 '새 측정'을 선택합니다. 그러면 브라우저가 열립니다. 기록하는 동안 만들어진 폴더를 열고(2.7단계) 'trajectories' 하위 폴더를 선택한 다음 point.smoothed-file을 선택합니다. 그림 19에 제시된 예에서 Group-A의 경우 6개의 파일이 로드되었고 Group-B의 경우 4개의 파일이 로드되었습니다. (그림에 표시된 예에서 평활화된 파일의 확장자는 0과 1입니다. 이 실험에서 두 개의 금붕어가 동시에 테스트되었기 때문입니다.)
  7. 분석을 위해 오른쪽 창에서 포인트 스무딩된 파일을 선택하고, '데이터 처리'를 선택하고, 풀다운 메뉴에서 '단일 엔드포인트'를 선택하고, 예를 들어 '동결 기간'을 선택합니다(그림 20). 속도 임계값 및 지속 시간 임계값 측면에서 동결을 지정하는 창이 열립니다. 이 예에서 물고기는 관찰 시간의 25.86%를 얼어붙는 데 소비합니다.
  8. 프로그램에 익숙해지려면 Travel distance, Depth Distribution(깊이 수준 수를 결정할 수 있음) 및 Burst frequency(버스트 빈도)와 같은 다른 예제를 시도해 보십시오.
  9. 예를 들어 가속도의 z 구성 요소에 대한 스펙트럼 분석과 같은 고급 계산이 있습니다. 이 경우 '시계열 기능'을 선택한 다음 'TD 주파수 영역 분석', '스펙트럼 분석' 및 'Z 가속 스펙트럼'을 선택합니다. 표시된 매개변수에 대해 푸리에 분석이 수행됩니다(설명7). 메뉴에 표시되는 모든 옵션이 아직 완전히 구현된 것은 아닙니다. 예를 들어, 'Path tortuosity'는 실험적으로만 추가되었습니다.
  10. '기본 임계값을 사용한 일괄 처리' 옵션을 선택하면 약 200개의 엔드포인트가 계산됩니다. 이 컨텍스트에서 'default'는 구분 기호가 설정되었음을 의미합니다. 예를 들어, 현재 깊이 분포는 3개의 깊이 레벨에 대해 계산되고, 각도 분포는 4개의 섹션(즉, 사분면) 등에 대해 계산됩니다. 매개변수를 생성하면 생성할 파일의 위치와 이름을 묻는 새 창이 열립니다. 이는 CSV 형식으로 저장되며 추가 처리를 위해 Excel과 같은 다른 소프트웨어로 가져올 수 있습니다.
  11. 기록 모듈 및 궤적 모듈과 달리 데이터 처리 모듈은 연구원의 요구 사항에 더욱 맞게 조정될 진화하는 모듈입니다.

결과

종류가 지정되지 않은('short-fin') 야생형 계통의 6개월 된 암컷 제브라피시(Danio rerio)를 Aquatica Tropicals, Inc.에서 구입하였습니다. 총 120마리의 제브라피시가 사용되었습니다. 실험 시작 전, 이들을 38 L 수조에서 약 8주 동안 실험실 조건에 적응시켰습니다. 수온은 실온(~23° C)과 동일하게 유지하였습니다. 광주기 regimen은 14시간 명기(6:00-20:00), 10시간 암기로 설정하였습니다. 제브라피시에게는 하루 세 번 먹이를 급여하였습니다: 8:00 Tetra tropical flakes, 12:00 살아있는 브라인 쉬림프 유생, 15:00 Tetra tropical flakes. 실험 당일에는 8:00에 flakes만 급여하였습니다. 두 번째 기록 직후, 제브라피시를 300 mg/L tricaine methanesulfate (MS-222)로 안락사시켰습니다.

대조군으로는 14쌍의 4마리 묶음(i.e. 제브라피시 4마리로 구성된 그룹)이 사용되었으며(n = 14), MK-801 군으로는 16쌍의 4마리 묶음(n = 16)이 사용되었습니다. 1 L 용기에서 10 µM MK-801에 1시간 동안 노출시킨 후(9:30 시작), 4마리 묶음들을 관찰 용기로 옮겼습니다. 기록은 즉시(10:30) 시작되었으며 20분 동안 지속되었습니다. 이후, 제브라피시를 용기 속에 3.5시간 동안 그대로 두었습니다. 이 기간 동안 공기 펌프에 연결된 튜브를 통해 폭기를 제공했습니다. 14:00에 두 번째 20분 기록을 수행했습니다. 두 번의 기록 목적은 습관화의 영향 및/또는 약물의 효과 감소를 연구하는 것이었습니다(쥐에서 MK-801의 반감기는 약 2시간입니다28). 우리는 (1) 사회적 응집력의 척도로서 평균 사회적 거리(개체 간 거리11,29라고도 함), (2) 10개 깊이 수준에 따른 수직 분포, (3) 4개 방사형 구역(구역 위치는 Figure 24A 삽입 그림 참조) 및 사분면(사분면 위치는 Figure 24B 삽입 그림 참조)에 따른 수평 분포, (4) 이동 거리의 세 성분(x, y, z)을 분석했습니다. 데이터는 무리당 평균을 내었습니다. Shapiro-Wilkins 검사 결과 모든 변수가 정규 분포를 따르지 않는 것으로 나타났으므로, 대조군과 MK-801 군의 평균을 비교하기 위해 모든 변수에 대해 Mann-Whitney U-test를 적용했습니다. 이러한 비교는 오전 세션과 오후 세션에 대해 각각 별도로 수행되었습니다. 4가지(그룹의) 변수가 사용되었으므로 α = 0.05/4 = 0.0125로 설정했습니다(위 내용 참조).

그림 2A 대조군 제브라피시와 ...의 전형적인 예시 프레임을 보여줍니다. 그림 2B MK-801로 처리된 제브라피쉬의 전형적인 예시 프레임을 보여주며, 두 영상 모두 오전 세션 동안 기록되었습니다. 대조군 제브라피쉬가 바닥면과 전면 벽에 가깝게 위치해 있음에 유의하십시오.즉카메라와 가장 가까운 쪽) 및 서로 밀접하게 유지되었습니다 (즉사회적 응집력이 높았다). 이와 대조적으로, MK-801을 처리한 제브라피시는 수면 근처에 머물렀으며, 수평면에서 어떠한 선호도 보이지 않았고 서로 상당한 거리를 두고 헤엄쳤다(즉 사회적 응집력이 낮았다)그림 21 대표적인 궤적을 보여줍니다. 대조군 제브라피시는 관찰 용기의 앞쪽에 머무르는 분명한 경향을 보였습니다. 또한, 대부분의 시간 동안 바닥 근처에 머물렀습니다. 반면, MK801을 처리한 제브라피시는 수평면 상의 어느 곳에서나 헤엄쳤습니다. 하지만 이들은 10시 30분에 상층부 수심을 뚜렷하게 선호했습니다. 14시에는 수직 분포가 더 균일해졌습니다.

데이터의 정량적 분석을 통해 우리의 기술 내용을 확인하였다. 그림 22A는 오전(10:30) 동안 MK-801 제브라피시의 평균 사회적 거리(i.e. 4마리로 구성된 한 그룹 내 제브라피시 간의 평균 개체 간 거리)가 대조군 제브라피시보다 3배 이상 컸음을 보여주며, 이때 U = 0, p<0.00001이었다. 3.5시간의 순화 과정 후(14:00), 대조군 제브라피시의 사회적 거리는 증가한 반면, MK-801 제브라피시에서는 거의 변하지 않고 유지되었다. 하지만 두 그룹 간의 차이는 여전히 유의미했다(U = 19, p<0.0005). 그림 22B는 10:30과 14:00 두 시점에서 두 실험군의 사회적 거리 타임라인을 보여준다.

수직 분포 또한 두 그룹 간에 매우 달랐습니다. 그림 23을 보면 오전(10:30)과 오후(14:00) 모두에서 대조군 제브라피시는 대부분의 시간을 가장 낮은 2~3개 깊이 수준(즉, 관찰 용기 바닥에 가장 가까운 수준)에서 보냈음을 알 수 있습니다. 반면, MK-801 제브라피시는 10:30에 대부분의 시간을 수면 가까이에서 헤엄치며 보냈습니다(그림 23A). 3.5 hr의 적응 기간 후인 14:00에는 모든 깊이 수준에 걸쳐 거의 균등하게 분포되었습니다.

수평 분포 또한 두 실험군 모두에서 매우 다르게 나타났습니다. 그림 24A MK-801을 투여한 제브라피쉬가 대조군 제브라피쉬보다 외곽 구역에서 보내는 시간은 더 적고, 중간 및 중앙 구역에서 보내는 시간은 더 많음을 알 수 있습니다. 사분면과 관련하여 그룹 간의 차이는 더욱 분명하게 나타났습니다.그림 24B). 대조군 제브라피시는 앞쪽의 두 사분면(1번 및 4번)에 매우 강한 선호도를 보였습니다. 즉용기의 카메라와 가장 가까운 쪽입니다. 반면, MK-801 제브라피쉬는 네 개의 사분면에 거의 균등하게 분포되어 있었습니다.

운동학적 매개변수와 관련하여, 여기서는 이동 거리(그림 25)에 대해서만 논의하겠습니다. MK-801 처리 제브라피쉬는 대조군 제브라피쉬보다 더 많이 이동했습니다. 흥미롭게도, 이러한 차이는 이동 거리의 y-성분에서 특히 유의미하게 나타났습니다. 이는 카메라가 향하고 있는 방향입니다( 그림 1 참조). 실제로 대조군 제브라피쉬는 대부분의 시간 동안 1사분면과 4사분면의 앞쪽 벽 근처에 머물렀습니다(그림 24A 및 24B에서 확인할 수 있음). 반면, MK-801 처리 제브라피쉬는 용기의 앞쪽 절반과 뒤쪽 절반 사이를 앞뒤로 움직였습니다.

여기서는 실험에서 제공된 데이터를 분석할 수 있는 가능한 방법들의 일부만을 제시하였습니다. 이 단계에서는 결과에 대해 구체적인 생물학적 해석을 덧붙이는 것을 지양합니다. 하지만 MK-801이 쥐에서 사회적 위축30을 유도하고 사회적 탐색 행동을 감소시키는31 것으로 밝혀졌으며, 조현병의 음성 증상 모델30로 연구되어 왔다는 점은 언급할 가치가 있습니다. 또한 MK-801은 포유류에서 과잉 행동31, 회전 행동32, 감각 손상33 및 전자극 억제 감소34를 유발했습니다. 비록 우리가 이러한 손상 여부를 구체적으로 테스트하지는 않았지만, 우리의 연구 결과는 이와 일치하는 것으로 보입니다. 제브라피쉬에서 나타난 MK-801의 효과가 포유류에서 기술된 효과와 유사한지 결정하기 위해서는 더 구체적인 실험 설정이 필요합니다. 또한 불안, 호흡 문제, 공간적 방향 감각 상실, 주의력 결핍, 상동 행동 등이 MK-801에 의해 유도된 제브라피쉬의 행동 변화에 중요한 역할을 했는지 판단하기 위해 추가적인 분석과 실험이 필요할 것입니다.

카메라, 컴퓨터, 큐브 및 거울이 포함된 광학 측정 설정 도식; 광학 연구.
그림 1. 장치 개략도. 카메라는 관찰 탱크의 정면 뷰와 상단 뷰를 모두 보여주는 프레임(i.e. 정지 이미지)을 캡처합니다. 캡처된 프레임은 추가 처리를 위해 컴퓨터에 저장됩니다. 제브라피시의 이동 및 위치의 3D 특성을 설명하는 데 중요한 xyz-차원의 위치를 확인하십시오. 그림에서 음영 처리된 두 벽면(및 탱크 바닥)은 본 실험(대표 결과 참조)에서 흰색으로 칠해졌으며, 나머지 두 벽면은 투명했습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

어류 수조 행동 실험, 물고기 분포가 있는 두 개의 수조, 행동 연구 설정.
그림 2. 예시 프레임. 정면도 또는 평면도만으로는 정보 손실이 발생한다는 점에 유의하십시오. 이는 패널 B에서 특히 분명하게 나타나는데, 정면도에서는 왼쪽의 제브라피시 세 마리가 서로 밀접하게 붙어 있는 것처럼 보이지만 평면도에서는 그렇지 않음을 알 수 있습니다. 반면, 평면도는 바닥으로부터의 거리에 대한 어떠한 정보도 제공하지 않습니다. A) 대조군 제브라피시. B) 10 µM MK-801을 처리한 제브라피시. 배경색(파란색)은 녹화 소프트웨어에 의해 생성되었으며, 좋은 대비를 얻기 위해 선택되었습니다. 실제 뒷벽과 오른쪽 벽, 그리고 바닥의 색상은 흰색이었습니다. 더 큰 이미지로 보려면 여기를 클릭하십시오.

수생 동물 행동 추적 시스템; 비디오 분석 설정; 보정 패널; 모니터링 과정.
그림 3. 사이드 미러의 정렬. 왼쪽의 흰색 화살표는 사이드 미러에 비친 전면 벽(카메라와 가장 가까운 쪽)을 나타냅니다. 두 개의 선이 보인다면, 하나의 선만 보일 때까지 사이드 미러의 위치를 조정하십시오(단계 1.2). 보정 패널의 5개 LED가 세 가지 뷰 모두에서 명확하게 보입니다. 챔버 내의 조명이 켜져 있어 LED 패널에 많은 다른 반사광이 보인다는 점에 유의하십시오(단계 1.4). 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

입자 검출 과정, 빨간색 표시 상자, 광학 분석 도식, 저조도 조건.
그림 4. LED 태깅. 왼쪽 패널은 보정 절차를 통해 식별된 5개의 태그(0-4번으로 표시)가 실제 LED와 일치하지 않음을 보여줍니다. LED 외에도 다른 빛 지점(실제로는 반사광)이 관찰됩니다. 오른쪽 패널에서는 게인(gain)과 셔터를 줄여 LED만 보이게 했습니다. 이제 5개의 태그가 정확하게 할당되었습니다(단계 1.7-1.10에 설명된 내용 참조). 더 큰 이미지로 보려면 여기를 클릭하십시오.

카메라 제어 및 캘리브레이션 설정을 보여주는 수생 동물 행동 추적 소프트웨어 인터페이스.
그림 5. 용기 정보 수집. 선택해야 할 6개 지점의 순서(마우스 오른쪽 버튼 클릭으로 선택)가 제시되어 있습니다. 선은 자동으로 그려집니다. 여기에 표시된 숫자는 화면에 나타나지 않는다는 점에 유의하십시오. 완료되면 (단계 1.12에서 설명한 대로) 'Collect container info'를 누르십시오. 여기をクリック하여 더 큰 이미지 보기.

유체역학 실험 도식; 유체 역학 및 부력 탱크 설정; 주석이 표시된 구성 요소.
그림 6. 부피 수집. 수역의 모서리를 나타내는 표시된 위치에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하십시오. 먼저 정면도에서 모서리를 표시한 다음 평면도에서 표시하십시오. 그 후 다음 모서리(1-8번 순)로 이동하십시오. 8개의 지점은 탱크가 아니라 수역의 외곽선을 표시한다는 점에 유의하십시오. 또한 마우스 오른쪽 버튼을 클릭할 때 'x0'만 나타나며, 다음 지점을 클릭하면 다시 사라집니다(따라서 1-8번의 숫자는 실제로 화면에 나타나지 않습니다). 해당 절차는 단계 1.17에 설명되어 있습니다. 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

카메라 제어 장치를 통한 수중 탱크 내 동물의 움직임을 모니터링하는 수생 동물 행동 추적 설정.
그림 7. 보정되지 않은 대비. 이미지가 과노출되었으며 물고기와 배경 사이의 대비(특히 정면 뷰에서)가 낮음. 여기를 클릭하여 확대 이미지 보기.

정적 평형 연구에 사용된 물고기가 포함된 수중 설정; 유체 역학 실험.

그림 8. 보정된 대비. 그림 7과 비교하여 대비가 개선되었습니다. 화면의 색상은 가색(false colors)임에 유의하십시오. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Bumblebee2 BB2-03S2C의 카메라 설정 인터페이스로, 밝기, 노출 및 채도 조정 화면을 보여줌.
그림 9. 일반 설정. 메인 메뉴에서 'Camera control'을 선택하면 'General Settings' 창이 열립니다. 'Shutter'와 'Gain' 체크박스를 해제하고 슬라이더를 사용하여 물고기와 배경 사이의 최적의 대비를 찾으십시오. 여기에서 더 큰 이미지 보기.

카메라 화이트 밸런스 조정 GUI; 적색/청색 슬라이더; 이미지 처리 최적화.
그림 10. 색상 설정. 'White Balance/Color' 창에서 'Auto' 확인란을 선택 해제하고 'Red' 및 'Blue' 슬라이더를 사용하여 물고기와 배경 사이의 최적의 대비를 위한 조합을 찾습니다. 매개변수(Parameters). Trajectory Module을 연 후, 'Data location'에서 실험 파일을 선택하고 'System Setup'을 통해 'Parameters' 창을 엽니다. 여기에 매개변수에 대한 적절한 초기값이 할당되어 있습니다. 여기에서 더 큰 이미지 보기.

수생 동물 행동 추적 소프트웨어 인터페이스; 보정 파라미터; 비디오 분석 설정.
그림 11. 파라미터. Trajectory Module을 연 후, ‘Data location’에서 실험 파일을 선택하고 ‘System Setup’을 통해 ‘Parameters’ 창을 엽니다. 여기에는 적절한 초기 파라미터 값들이 설정되어 있습니다. .더 큰 이미지로 보려면 여기를 클릭하십시오.

수생 행동 추적 설정, 3D 시스템 보정, 소프트웨어 인터페이스, 궤적 분석.
그림 12. 박스 정렬. 상단 뷰와 정면 뷰의 빨간색 박스가 물고기가 발견될 수 있는 영역을 정의하는 방식을 확인하십시오. 왼쪽의 박스는 이 영역을 검색 대상에서 제외하기 위해 선으로 축소되었습니다. 여기에서 더 큰 이미지 보기.

행동 분석을 위한 보정 및 모니터링 설정이 표시된 수생 동물 추적 소프트웨어 인터페이스.

그림 13. 태그 할당. 'Start generating trajectories' 버튼을 누르고 시작 프레임(보통 프레임 #0)을 선택하면 'Tag assignments' 창이 열립니다. 태그('X0')가 화면에 나타날 때까지 'Step forward'를 누릅니다. 태그가 물고기 이미지 위에 놓여 있지 않은 경우, 올바르게 배치될 때까지 'No'를 누릅니다. 그런 다음 'Go'를 누릅니다. 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

힘 벡터, 응력 집중이 포함된 동적 분석 다이어그램; 구성 요소 A, B 표시.
그림 14. 정보 화면. 패널 (A)는 올바른 태그 할당을 보여줍니다. 태그('X0')가 두 뷰의 물고기 이미지에 배치되어 있습니다. 일반적으로 선이 태그를 통과합니다. 패널 (B)는 과도한 노이즈와 태그 할당의 부재를 보여줍니다. 프레임은 동일한 기록에서 각각 1,000-50 및 10-5로 색상 및 크기 임계값(단계 2.2)을 변경하여 획득되었습니다. 여기에서 더 큰 이미지 보기.

3D 궤적 분석, 데카르트 좌표계에서의 입자 이동을 나타내는 벡터 다이어그램.
그림 15. 재구성된 경로의 3D 표현. 방향 확인을 위해 화살표의 원점을 수조의 왼쪽 앞 모서리에 위치시켰습니다 (그림 1 참조). 따라서 이 예시에서 물고기는 (카메라 기준으로) 왼쪽 벽 가까이에 머물고 있습니다. 여기에서 더 큰 이미지 보기.

궤적 평활화를 위한 파라미터 설정 창; 필터 설정: 노이즈 임계값, 윈도우 크기.
그림 16. 궤적 평활화. 'Trajectory smoothing' 버튼을 누르면 이 창이 열립니다. 현재로서는 'OK'를 눌러 기본값을 수락하십시오. 여기에서 더 큰 이미지 보기.

"fish1" 폴더에서 "Trajectories" 하위 폴더로의 데이터 전송을 보여주는 파일 정리 다이어그램.
그림 17. 하위 폴더. 기록 중에 생성된 폴더가 위에 표시되어 있습니다. 경로 재구성 후에는 표시된 6개의 하위 폴더가 포함됩니다. 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

통계 분석을 위한 텍스트 형식의 수치 데이터.
그림 18. Smoothing 처리된 파일. 예시 point.smoothed-file의 상단 부분이 표시되어 있으며, 프레임 수, 녹화 시간(min 단위), 카메라 기준 수체 중심의 좌표, 그리고 모든 프레임에 대한 좌표와 지속 시간이 나타나 있습니다. 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

궤적 데이터 분석을 위한 데이터 처리 소프트웨어 인터페이스; 프로젝트 설정 및 그룹 할당.
그림 19. 데이터 처리. 분석할 파일 선택(오른쪽 창). 여기에서 더 큰 이미지 보기.

궤적 평가를 위한 동결 분석 설정이 표시된 ABMT 3D 데이터 처리 인터페이스.
그림 20. 분석 예시. 관심 있는 엔드포인트는 메뉴에서 선택하여 계산할 수 있습니다. 이 예시에서는 'Duration Freezing'이 선택되었습니다. 프로그램은 동결을 정의하는 속도 및 지속 시간 임계값을 입력하도록 요청합니다. 결과는 전체 기록 시간의 백분율로 표시됩니다. 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

이동 분석 도표, 대조군 및 MK-801 투여 마우스의 시간 간격별 추적 경로.
그림 21. 대표 궤적. 10:30에 시작된 오전 세션(상단 행)과 14:00에 시작된 오후 세션(하단 행)에 대해, 대조군 제브라피시의 대표 궤적 2개와 10 µM MK-801을 처리한 제브라피시의 대표 궤적 2개가 제시되어 있다. 각 4개조의 개별 제브라피시 궤적은 서로 다른 색상으로 표시되었다. 다만, 태그 스와핑(tag swapping)이 발생했을 수 있음에 유의하라. 개별 선을 추적하는 것이 매우 중요한 경우에는 수동 교정이 필요하다. 묘사된 용기의 왼쪽 전면(삽입 화살표의 시작점)은 카메라와 가장 가까운 쪽이다(수조의 배치는 그림 1 참조). 더 큰 이미지로 보려면 여기를 클릭하십시오.

사회적 거리 분석; 그래프; 대조군 vs. MK-801 효과; 세션별 비교 결과; 시계열.
그림 22. 물고기 간의 평균 사회적 거리. A) 대조군 제브라피쉬와 10 µM MK-801을 처리한 제브라피쉬의 오전 및 오후 세션 평균 사회적 거리를 나타낸다. 평균값과 S.E.M.으로 표시되었다. ***, p<0.001. B) 두 그룹의 평균 개체 간 거리의 시간 흐름을 나타낸다. 더 큰 이미지 보기 위해 여기를 클릭하십시오.

깊이 분석; 다변량 그래프; 대조군 대 MK-801 비교; 깊이 단계별 시간 백분율.
그림 23. 깊이 분포. A) 오전 세션 동안 10개의 동일한 깊이 단계(단계 1이 바닥과 가장 가까운 단계임)에 따른 제브라피쉬의 분포. B) 오후 세션 동안의 제브라피쉬 분포. 평균 및 S.E.M.이 표시됨. *, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. 더 큰 이미지 보려면 여기를 클릭하십시오.

Radial zone and quadrant time proportion graph; data analysis; psychological experiment results.
그림 24. 수평 분포. (A) 실험군의 4개 방사형 구역에 따른 시간적 분포를 나타낸다. 삽입도는 중심부에서 주변부까지의 구역 위치를 보여준다: 중심 구역, 중간 구역, 외부 구역 및 결합 모서리 구역. (B실험군의 네 가지 사분면에 대한 시간적 분포가 제시되어 있다. 삽입도는 사분면의 위치를 나타낸다. 이중선으로 표시된 벽은 흰색 벽을 나타내며, 단일선으로 표시된 벽은 투명한 벽을 나타낸다. 카메라는 삽입도의 왼쪽에 위치한다. 즉1사분면 및 4사분면과 가장 가까운 (다음 또한 참조: 그림 1). 평균 및 표준오차(S.E.M.)로 표시하였다. 검은색 별표는 오전 세션 그룹 간의 비교를, 회색 별표는 오후 세션 그룹 간의 비교를 나타낸다: *, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

정적 평형 그래프; 이동 거리 대 좌표; 대조군 대 MK-801; 데이터 분석.
그림 25. 이동 거리. 오전 및 오후 세션 동안 제브라피시의 이동 거리 xyz-성분이 표시되어 있습니다. 평균과 S.E.M.이 제시되었습니다. 검은색 별표는 오전 세션의 그룹 간 비교를, 회색 별표는 오후 세션의 그룹 간 비교를 나타냅니다: *, p<0.0125; ***, p<0.001. 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

토론

여기에 표시된 실험 절차를 통해 개별 제브라피쉬, 제브라피쉬 쌍(예: 짝짓기 또는 공격성을 연구하기 위해) 및 제브라피쉬 떼(대표적인 예에 표시된 대로)를 기록할 수 있습니다. 이 시스템은 3D(수직 및 수평) 분포, 운동학적 특성(예: 속도, 가속도, 회전 각도) 및 사회적 매개변수(예: 사회적 응집력)에 대한 정보를 동시에 얻는 데 특히 적합합니다. 다음에는 실험을 계획할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 문제가 나열되어 있습니다.

실험 절차에 따라 다양한 행동 시스템을 연구할 수 있습니다. 예를 들어, 신공포증(즉, 새로운 환경에 대한 두려움)을 탐색하려면 사전 습관화 없이 제브라피시를 관찰 탱크에 도입한 직후(물이 가라앉아 소음이 줄어들 때까지 몇 초만 기다린 후) 녹음을 시작해야 합니다11,17,37. 반면에 일부 연구 주제는 예를 들어 경보 페로몬의 효과를 연구할 때 제브라피쉬가 잘 습관화되어야 할 수도 있습니다16. 제브라피쉬 그룹을 연구할 때 실험자는 소프트웨어가 태그 전환을 최소화하지만 현재로서는 개별 제브라피쉬를 전체적으로 따라가는 것이 불가능하다는 점을 알고 있어야 합니다. 이것은 사회적 결속에 중점을 두는 떼 연구에도 중요하지 않지만 공격성이나 짝짓기를 탐구할 때는 중요합니다. 태그를 수동으로 재할당하는 것은 옵션이지만 시간이 많이 걸릴 수 있습니다.

관찰 용기와 관찰실의 벽 색상은 제브라피쉬의 행동에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 흰 벽은 혐오 반응을 유도하는 것으로 설명되었습니다36, 37. 다른 색상을 시도할 때 두 가지 사항을 염두에 두십시오: 1) 전면 벽(즉, 카메라에 가장 가까운 벽)이 투명하게 유지되고 뚜껑(사용하는 경우)도 투명해야 합니다. 2) 이전에 사용한 적이 없는 색상을 선택할 때 먼저 제브라피쉬와 배경의 대비가 녹화에 적합한지 여부를 결정합니다. 테스트 실행을 수행합니다. 녹화를 위한 카메라 설정(2.5 및 2.6단계에서 설명한 대로 게인, 셔터, 빨간색 및 파란색)과 궤적 재구성 설정(예: 3.3, 3.5, 3.11 및 3.12단계에서 설명한 대로 색상 및 크기 임계값)을 변경하면 큰 차이를 만들 수 있습니다. 다시 말하지만, 시스템에 대한 경험은 무엇이 가능한지 결정하는 데 큰 도움이 될 것입니다.

실험의 목적에 따라 다양한 특성(예: 스펙트럼, 강도)을 가진 광원이 바람직할 수 있습니다. LED 막대는 쉽게 교체할 수 있습니다. 빛이 용기의 모든 부분에 닿는지 확인하십시오.

실험에서 제브라피쉬가 관찰 용기에 몇 시간 동안 남아 있어야 하는 경우 통기해야 합니다. 클립을 사용하여 오른쪽 뒤쪽 모서리에 에어 튜브를 부착할 수 있습니다. 컴퓨터 화면에서 클립이 녹음을 방해하지 않는지 확인하십시오. 제브라피쉬는 결코 시야에서 숨겨져 있지 않다는 것입니다. 그림 2A 및 2B 에서 검은색 클립은 상단 보기에서 볼 수 있습니다. 이상적으로는 녹음 전이나 녹음 사이에 통풍이 제공되어야 하지만 소음을 방지하기 위해 녹음 중에는 제공되지 않아야 합니다. 또한 강한 통기를 켜거나 끄면 제브라피쉬가 놀랄 수 있습니다.

실험을 위해 제브라피쉬를 밤새 용기에 보관해야 하는 경우 제브라피시가 튀어나오는 것을 방지하기 위해 관찰실을 투명한 뚜껑으로 덮는 것이 유용합니다(이는 매우 흔한 일입니다). 녹화 전에 덮개를 제거하지 않은 경우(제브라피시를 방해하지 않도록) 다음 두 가지 사항을 고려하십시오: 1) 광원의 거울 이미지가 녹화를 방해하지 않는지 확인하십시오(예 : 광원을 이동하거나 빛을 최소한으로만 반사하는 뚜껑을 선택함). 2) 특히 이 경우 통기도 제공되어야 하기 때문에 밤새 사용하면 뚜껑에 김이 서리게 될 수 있음을 고려하십시오. 이를 줄이는 한 가지 방법은 작은 구멍이 있는 뚜껑을 선택하는 것입니다.

일부 실험의 경우 약물을 투여하기 전에 제브라피쉬의 기본 행동을 결정하는 것이 필수적일 수 있습니다. 이 경우 튜브(위에서 설명한 폭기 튜브와 유사)를 통해 세션 사이에 약물을 추가할 수 있습니다.

여기서는 제브라피쉬(Danio rerio)를 기록하는 데 중점을 두었지만 물론 다른 어종도 시스템으로 기록할 수 있습니다. (어린) 금붕어(Carassius auratus), 호랑이 미늘(Barbus tetrazona) 및 녹색 검꼬리(Xiphophorus helleri)의 행동을 연구하는 데 사용되었습니다.

마지막으로, 관측 탱크의 다른 차원은 주로 가능하다는 점에 유의해야 합니다. 그러나 훨씬 더 큰 관측 컨테이너를 사용할 때 시스템을 재구성하고 공간 해상도와 시간 해상도 사이의 적절한 균형을 찾아야 합니다. 또한 컨테이너의 모양은 직육면체여야 합니다. 제브라피쉬 또는 기타 실험 대상의 수는 이론적으로 무제한입니다. 그러나 태그 교환은 주제 수에 따라 증가합니다.

공개 사항

Hans Maaswinkel, Liqun Zhu 및 Wei Weng은 이 기사에 사용된 추적 시스템을 생산하는 뉴욕 론콘코마에 있는 xyZfish의 직원입니다.

감사의 글

저자는 인정하지 않습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AABT-3D 추적 하드웨어xyZfishAABT II카메라, 비디오 카드, 거울과 조명이 있는 관찰실
AABT-3D 보정 장비xyZfishcalib보정 패널과 사이드 미러
포함 AABT-3D 관찰 컨테이너xyZfish큐브 
AABT-3D 추적 소프트웨어xyZfishv.1.0 
컴퓨터옵션N/AWindows XP 이상
(+)-MK-801 수소 말레산염시그마M107 
에어 펌프Fusion500 
에어 라인 튜빙 3/16 "이리 s 수족관 및 애완 동물 제품14508 
중간 바인더 클립OfficeDepot561339항공사를 관찰 컨테이너에 부착하기 위해

참고문헌

  1. Brennan, C. H. Zebrafish behavioural assays of translational relevance for the study of psychiatric disease. Rev. Neurosci. 22, 37-48 (2011).
  2. Kabashi, E., Brustein, E., Champagne, N., Drapeau, P. Zebrafish models for the functional genomics of neurogenetic disorders. Biochim. Biophys. Acta. 1812, 335-345 (2011).
  3. McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth. Defects. Res. C. Embryo Today. 93, 67-114 (2011).
  4. Kurta, A., Palestis, B. Effects of ethanol on the shoaling behavior of zebrafish (Danio rerio). Dose-Response. 8, 527-533 (2010).
  5. Sison, M., Gerlai, R. Behavioral performance altering effects of MK-801 in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 220, 331-337 (2011).
  6. Delcourt, J., Denoël, M., Ylieff, M., Poncin, P. Video multitracking of fish behaviour: a synthesis and future perspectives. Fish Fish. 14, 186-204 (2013).
  7. Zhu, L., Weng, W. Catadioptric stereo-vision system for the real-time monitoring of 3D behavior in aquatic animals. Physiol. Behav. 91, 106-119 (2007).
  8. System for 3D monitoring and analysis of motion behavior of targets. US patent. , 8306260 (2012).
  9. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6, e17597(2011).
  10. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The immediate and the delayed effects of buspirone on zebrafish (Danio rerio) in an open field test: a 3-D approach. Behav. Brain Res. 234, 365-374 (2012).
  11. Maaswinkel, H., Le, X., He, L., Zhu, L., Weng, W. Dissociating the effects of habituation, black walls, buspirone and ethanol on anxiety-like behavioral responses in shoaling zebrafish. A 3D approach to social behavior. Pharmacol. Biochem. Behav. 108, 16-27 (2013).
  12. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The advantages of a 3D-automatic recording system for the study of shoaling behavior in zebrafish. 10th International Conference Zebrafish Development and Genetics, Madison, , (2012).
  13. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. An automatic recording system to quantify antagonistic interactions between zebrafish. Abstract. 10th International Conference Zebrafish Development and Genetics, Madison, , (2012).
  14. Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol. Rev. Camb. Phil. Soc. 83, 13-34 (2008).
  15. Krause, J., Hartmann, N., Pritchard, V. L. The influence of nutritional state on shoal choice in zebrafish, Danio rerio. Anim. Behav. 57, 771-775 (1999).
  16. Speedie, N., Gerlai, R. Alarm substance induced behavioral responses in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 188, 168-177 (2008).
  17. Gebauer, D. L., Pagnussat, N., Piato, A. L., Schaeffer, I. C., Bonan, C. D., Lara, D. R. Effects of anxiolytics in zebrafish: similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and. 99, 480-486 (2011).
  18. Paull, G. C., Filby, A. L., Giddins, H. G., Coe, T. S., Hamilton, P. B., Tyler, C. R. Dominance hierarchies in zebrafish (Danio rerio) and their relationship with reproductive success. Zebrafish. 7, 109-117 (2010).
  19. Engeszer, R. E., Ryan, M. J., Parichy, D. M. Learned social preference in zebrafish. Curr. Biol. 14, 881-884 (2004).
  20. Mathur, P., Guo, S. Use of zebrafish as a model to understand mechanisms of addiction and complex neurobehavioral phenotypes. Neurobiol. Dis. 40, 66-72 (2010).
  21. Tropepe, V., Sive, H. L. Can zebrafish be used as a model to study the neurodevelopmental causes of autism. Genes Brain Behav. 2, 268-281 (2003).
  22. Echevarria, D. J., Hammack, C. M., Pratt, D. W., Hosemann, J. D. A novel behavioral test battery to assess global drug effects using zebrafish. Int. J. Comp. Psychol. 21, 19-34 (2008).
  23. Seibt, K. J., Piato, A. L., Luz Oliveira, da, Capiotti, R., Vianna, K. M., R, M., Bonan, C. D. Antipsychotic drugs reverse MK-801 induced cognitive and social interaction deficits in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain. Res. 224, 135-139 (2011).
  24. Zou, H., et al. Low dose MK-801 reduces social investigation in mice. Pharmacol. Biochem. Behav. 90, 753-757 (2008).
  25. Ng, M. C., Hsu, C. P., Wu, Y. J., Wu, S. Y., Yang, Y. L., Lu, K. T. Effect of MK-801-induced impairment of inhibitory avoidance learning in zebrafish via inactivation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) in telencephalon. Fish Physiol. Biochem. 38, 1099-1106 (2012).
  26. Sison, M., Gerlai, R. Associative learning performance is impaired in zebrafish (Danio rerio) by the NMDA-R antagonist MK-801. Neurobiol. Learn. Mem. 96, 230-237 (2011).
  27. Swain, H. A., Sigstad, C., Scalzo, F. M. Effects of dizocilpine (MK-801) on circling behavior, swimming activity, and place preference in zebrafish (Danio rerio). Neurotox. Teratol. 26, 725-729 (2004).
  28. Vezzani, A., et al. Kinetics of MK-801 and its effect on quinolinic acid-induced seizures and neurotoxicity in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 249, 278-283 (1989).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. J. Neurosci. Methods. 210, 266-271 (2012).
  30. Rung, J. P., Carlsson, A., Rydén Markinhuhta, K., Carlsson, M. L. (+)-MK-801 induced social withdrawal in rats; a model for negative symptoms of schizophrenia. Prog. Neuro-psychopharmacol. Biol. Psych. 29, 827-832 (2005).
  31. Gururajan, A., Taylor, D. A., Malone, D. T. Cannabidiol and clozapine reverse MK-801-induced deficits in social interaction and hyperactivity in Sprague-Dawley rats. J. Psychopharmacol. 226, 1317-1332 (2012).
  32. Burket, J. A., Cannon, W. R., Jacome, L. F., Deutsch, S. I. MK-801, a noncompetitive NMDA receptor antagonist, elicits circling behavior in the genetically inbred Balb/c mouse strain. Brain Res. Bull. 83, 337-339 (2010).
  33. Saunders, J. A., Gandal, M. J., Roberts, T. P., Siegel, S. J. NMDA antagonist MK801 recreates auditory electrophysiology disruption present in autism and other neurodevelopmental disorders. Behav. Brain Res. 234, 233-237 (2012).
  34. Brosda, J., et al. Pharmacological and parametrical investigation of prepulse inhibition of startle and prepulse elicited reactions in Wistar rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 99, 22-28 (2011).
  35. Wong, K., et al. Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 208, 450-457 (2010).
  36. Maximino, C., et al. Parametric analyses of anxiety in zebrafish scototaxis. Behav. Brain Res. 210, 1-7 (2010).
  37. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7, e36931(2012).

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