재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

Summary

파지 디스플레이는 그 고정 된 분자와 상호 작용하는 단백질이나 단백질 부분을 캡처 할 수있는 강력한 기술이다. 생성하는 파아지 cDNA 라이브러리의 형식과 스크린의 결정이 제작되면, 여기에 설명 된 프로토콜 인터랙의 식별에 이르는 효율 선호도 선택을 허용한다.

Abstract

고정 미끼 분자 방향성 복제 cDNA 라이브러리로 인코딩 된 다양한 단백질 부분을 제시 할 수있는 발판 재조합 파지를 사용하여 상호 작용을 발견 할 수있는 효율적인 수단입니다. 기술은 주로 단백질 - 단백질 상호 작용을 발견하기 위해 사용되었지만 도전을 미끼 분자는 단백질에 한정 될 필요는 없다. 여기에 제시된 프로토콜은 미끼의 소극적인 수가 동일한 단백질을 제시하는 독립 클론의 식별을 최대화하기 위해 반복 실험으로 스크리닝 할 수 있도록 최적화되었다. 이 확인 된 상호 작용하는 단백질이 미끼 분자의 합법적 인 인터랙 것을 더 큰 자신감을 허용합니다. 각각의 선호도 선택 후 파지 역가를 모니터링 라운드 선호도 선택이 음성 대조군의 효과뿐 아니라 어떻게 진행되고 있는지에 대한 정보를 제공합니다. 하나는 파지를 titering, 방법을 통해 어떤이 과정이 효율적으로 진행 할 수 있도록 사전에 준비수는 표시됩니다. 독립적 인 플라크의 격리 다음 검색 증폭 산물의 특성이 선호도 선택은 진행 상황을 잘 확인하는 데 사용할 수있는 강조 표시됩니다. 문제가 잘못된 반응을 최소화하기 위해 또는 지속적으로 파지를 복구 우회하는 기술 촬영이 설명되어 있습니다. 바이러스 오염 플레어 업을 줄이는 수단이 논의된다.

Introduction

왜 대신에 다른 분자와 단백질의 상호 작용을 발견하고 조사에 사용할 수있는 수많은 다른 기술의 파지 디스플레이와 궁합 선택을 사용할 수 있습니까? 파지 디스플레이는 다음과 같은 단백질 - 리간드 상호 작용 ^1-3을 검출하는 다른 방법을 통해 몇 가지 독특한 장점을 청구 할 수 있습니다 :

미끼 분자의 매우 넓은 레퍼토리

가장 중요한 이유는 친화력 선택 ⁴ 미끼 역할을 할 수있는 분자의 다양성에있다. 파지 디스플레이는 고분자 / 분자가 복구 지원에 부착 할 수있는 경우 기본적으로, 그것은 파지 표시 단백질과 선호도에 대한 검사를 할 수있는 다른 단백질, 핵산, 탄수화물 등 ^5과 상호 작용하는 단백질 조각을 분리하는 매우 강력한 수단이다. 조건은 연구에 사용하는 경우 또한, 미끼 분자는 ⁶ 고정 때 생물학적 활성을 유지하는지 확인하기 위해 액세스 할 수 있습니다활동을 제거 / 끌어 내다 전에 친 화성 선택에 미끼로 번역 후 변형을 소개하고, ⁶ 효과 또는이다.

외부 요인에 파지 저항

파지 디스플레이를 사용하는 두 번째 이유는, 그것이 어떤 미끼가 상호 작용하는 단백질을 캡처하는 환경 스트레스 (열, 높은 osmolyte 농도, 특정 보조 인자, 등.)을 요구할 수 있다는 가능하다는 것을, 또는 파지 디스플레이 단백질 든 변경해야 할 수도 친화력 선택하기 전에. 연구되고있는 요인은 먹이와 단백질 아니라 그것이 시험 유기체에 치명적인 경우 상호 작용이 발생할 수있게하거나 상태 사이의 상호 작용이다. 그것은 (T7 생존을위한 출판 열 최대 ~ 60 ° C ^7입니다 예) 그대로 실행 가능한 두 가혹한 실험 조건을 견딜 수 있기 때문에 T7 파지는 이러한 연구에 특히 적합합니다. 바꾸는 파지의 예는 프로 표시로수리 효소의 단백질 기질의 애기 장대 종자 프로테옴을 검사 할 때 teins는 단백질 Isoaspartyl 메틸 Transferease (PIMT)는이 연구에 사용 된 바이러스는 도입을 장려하기 위해, 이전에 각 친화력 선택에 라운드, 일주일 동안 "세"있었다 isoaspartate의 (isoAsp는) 인식 및 수리 / 등의 이상을 대사 할 수 유기체에서 할 수없는 민감한 단백질 ⁶ 잔류 물.

대사 적 불활성

또한, 파지는 일반적으로 신진 대사 독과, 적어도, 대사 활성 시험 생물에다면 발현 성 효과가 발생할 것 작은 분자 간섭에 저항. 엄격 세척 후, 독은 독성이 세균 또는 후속 파아지 복제 무해한 범위로 희석되도록 박테리아의 대량 감염이 도입되기 전에 제거된다. PIMT 수리 단백질 표적을 조사하는 동안효소, S-아데노 메티오닌 (AdoMet)는 효소를 불 활성화하고 유용한 음성 대조군이있는 보안 제공하기 위해 S-아데노 호모시스테인 (AdoH​​cy)에 의존하면서 표적 단백질 캡처를 허용하도록 마이크로 타이 터 플레이트 잘 고정화 효소를 활성화하는 데 사용되었다 바이러스에 악영향 AdoMet 또는 AdoHcy ^6도에 의해 영향을받을 수없는 것이 지식. 또한이 실험실에서 조사 특정 늦은 배아 풍부한 (LEA) 단백질 가족의 일원은, 시점에 콩 씨앗에서 200 밀리미터의 높은 농도를 달성 할 수 자당 ⁸ 등의 첨가제의 존재에 자신의 형상을 변경하는 것으로 알려져있다 생리적 성숙 ^9. 바이러스는 자율적으로 실행 가능한 시험 생물 ^(10)의 경우에는 해당되지 않습니다 특정 LEA-클라이언트 단백질 상호 작용에 대한 가능성에 필요한 각각의 친화력 선택 라운드, 200 MM의 자당의 첨가에 의해 영향을받을 것으로 예상되지 않습니다.

이 연구소는 discoverin에 초점을 맞추고있다G 단백질 - 단백질 탈수 ⁽¹¹⁾ 또는 씨가 ⁶ 흡수 된 후에 isoAsp 형성에 취약 저장 프로테옴의 구성 요소를 복구하는 동안 저장 프로테옴 보호의 메커니즘을 기초 성숙, 탈수 또는 발아 씨앗의 상호 작용. 따라서, 생산 및 정제 활성 상태에 미끼로 필요한 재조합 단백질, 그들이 고정화 전후에 자주 어려운, 우리의 작업에 기초하지만 그들은, 그래서 남아 보장한다. 각각의 재조합 단백질 생산 시나리오가 다르기 그러나, 재조합 단백질 생산을위한 최적화 조건은 여기서 언급되지 않을 것이다. 사용자는 (이 효소 경우 마이크로 플레이트의 우물에서 효소 분석을, 예를 들면) 고정 된 단백질이 여전히 작동하는지 확인하기 위해, 가능한 한, 시도 촉구된다. 이것은 어떤 발견 상호 작용이 있는지, 미끼 따라서 생물학적 활성과 자신감을 제공합니다생물학적 관련성이 다소 가능성.

Protocol

B) 정제 된 재조합 미끼, A) 파지 디스플레이의 cDNA 미끼에 대한 선호도와 단백질을 인코딩 할 가능성이 도서관은 (그림 1) 아래에 설명 된 절차에의 그래픽 묘사는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 친 화성 선택을위한 두 가지 기본 구성 요소를 강조 단백질. 미끼 (재조합 단백질)의 생산은 광범위하게 검토 한 문학은 E.에서 용해 활성 재조합 단백질을 보호하기위한 최선의 방법을 요약 대장균 ^12-13, 진핵 세포, 효모 ^{14, 15 ~ 16} 곤충, 식물 ^{17 ~ 18,} 또는 ^{19 ~ 20} 포유류 세포가 풍부하다.

다음과 같은 프로토콜에서 hexahistidyl 재조합 단백질 미끼로 사용 된 태그. 이 미끼 단백질 하룻밤 배양 및 세척 단계 후 우물에 남아 확인하실 수 있습니다.

1. 미세 적정 판 우물에서 재조합 단백질의 유지를위한 ELISA

1. 마크영구적 인 잉크, 우물이있는 단백질의 농도를 포함합니다 내정자와 마이크로 플레이트. 우물의 3 복제이를 수행합니다. (; BSA는이 배경 조사로 잘 작동 비 hexahistidyl - 태그 단백질) 음성 대조군의 농도 시리즈의 3 복제를 포함합니다.
2. 물에 광범위하게 접시를 씻고 거꾸로 세척 사이에 4 층 종이 타월에 접시를 때린하여 물을 제거합니다.
3. 트리스, 산도 7.5, (선택 또는 버퍼) 재조합 단백질 (10 ㎍ / ㎖)의 높은 농도의 100 μL에, 처음 3 우물에 고정시킨다. 다음 세 개의 우물 아래로 1.0 NG / ML에 등 (1.0 ㎍ / ㎖)의 재조합 단백질을 추가합니다. BSA 농도 시리즈와 같은 작업을 수행합니다.
4. 플라스틱 포장으로 요리를 커버하고 4 ℃에서 하룻밤 남겨
5. 다음날 아침, 거꾸로 4-5 층 종이 타월에 판을 때린하여 단백질을 제거합니다.
6. 세척 우물은 버퍼를 떠나, TBS 1X 200 ㎕를 각 시간 5 배~ 1 분마다 거꾸로 각 세척 후 종이 타월에 접시를 때린하여 버퍼 세척을 제거하는 우물.
7. (W / V) BSA 200 μL 5 % 200 ㎕의 5 %를 사용하여 회전 진탕 ELISA 플레이트를 차단 (W / V)을 실온에서 2 시간 동안 TBS에서 시약을 차단 (또는 4 ° C에서 고정 밤새 앉아 편리한 경우 ) 플라스틱 포장에 싸여.
8. 거꾸로 종이 타월에 접시를 때린으로 초과 차단 솔루션을 제거합니다. 거꾸로 판을 때린하여 세척 용액을 제거, 1X TBS의 200 μL와 배 1 분마다 씻으십시오.
9. 버퍼를 차단에 펜타 HIS 차 항체 1 / 2, 000을 희석하고 각 웰에 100 μl를 제공합니다. 플레이트 고정 실온에서 1 ~ 2 시간을 품어.
10. 거꾸로 종이 타월에 접시를 때린하여 일차 항체를 제거합니다. 1X TBST 200 μL와 배 1 분마다 씻으십시오. 거꾸로 판을 때린 각 세척을 제거합니다.
11. 이차 항체를 희석버퍼를 차단하고 플레이트 고정, 실온에서 1 시간 동안 각 웰에 100 μl를 배양에 (염소 항 마우스 알칼리성 인산 가수 분해 효소 복합체).
12. 거꾸로 종이 타월에 접시를 때린하여 이차 항체를 제거합니다. 1X TBST 200 μL와 배 1 분마다 씻으십시오. 거꾸로 판을 때린 각 세척을 제거합니다.
13. 각 웰에 파라 - 니트로 페닐 포스페이트 (PNPP) 기질 용액 200 μl를 놓습니다. 기판은 너무 분주을하고 완전히이 단계에서 해동 잘 미리 냉장고에서 감지에 필요한 분량 씩의 필요한 번호를 검색 -20 ° C에서 고체입니다.
14. 30 분에 각 웰에 3 M의 NaOH 50 μl를 추가하여 반응을 중지합니다.
15. 즉시 ELISA 플레이트 리더에 405 nm에서의 흡광도를 참조하십시오.

참고 : 또한 재조합 단백질 웰 자체를 부착하지 않는 경우,이 회를 변경하는 것이 가능하다전자의 구성 / 버퍼의 pH가 상당히 (탄산 버퍼의 pH 10.0) 또는 마이크로 플레이트의 웰에 단백질의 첨부 파일을 지원하기 위해 시도하는 chaotropes (요소)를 추가합니다. 2) 높은 pH / chaotrope의 제거 다음의 생물학적 활성을 유지 권장하며 1) 선호도 선택을위한 조건에서 마이크로 플레이트의 웰에 바인딩 남아 그러나, 재조합 단백질이 있음을 다시 수립.

2. Titering에 세균 호스트 (BLT5403)을 성장

1. 오토 클레이브 (그림 2A) 열 250 ㎖의 삼각 플라스크 3 문화 튜브. LB 액체와 고체 미디어 판을 붓는 LB 한천을 확인합니다. 쿨 LB의 50 ° C에 한천 전에 asceptically 흐름 후드 (그림 2B)에서 배양 접시에 붓는 100 ㎍ / ml의 암피실린을 추가합니다.
2. 또한 흐름 후드 (그림 2B) 행진 LB에, 재고 BLT5403의 단일 콜로니 100 ㎍ / ㎖의 암피실린 (LB ^AMP100) 한천 플레이트는 15 %로 유지 (V / V)-80 ° C (그림 2C)에서 글리세롤. 성장을위한 인큐베이터 (그림 2D)에서 하룻밤 37 ° C에서 거꾸로 판을 놓습니다.
3. 아침에 접시에서 고른 하나의 식민지로 250 ㎖의 삼각 플라스크에 50 ㎖의 LB ^{AMP100 접종.} 37 ° C, 수평 진탕 (그림 2E 및 2 층)에서 200 rpm으로 품어, 그리고 = 0.5-0.6 (그림 2H) OD ₆₀₀ 세포의 밀도를 모니터링하는 분광 광도계를 사용합니다.
4. 50 ML 팔콘 튜브 또는 유사한로 세포를 넣어 사용합니다 (그림 2G)까지 4 ° C에 보관하십시오. 세포는 보통 ~ 1 주 동안 가능한 유지됩니다.
5. 500 ㎖의 LB를 확인, 당황 FERNBACH 플라스크에 배치하고 압력솥. 이 멸균되면, 아래의 "ONE DAY"의 밤까지 4 ° C에서 (그림 2G) 또는 실온에서 플라스크를 배치합니다.

주 : 호스트 박테리아 세포를BLT5403는 T7 중간, 낮은 벡터를 복사하여 성공적으로 복제 할 수없이 T7 기본 캡시드 단백질의 플라스미드 매개로 소스를 표현 바이러스에 매우 민감하다. 그것은 오염을 방지하기 위해 필수적입니다. 바이러스 / 감염 세균과 접촉하는 모든 표면은 70 % (V / V) 에탄올로 닦아 또는 세제 (그림 2I)를 사용하여 세정해야하는 시점에서 오염은 결국 발생합니다. 이 비효율적 인 경우, Envirocide (그림 2,1)을 견딜 수있는 모든 표면의 철저한 오염 제거가 필요합니다. 4 ° C에서 재고의 오염을 줄이기 위해 냉장고의 재고 BLT5403 세포 친 화성 선택의 새 라운드를 시작하고 활발한 세포가 프로토콜에서 사용되는 확인하십시오. 필터 장벽 피펫 팁은 필수적이다.

3. 선호도 선택

DAY ONE

1. 마크 웰이되는 제자를 포함하는 마이크로의 영구적 인 잉크 판, 그리고 지정합니다아인스 / 수정. (인해 오염 문제로 플레이트는 다시되지 않습니다). 각 단백질 및 치료 용 우물 3 회 반복이를 수행합니다.
2. 물에 광범위하게 접시를 씻고 거꾸로 세척 사이에 4 층 종이 타월에 접시를 때린하여 물을 제거합니다. 첫 번째로 트리스, 산도 7.5, 여섯 웰스 (선택 또는 버퍼) 재조합 단백질 (10 ㎍ / ㎖) 또는 BSA 9 우물의 총 세 개의 우물 (10 ㎍ / ㎖)의 100 μL에 고정화 친화력 선택의 라운드. 플라스틱 포장으로 요리를 커버하고 4 ° C (그림 2G)에서 하룻밤 둡니다.
3. 압력 가마로 소독하고, 적절하게 레이블이 청소 9 × 250 ㎖의 삼각 플라스크 (위의 2.1 참조), (색 테이프로 코딩 잘 그림 2 층 작동)가 있는지 확인합니다.
4. 각 웰에 사용되는 라이브러리의 역가 및 스크리닝하는 파지의 수에 기초하여 사용할 파지 파쇄물의 양을 계산한다.
5. 신선한 BLT5403 세포가 사용할 준비가되었는지 확인원형이 친 화성 선택 내일 (그림 3A)를 titering하십시오.
6. 충분한 1X의 TBS (150 mM의 NaCl을, 50 mM 트리스 자료, 산도 7.6) 및 1X TTBS (1X의 TBS + 0.05 % (V / V) 트윈 20)를 확인 우물 사용되는 수를 10 × 200 μL 세척을 수행 할 수 있습니다 . 또한, 궁합 선택 온도에서 TTBS를 preinc​​ubate. 밀봉 된 백업, 1X TTBS 50 ㎖ 팔콘 튜브가 충분한 1X TTBS와의 궁합 선택 온도에 있는지 확인하십시오.
7. LB ^{100 AMP} 각각 990 ㎕를 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브 (총 27)의 3 처리 × 3 회 반복 × 3 세벌을 준비하고 적절하게 (예 ^10-2)을 레이블. 이들은 내일 마이크로 플레이트의 우물에서 검색 한 감염 세균에 대한 것입니다. 튜브 ^(10-2)의 일측에 희석하고 다른 쪽 오름차순 번호 ( "1")을 표시한다. 각 에펜 도르프 튜브의 경우에도 하나의 붕 규산염 관 한 LB ^{100 AMP 판} 레이블. 이 승AY, 플레이트 및 붕규산 테스트 튜브 등, 4, 3, 2, 5를 한 번호가 매겨진다. titering 더 빨리 갈 수 있도록. 그 후 간단한 번호가 에펜 도르프 튜브에 희석 및 치료에 일치 할 수있다 (예를 들어, # 12 관은 희석 ^10-5의 BSA 컨트롤의 첫 번째 복제의 세 번째 세중했다). 스토어 에펜 도르프 튜브 및 LB ^{100 AMP 판은} 4 ° C에서 하룻밤 (2G 및도 3B).

예를 들어, BSA 복제 한도 1, 2, 3 (복제 하나 파지 역가의 세 세중 수치)로부터 파지 세 10 ^-2 희석에 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브 라벨, 다음 붕규산 시험관 1 표시 시작 감염된 박테리아가 LB ^{100 AMP 한천} 플레이트 (그림 3C)에 따르기 전에 감염되지 않은 박테리아와 최고 아가로 오스와 혼합 할 수있는 2, 3.

8. 직렬 D에 대한각 ilutions, 라벨 에펜 도르프 튜브와는 LB ^{100 AMP} 900 μl를 추가합니다. 초기 희석 감염된 박테리아의 ^(10-2)가 각각의 단백질 / 치료, 복제, 세중, 내일을 위해 만든되면, 그들은 잘 혼합하고 100 μL 그들로부터 촬영 및 LB ⁽¹⁰⁰⁾ 900 μl를 포함하는 적절한 에펜 도르프 튜브에 추가 (복제 한 BSA 컨트롤 튜브 4, 5, 6) ^10-3 희석 ^AMP. 이들은 자신의 차례에서 잘 혼합되고 ^10-3 희석가 ^10-4 희석하기 위해 사용될 것이다 (7, 8, 9). ^10-5 희석 (10, 11, 12) 등의 ^10-4 희석을 사용합니다. 세 BSA의 복제 (우물)의 첫 번째의 역가를 얻을 수 있습니다.
9. 동일한 BSA 복제 두 가지에 대해 수행됩니다 (물론 2), BSA 복제 세 (도 3), 독 미끼의 세 복제, 마지막으로 미끼 우물의 세 가지 복제. 끝에서 F를 표시 관이 있어야한다ROM 1-135 (135 × ^10-6의 최대 희석 미끼의 마지막 복제의 마지막 중으로이다). 4 ° C (그림 3C는 에펜 도르프와 BSA의 세 가지 복제 (세 우물)의 삼중의 모든 희석에 대한 붕 규산염 관을 보여줍니다에서 하룻밤이 에펜 도르프 튜브를 저장합니다.
10. 하룻밤 문화로 배양 통 (그림 2E 및 2 층)에서 성장, (단계 2.2에서 위의 갓 줄무늬 하룻밤 LB ^{AMP100 판에서} 하나의 식민지에서 선택) BLT5403 세포의 2 ~ 3 문화 튜브를 시작합니다. 500 ㎖의 LB (점 이상 2.5)으로, 100 ㎍ / ㎖의 암피실린을 추가하고 37 ° C에서 볼 수있을 것 떨고 인큐베이터에있는 클램프에 FERNBACH 플라스크를 배치하고 다음날 아침 (그림 2F)를 폭기.

참고 : 원형, 셋, 넷은 P의 많은 ^-10 10 볼륨의 대략적인 희석이 필요할 수 있습니다LB ^AMP100에의 볼륨 hage.

둘째 날

11. 다음날 아침, 배양 통에서 클램프의 오토 클레이브, 빈 9 × 250 ㎖의 삼각 플라스크 (물론 각각의 마이크로 플레이트를) 배치. BLT5403 세포의 하룻밤 문화 중 하나에서 500 μL와 500 ㎖의 LB ^{100 AMP 접종은,} (위의 단계 3.8 참조) 다시 봉인하고 (37 ° C, 220 RPM)을 성장 시작 지난 밤에 시작했다. 분광 광도계 (그림 2H)의 전원을 켜고 600 nm에서 흡광도를 읽고 설정합니다.
12. 4 ° C에서 마이크로 플레이트를 제거, 플라스틱 필름을 제거하고 200 μL로 1X TBS의 pH 7.5의 때마다 배를 세척 거꾸로 세척 사이에 종이 타월에 접시를 때린하여 판에서 어떤 언 바운드 단백질을 제거합니다. 200 ㎕의 5 % 플라스틱 포장에 싸여 플레이트 (W / V) BSA 200 ㎕의 5 % (W / V) 1 시간 동안 TBS의 시약을 차단 (또는 야간 편리 경우)를 차단합니다.
13. 차단의를 씻어olution 배 거꾸로 세척 사이에 종이 타월의 4 층에 접시를 때린 1X TBST 200 μL마다,과. 그것은,이 단계에서 200 μL의 물을 우물을 보충 플라스틱 포장로를 포함, 최대 1 주 동안 저장하기 위해 4 ° C에서 넣어 수 있습니다.

참고 : 시간에 따라 선호도 선택의 완성에서 파지 감염 - BLT5403 추가 할 준비가되어 있음을 곧 문화를 시작, 500 ML에있는 세포는 0.6과 1.0 OD ₆₀₀ 사이입니다. 그들은 많은 1.0를 초과 할 경우 세포가 정지 단계에 접근, 용해는 자원의 제약을 위해서 (때문에) 발생하지 않을 수 있습니다. 셀 _(600)은 0.6의 적어도 종래 파지의 도입 OD를 달성하지 않는 경우에, 감염의 다중성은 급속 파쇄물의 표현에 영향을 미칠 수있는 세포를 죽이는 너무 높을 수있다. 세포가 아직 궁합 선택, INOC의 완료로 0.6 OD _{600에 접근하지} 않는 경우ulate 두 번째 (또는 심지어에서 두 번째와 세 번째 모두) 37 ° C (그림 2 층)에서 진탕 시험관에서 더 많은 BLT5403와 플라스크. OD 1.0 _{600 너무} 빨리 접근하는 경우, 히터와 셰이커를 끄고 문화를 냉각하고 산소 박테리아를 굶어 뚜껑을 엽니 다. 파지 한 번 흔들어 / 난방을 재개가 추가되었습니다.

여기에서 파지 교차 오염을 방지하기 위해 필터 장벽 팁을 사용합니다.

14. 플라스크에 접종하면, 단백질의 파지 라이브러리 (100 μL)를 넣어 랩으로 접시를 봉인하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
15. 55 분에, OD의 셀 _(600)를 기록한다. 배가 시간은 대략 매 20 분이다. 법에 따라 (위의 "주"참조).
16. 한 시간의 끝에서 플레이트에서 플라스틱 포장을 제거하고 즉시 변환 된 폐기물에 파지를 흔들어하고 빠르게 1X TB의 200 μl를 추가하여 세척ST. (1 = 100 ㎕의 머리와 multipipettor 및 설정 피펫을 사용하여 2 이것에 대한 [즉, 200 μL / 플런저 우울증이 제공]하고 빠르게 간다). 1 분 타이머를 설정합니다. 1 분 후, 변환 된 폐기물, 거꾸로 종이 타월에 맛 판에 버퍼를 흔들 벤치 (25 °의 C 플레이트)에 다시 배치합니다. 반복 세탁 10 배 단계를 반복합니다.
17. 10 ^{회 세척} 한 후, 4 ° C에서 50 ML 팔콘 튜브에서 BLT5403 세포 200 μL을 가지고 잘 TTBS의 마지막 세척이 제거 된 하단에 넣어. 플라스틱 포장에 접시를 감싸고 (무차별 파지 바인딩에서 지속적으로 검색 파지 및 / 또는 높은 배경에 관한 토론에 메모를 참조) 여전히 박테리아를 감염 미끼에 붙어있는 파지를 얻을 20 분 동안 37 ° C에 넣어.
18. 20 분의 끝에서, 판을 푸는 25 ° C 복제 잘 하나에서 BSA에서 10 ㎕의 세균을 가지고 표시 LB ^{100 AMP의} 990 μL에 넣어"1". 이 아니라 두 번 더 반복 (튜브 2, 3)이 아니라에서 파지의 1 / 100으로 희석 3 삼중의 결과. 이 세 번 샘플링 BSA 복제입니다. 이러한 희석 BSA의 복제를 위해 SEM ± 평균 역가를 추정하는 데 사용됩니다.
19. 독 미끼 단백질의 세 가지 복제 우물, BSA (10 ㎕를 각각의 세 가지 중으로 샘플)의 복제 2와 3에 대해 동일한 작업을 수행하고, 미끼 단백질. 옆이 27 에펜 도르프 튜브를 설정하고 용해를 향해 성장하는 우물에 감염된 세균의 나머지 170 μl를 얻을.
20. 플라스크 내의 박테리아 = 0.6-1.0 OD _600이면 FERNBACH에서 50 ㎖의 세포 구 250 ㎖의 삼각 플라스크에 각각 플라스크 가만히 따르다. 잘 BSA 복제 1 파지에 감염된 BLT5403 박테리아의 나머지 170 μl를 타고 "BSA 담당자 1"(노란색 테이프) 표시 50 ㎖ 셀에 추가합니다. 아홉 우물에 대해이 작업을 수행하고 그들이 (인큐베이터에 넣어 흔들어 그림 2F).
21. 용해 용에 시간 시간에서 37 ° C 배양 통 (접종의 시간이 약 3 시간)에있는 세포를 모니터링합니다. 이 시간 동안 해당 레이블 에펜 도르프 튜브에 27 초기 희석 ^(10-2)에서 희석을합니다.
22. 위의 3.12에서 초기 27 희석 이러한 희석을 수행하려면, 에펜 도르프 튜브 1 (잘에서이 1 / 100 희석에서 세중 샘플의 첫 번째 BSA 복제 한)에서 박테리아와 LB의 100 μl를 취해에 추가 에펜 도르프 튜브 4 LB 900 ㎕의 (첫 번째 잘의 세중의 샘플의 BSA 복제 한 1 × 10 ^-4 희석).
23. 에펜 도르프 튜브 7 LB의 900 ㎕를 먼저 세중의 BSA 복제 한 (1 × 10 ^-5 희석에 추가 에펜 도르프 튜브 (4)에서 박테리아와 LB의 100 μl를 얻기 전에 새로운 하나의 필터 장벽 팁을 폐기 이 잘에서 샘플). 희석 (D 계속자신의 모든 단백질과 치료 (총 135 관)의 모든 복제의 모든 삼중 용) ^-6 10 × 1.
24. 세포가 용해되면, 5 M 염화나트륨 재고 5 ㎖를 추가하여 0.5 M의 NaCl에 문화를 가져오고 레이블 원심 분리기 병에 전송할 수 있습니다.
25. 4 ℃에서 10 분 동안 8,000 XG에 원심 분리기 깨끗하고 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 뜨는 (바이러스) 가만히 따르다.
26. 팔콘 튜브에 경사 상층 액에 클로로포름 몇 방울을 추가합니다.
27. 친화력 선택의 다음 라운드를위한 4 ° C에서 보관.

4. 셋째 날

1. 다음 라운드를 준비하는 원형이 친 화성 선택 생성에 사용 된 모든 실험기구를 압력솥 또는 표백.

5. Titering

1. 희석 오름차순으로 있기 때문에 수 많은 고체 LB ^{100 AMP 판으로} (이제 모든 붕규산 튜브와 에펜 도르프 튜브, 같은 수의 각 1 접시가 있어야한다). 피37 ° C의 배양기 (그림 3D)에 판을 유타.
2. 최고 아가로 오스를 용융 (1.0 g 박토 트립 톤, 0.5 g 효모 추출물, 0.5 g의 NaCl, 0.6 g 아가로 오스, 100 ㎖, 오토 클레이브로 확인) 상단 아가 병 뚜껑을 풀고 교대 병 레인지 작동하고 베스트까지 혼합하는 소용돌이에 의해 아가로 오스가 완전히 녹아있다. 50 ° C (그림 3E)로 냉각 수조에 병을 넣어.
3. 부착 된 피펫 펌프 붕규산 10 ㎖ 피펫을 가져 가라. 분젠 버너에 불을. 거꾸로 벤치에 스티로폼 팔콘 튜브 홀더 또는 냉각기 뚜껑을 켜고에 1 ~ 6 (신선한 37 ° C 배양기 중) LB100 AMP 플레이트를 배치, 플레이트 1 최상부 (그림 4A). 스티로폼은 따뜻한 접시를 유지합니다.
4. 위의 첫날에 준비 (섹션 3.7 (b)와 (c) 피규어) 번호 붕규산 시험관에 각각 4 ° C에서 250 μL BLT5403 세포를 넣어. AR1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브 (그림 4A)의 희석과 같은 상승하는 일련의 번호가 붕 규산염 관을 다양합니다.
5. 붕규산 시험관 1 (그림 4D와 4E)에있는 세포의 250 μL에 에펜 도르프 튜브 1에 희석에서 100 μl를 넣어. 비트 (너무 많이하지! ~ 3 강타, 그림 층) 화염에 피펫의 첫 번째 5를 가열 용융 최고 아가로 오스에 뛰어 들다. 3 ㎖를 당겨 세포 / 파지 (그림 4G)의 상단에 테스트 튜브에 빠른 것 제공합니다.
6. 반면 (그림 4H)와 튜브를 들고와 플레이트 (그림 4I)의 내용을 부어 동안 손가락으로 쓸어 넘겨 섞는다. 접시를 기울여 전체 플레이트가 상단 아가 로스에 의해 보호 될 때까지 거품과 건조한 장소를 쫓아 테스트 튜브를 사용합니다. 수직 냉각 벤치에, 옆에 설정합니다.
7. 붕 규산염 관을 버리고, 필터 장벽 팁을 꺼내을 얻을신선한 한 모든 희석 도금 될 때까지 계속합니다. 그들은이 고갈되지하지만 6 개 이상 한 번에 또는 그들이 냉각 상단 아가 너무 빨리 응고 될 때 인큐베이터에서 LB ^{100 AMP 플레이트를} 검색합니다.
8. 상단 아가로 오스는 고체되면 (IT 이렇게하는 것이 중요합니다) 거꾸로 판을 켭니다. 그렇지 않으면, 한천 / 아가로 오스, "울고"뚜껑에 응축, 최고 아가 아래로 떨어지고 그것이 불가능이든과) 정확하게 역가에 만들기로 파지를 가지고, 그것을 통해 실행 : 1) 37 °에 접시를 넣어 C 배양기는 OR [T7 공격적으로 역가를 계산하는 4 시간 후 돌아올] : 2) 역가를 계산하는 다음 날 아침에 거꾸로 벤치에 가두 고 그들은 준비가되어 있습니다.
9. 끓을 때까지, 느슨하게, 전자 레인지 상단 아가로 오스에 위로 가기 아가 병 뚜껑을 넣어 않는 경우 유리 박살, 부상을 방지하기 위해 필요한 모든 조치를 즐길 수도 있습니다. 두 번이 작업을 수행합니다. 쿨, 강화하자캡과 수납. 평소 온도로 물 목욕을 거절하거나 차단합니다. 4 ° C의 냉장고에 희석을 넣어. 그들은 역가를 해석 및 / 또는 titering의 일부를 다시 실행하는 데 필요한 것입니다.

6. 역가를 결정하고 계산

1. 플레이트에 형성된 플라크를 검사하고 합류 용해 (그림 5A의 예 ^10-2 희석)를 가진 사람을 버린다. 나머지 직렬 희석하는이 (도 5A 습니 5B)를 정확하게 집계 할 수 있도록 충분히 몇 플라크를 생성 한 결정합니다. 이 판 (; 그림 (b) 표 1)에서 플라크의 수를 기록한다.
2. 희석 플라크의 수를 곱하면 다음 즉, 감염된 박테리아의 10 μL가 삼중과의 각각에 대해 수행 된 우물 (에서 촬영 감염된 박테리아의 ML 당 플라크 형성 단위의 번호를 100으로이 숫자를 곱O이 밀리리터 당 개수)를 얻기 위해 100을 곱해야합니다. 이 우물에서 찍은 세 삼중를 통해, (물론 마이크로 플레이트 꺼내 희석 감염 박테리아의 PFU / ㎖), 밀리리터 당 플라크 형성 단위의 수 (PFU)를 평균.
3. 세 가지 복제 우물 탈리의 그랜드 평균을 형성하고이 평균 (표 1)의 표준 오차를 계산한다. 이것은 각각의 친화력 선택 라운드 및 치료 (그림 5C)에 대한 살균 역가의 증가의 모습에 기록 될 것입니다.

7. 플라크 분리, PCR 및 시퀀싱

1. 친화력 선택 4 라운드의 끝에서, 18 개인, 잘 정의 된, 플라크 식민지와, 멸균 파스퇴르 피펫, 이쑤시개를 사용하여, 노란색 피펫 팁 또는 이와 유사한 장치, 핵심이 플라크 titering 판에서를 선택합니다. 튜브 또는 팁을 사용하는 경우, 먼저 트리스 - 염산, 에펜 도르프 튜브 (그림 5D)의 pH를 8.5으로 내부를 젖은.
, 붕 규산염 관 트리스의 과량 방울을 보유하고 있는지 확인 전구를 우울하게하고, 그것은 여전히 압축과 오른쪽 아래의 플라스틱 페트리 접시 (그림 5E)에 잘 격리 된 플라크를 통해 보로 실리케이트 피펫 팁을 누릅니다. 여전히 한천 / 톱 아가로 오스에 피펫 팁과 전구를 해제하고 핵심 빨아 (그림 5 층, 화살표 참조).
2. 간단히 적절한 튜브 (그림 5 세대)와 소용돌이에 100 ㎕의 트리스 - 염산, pH를 8.5로 코어를 추방.
3. 10 분 동안 65 ° C에서이 볼륨에서 20 μl를 가열한다.
4. 10 분 동안 실온에서 벤치 탑 원심 분리기에서 13,000 XG에 가열 된 볼륨을 원심 분리기. T7-UP 및 T7-DOWN 프라이머와 PCR 반응에 사용되는이 나누어지는의 상층 액 3 μL를 가져 가라.
5. 18 고립 된 플라크의 각각에 대해 가열 솔루션은 어닐링 58 ° C의 온도와 35주기를 사용하여 50 ㎕의 PCR 반응을합니다.
6. EAC의 20 μl를 실행1 %에 시간의 반응 (w / v)의 0.015 % (V / V) 에티 디움 브로마이드를 포함하는 아가로 오스 겔. 적절한 눈 보호 및 니트릴 실험실 장갑을 사용하여 트랜스 일루미네이터와 시각화. (주의 : 에티 디움 브로마이드는 강력한 돌연변이입니다.) 젤을 사진과 제대로 오염 물질 처리 (그림 6A 및 6B).
7. 증폭 산물이 빈 벡터에서 단일 제품이며, 그렇지 않은 경우 (제품 W / V) TAE 아가 로스 젤 (1 %에서 100 bp의 근처에 실행;도 6a 및도 6b 화살표), 시퀀싱 템플릿으로 사용하기 위해 나머지 30 μl를 청소합니다. 그렇지 않은 경우 젤 (그림 6B, 플라크 15)에 하나의 제품은 겔에서 가장 눈에 띄는 밴드 (들)을 잘라 키트를 사용하여 겔에서 DNA를 추출합니다.
8. 순서 T7-UP 프라이머를 사용하여 빈 벡터하지 증폭 산물.
9. 링커 팔의 각 순서를 검사하고, 삽입의 시작의 위치 정보에서 결정합니다. 바에게 사용원문 지역 맞춤 검색 도구 (BLAST, 의학의 국립 도서관)이 삽입 프레임에 있는지 여부, 인코딩 된 cDNA의 신원을 확인하고, 만약 그렇다면, 단백질의 어떤 부분이 코딩 서열 (CDS)는로 표시하고 캡처 한 미끼.

Results

(대사 미끼 중독) 파지 표시 단백질과 상호 작용하는 미끼의 능력을 손상 할 수 있다는 것은이 기술에 대한 강력한 음의 컨트롤을 제공합니다. 그것은 미끼가 잘 마이크로 플레이트에 결합 할 때, 그 기능을 유지하고 있는지 확인하는 것이 좋습니다. 이러한 검사는 모두 nonpoisoned 미끼로 회수 상호 작용, 파지 표시 단백질은 안전한 것으로 신뢰를 증가 할 것이다.

각 우물에서 세 삼중를 샘플링 선호도 선택에 필요한 시간과 작업에 상당히 추가 한 번만 샘플링보다 각 웰 내 역가의보다 정확한 견적을 제공합니다. 삼중의 역가의 대부분이 잘 일치하지만, 라운드 네에서 BSA의 복제 2의 삼중는 (표 1) 다양 있습니다. 여러 번 샘플링하여, 최종 잡은 탈리는 피펫 팅의 오차 및 t의 더 정확한 추정치뿐만 취약하지그는 실제 역가이 예상 주위의 변화는 잘 - 투 - 글쎄, (표 1, 그림 5C)를 얻을 수있다.

Discussion

세 복제 웰 실험을 실행하여, 미끼에 결합하는 동일한 단백질의 독립적 취득한 파지들은 동일한 클론 획득 된 CDS 영역의 뉴클레오티드 서열 (즉, 명 차이지만 이러한되었을 경우에도 구별 될 수있다 ) 독립 우물에서 검색. 그렇지 않으면, 미끼에 결합하는 단백질을 코딩 동일한 파지를 구별하기위한 유일한 방법은 그들이 독립적 뉴클레오티드 서열의 일부가 다를 전사 영역을 반대로하는 경우.

친화력 선별 된 파지를 증폭에 사용하기 위해 박테리아를 모두 성장하는 일 FERNBACH 플라스크의 사용은 9 삼각 플라스크를 모니터링하는 것보다 궁합 선택 뒤에 감염에 이르는 세균 성장​​의 덜 바쁜 모니터링을 허용한다. 데워진 삼각 플라스크에, 직전에 감염이 세균을 이동시키고 또한 인해 알테에 서브 라이브러리 역가 불일치를 제거때문에 특정 플라스크별로 세균의 성장에 감염의 다중성에 식량. 따라서, 라운드로 라운드에서 파지 역가의 변화는 우물에 유지 파지의 수와 복제 된 우물 사...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
트립톤	Becton Dickinson Co.
효모 추출물	Becton Dickinson	212750
한천	Becton Dickinson	214010
염화나트륨	Fisher Scientific	BP358-10
Agarose	Research Products International	A20090
차단 시약	EMD Chemicals Inc.	69064
트윈 20	Fisher Scientific	BP337-100
수산화나트륨	Fisher Scientific	BP359-212
도데실황산나트륨	Fisher Scientific	BP166-500
트리스 베이스	Fisher Scientific	BP152-5
클로로포름	Fisher Scientific	BP1145-1
대장균 BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	유전자형: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
암피실린, 나트륨 염	연구 제품 국제	A40040
에티듐 브로마이드	Fisher Scientific	BP102-1
소 혈청 알부민 (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Penta-HIS 1차 항체	Qiagen Inc.	34660
염소 안티 마우스 알칼리 인산염 접합체	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-니트로페닐포스페이	시그마-알드리치 공사	N-7653
T7-UP 프라이머	EMD 화학 Inc.		5 ' - GGAGCTGTCGTATTCCAGTC - 3 '
T7 다운 프라이머	EMD 화학 주식		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
PCR 정화 키트	Qiagen Inc.	28104
Qiaquick 젤 추출 키트	Qiagen Inc.	28706
Big Dye Terminator v3.1 사이클 염기서열분석 키트	, Invitrogen Life Technologies	4336917
Heating Block	Pierce Chemical Co.(Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
96웰 세포 배양 플레이트	Corning	Costar 3590
Isotemp 인큐베이터 오븐	Fisher Scientific	516D
파스퇴르 피펫, 5 ¾ in	Fisher Scientific	13-678-20A
ChromaView Transilluminator	UVP Inc.	TS-15
UV 실드	Oberon	071AF
장갑, 니트릴	Fisher Scientific	19-170-010C
멸균 1.5ml 튜브	USA Scientific Inc	1615-5500
10ml 붕규산 피펫	Fisher Scientific	13-678-25E
붕규산 배양 튜브	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, ELISA 플레이트 리더	Labsystem 및 Flow Laboratories, 핀란드 헬싱키	Type 362