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방법 논문

대규모 유전자 넉다운에

11.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50693

⸱

2013년 9월 25일

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

이 논문에서

요약

dsRNA에는 C.에 공급하면서 엘레 대규모 공급 화면 현재 프로토콜이 변수 최저 효율 결과 유전자 기능을 평가하는 강력한 도구입니다. 우리는 유전자 발현의 높은 효능 및 재현성 넉다운 결과 대규모의 RNAi 수유 화면을 수행하기위한 개선 된 프로토콜을 설명한다.

초록

dsRNA에 표현 벌레 박테리아를 먹이로 RNA 간섭 C. 유전자의 기능을 평가하는 유용한 도구이다 엘레. 유전자의 작은 숫자가 최저 대상 때이 전략은 잘 작동하는 동안, 대규모 공급 화면은 자신의 유틸리티를 제한하는 변수 최저 효율을 보여줍니다. 우리는 이전에 출판 된 RNAi의 최저 프로토콜을 해체하고 감소 최저의 기본 소스는 동물에 공급되는 박테리아에서 dsRNA를 코딩하는 플라스미드의 손실에 기인 할 수 있다는 것을 발견했다. 이러한 관찰을 바탕으로, 우리는 크게 줄이거 나 효율, 높은 처리량 최저를 달성하기 위해 플라스미드 손실을 제거하는 dsRNA에 먹이 프로토콜을 개발했습니다. 우리는이 프로토콜은 C의 아래 강력한 재현 노크를 생산 것을 보여 엘레 신경 등 다양한 조직 유형, 유전자, 그리고 대형 화면에 효율적으로 최저를 허용합니다. 이 프로토콜은 시중에서 dsRNA에 먹이를 사용도서관은 도서관을 복제하고 dsRNA에 화면을 수행하는 데 필요한 모든 단계를 설명합니다. 프로토콜은 정교한 장비의 사용을 필요로하지 않으며, 따라서 어떠한 C. 의해 수행 될 수있다 실험실 엘레 간스.

서론

C. 역사적으로, 유전 화면 엘레 DNA 내에 무작위 돌연변이를 만들 에틸 메탄 술폰산 등의 화학적으로 돌연변이 동물을 처리하여 수행되었다. 돌연변이 동물의 자손 또는 grandprogeny는 그 전시에게 원하는 이상 표현형을 격리됩니다. 표현형의 원인에 대한 책임 돌연변이 후 노동 집약적 매핑 절차를 통해 또는 돌연변이 벌레의 전체 게놈을 시퀀싱에 의해 식별됩니다. 이 그들이 모두 이득 함수 지점 기능 상실 표현형을 초래할 수 웜 게놈 내의 영구 병변을 생성 같은 화학적 돌연변이 스크린을 수행하는 많은 장점이 있지만 매핑 절차가 느리고 비싸다.

이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi)가 중요한 생물 학적 과정에 관련된 유전자를 확인하는 다른 방법을 제공합니다. 이 방법에서, 내생 유전자의 코딩 서열과 일치하는 dsRNA는 웜에 도입된다.dsRNA에이 가이드가 파괴 1을 대상으로 일치하는 내생의 mRNA를 찾아 바인딩하는 역할을 소형 (21 ~ 22 염기) RNA를 생성하기 위해 생체 내에서 처리된다. 이 절차는 비교적 빠른이지만 dsRNA에 오히려보다 DNA의 mRNA를 표적으로하기 때문에, 단지 환원의 기능 표현형이이 방법을 사용하여 관찰된다.

동물에 dsRNA에 도입 dsRNA를 3 동물을 담가, 또는 dsRNA에 4을 표현하는 동물 박테리아를 공급함으로써, dsRNA에 2의 직접 주입에 의해 달성 될 수있다. 동물의 대부분의 세포는 SID-1, dsRNA에 5를 가져올 수있는 횡단 채널을 표현하는 이러한 전달 방법의 각 조직 최저 효과를 일으킬 수 있습니다. 원래시 개별 유전자의 발현을 녹다운하는 역 유전학 방식으로 사용이 급전 라이브러리의 개발은 지금은 대규모 유전자 스크린을 허용한다. 시판하는 dsRNA 라이브러리는 BA를 포함모든 C의 55 % 또는 87 % 중 하나를 나타내는 cterial 클론 elegans의 유전자 6, 7.

불행하게도, 대규모 dsRNAi 공급 화면은 종종 변수 최저 효율 8-10 결과. RNAi에 의한 최저의 절대 레벨이 쉽게 측정되지 않지만, 대형 화면에서 관찰 감소 최저 효율은 RNAi에 의해 열화를 피할 잔류 유전자 특이의 mRNA에 의해 발생되어야한다. 이것은, 차례로, 이러한 화면에 동물에 공급하는 dsRNA 박테리아 플라스미드 손실의 직접적인 결과 일 수있다. 넉다운 효과를 먹인 동물 (11)를 제어하기 위해 비교 될 때 (있는 경우)이 아이디어를지지, 동물은 박테리아의 50 % 만이 표적 유전자의 dsRNA에 대하여을 표현하는, 세균의 혼합물을 공급 극적으로 감소 보여준다. C. 대부분의 유전자로 dsRNAi 화면을 수행 할 때 유전자 최저의 정도는 중요한 문제가됩니다 엘레 haplosufficient이며, 따라서 유전자의 발현은 적어도 50 %의 t에 의해 감소되어야O 기능 상실이 12 표현형의 원인이됩니다.

우리는 대형 스크린을 수행하기 이전에 발행 된 먹이 프로토콜을 사용하고 다른 사람 8-10에서보고 같은 변수 최저의 효과를 발견했다. 가능한 원인에 대한 검색, 우리는 화면에서 동물에 공급되는 박테리아의 약 60 %는 dsRNA에 플라스미드를 잃은 것으로 나타났습니다. 우리는 극적으로 감소 또는 제거 플라스미드 손실을 크게 최저 효율을 향상 도서관 복제 및 검사 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 C.에서 대형 스크린을 수행하기에 적합 엘레하고 시판하는 dsRNA 라이브러리 중 하나 하나를 선별하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 화면 동안 동물에 공급되는 박테리아의 본질적으로 100 % dsRNA에 인코딩 플라스미드를 유지하고 검사를 모든 조직의 기능 표현형의 강력하고 고도로 침투 손실이 발생할 수 있음을 찾을 수 있습니다.

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프로토콜

주 :이 프로토콜은 조직 유형의 다양한 생물학적 과정의 다양한 필수 유전자를 확인하는데 사용될 수있다. 화면 중에 필요한 품질 관리로, 동물은 대상 조직에 RNAi의 효과를 입증 할 수있는 컨트롤 dsRNA를 발현하는 박테리아 공급 모두 긍정적이고 부정적인입니다.

게시 된 다른 공급 프로토콜은 50 ㎍ / ㎖의 암피실린 25 ㎍ / ml의 카르 베니 실린 8-10 하나의 존재에 dsRNA를 발현하는 박테리아를 성장. 우리는 이러한 상황에서 성장 박테리아가 높은 주파수에서 dsRNA에 플라스미드를 잃는 것으로 나타났습니다. 사실, 우리는 박테리아가 암피실린의 매우 높은 농도 (최대 2 ㎎ / ㎖) 박테리아의 50 % 이상에서 하룻밤 성장하는 경우에도 더 이상 플라스미드를 포함하지 않는 것을 발견했다. 카르 베니 실린 성장은 일반적으로 플라스미드의 높은 보존 귀착 동안 25 ㎍ / ml의 플라스미드의 손실을 방지하기에 충분하지 않았다. 대신, 우리는 그 베니 실린의 농도를 발견500 ㎍ / ㎖가 tions 액체 문화와 박테리아 고체 한천 기판 위에 성장 된 때 2 ㎎ / ㎖의 카르 베니 실린이 플라스미드 손실을 차단하도록 요구되었다 성장하는 동안 플라스미드 손실을 차단하기 위해 필요했다.

플라스미드가 보유 넉다운의 성공에 매우 중요하므로 dsRNA에 균이 프로토콜에서 배양 될 때, 단지 베니 실린이 사용된다. 우리는 신중하게 플라스미드를 포함하지 않는 박테리아가 이러한 문화에서 성장하지 않도록하기 위해이 프로토콜에 설명 된 세균의 증식 배양에 사용되는 카르 베니 실린의 농도를 최적화했다. 그러나, 품질 제어 수단으로, 플라스미드 손실은 프로토콜의 여러 단계에서 결정된다. 효율적으로 최저를 보장하기 위해, 각 단계에서의 박테리아의 80 % 이상이 dsRNA에 플라스미드를 포함해야합니다. 프로토콜의 모든 단계에서 박테리아의 20 % 이상이 dsRNA에 플라스미드를 잊어 버렸을 경우, 사용되는 카르 베니 실린의 품질을 확인합니다. 카르 베니 실린이 그것이 사용되는 신선한 일 준비되어야한다. 준비 신선한 베니 실린과 문화를 반복합니다.

1. 플라스미드 손실을 확인하는 방법

  1. 박테리아의 작은 샘플을 제거합니다 (관련된 각 단계에서 설명합니다) 450 ㎕의 멸균 수에 추가합니다.
  2. 철저하게 희석의 솔루션을 혼합, 멸균 물을 사용하여 더욱 1:10 1:100과 1:1000 시리얼 희석을 만들려면이 희석 시료 100 μl를 사용합니다.
  3. LB와 LB AMP 판에 각 희석 100 μl를 확산하고 37 ℃에서 하룻밤이 판을 품다
  4. 다음날, 100, 500 세균의 식민지 사이에 포함 된 LB 플레이트를 식별합니다. (박테리아 같은 희석 함유)이 플레이트 및 대응하는 LB AMP 플레이트에 콜로니의 수를 계산.
  5. 이 집락에서 플라스미드 손실을 결정합니다. 플라스미드가 식 (1)을 사용하여 계산이 포함되지 않고, 효과적인 dsRNA를 다운 노크 15 % 미만이어야한다 박테리아의 비율.

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2. 중복 도서관 플레이트 만들기

개요 : dsRNA를 라이브러리는 96 웰 플레이트에서 10,566 박테리아 클론 된대로, 제조업체 (OpenBiosystems)에서 도착합니다. -80 ° C의 냉동고에 즉시 번호판을 저장합니다. 일본어 라이브러리 플레이트는 중복되고 모든 먹이 화면은 박테리아의 소스로 중복 라이브러리 플레이트를 사용하는 것이다. 그것은 원본을 저장하고 별도의 냉동고에서 라이브러리 판을 복제하는 것이 좋습니다. 하루에 10 라이브러리 판을 복제, 취급의 용이성을 권장합니다하십시오.

  1. -80 ° C 냉동고에서 라이브러리 판 (들)을 제거하고 문화가 계속 동결하는 동안 호일 씰을 제거합니다. 라이브러리 판의 플라스틱 커버를 교체하고 (더 이상 30 분 이상) 실온에서 해동 평평한 판을 설정하지 않습니다.

참고 : 우리는 발견 할 그 중요한 P원래 라이브러리 플레이트의 각 웰에있는 박테리아의 ercentage 플라스미드가 포함되어 있지 않습니다. 라이브러리 박테리아가 귀중한 자원이기 때문에 그러나, 원래의 라이브러리 문화에 플라스미드 손실을 테스트하기 위해 사용하지 않는 것이 좋습니다.

  1. 멀티 채널 피펫을 사용하여 비어있는 96 - 웰 평평한 바닥 중복 플레이트의 각 웰에 라이브러리 중복 매체 150 μl를 추가합니다.
  2. 피펫 팅에 의해 네 개의 100 μL로 설정 멀티 채널 피펫을 사용하여 5 배까지 해동 라이브러리 박테리아 문화를 섞는다. 그런 다음 각각의 혼합 문화의 10 μl를 제거하고 중복 된 판의 해당 우물에 전송할 수 있습니다. 각 전송 피펫 팁을 변경하고 특정 판을 복제하는 라이브러리 판에서 문화를 전달하는 것을 계속한다.
  3. 라이브러리 판의 모든 문화가 전송 된 후, 철저한 밀봉을 보장하기 위해 브레 이어 롤러를 사용하여 새로운 접착제 호일로 원래의 라이브러리 판의 우물을 커버합니다. 접시에 플라스틱 덮개를 교체하고문화 (최소 30 분) 다시 냉동 할 때까지 -80 ° C의 냉동고에 수직으로 배치합니다. 그런 다음 라이브러리 저장 상자에 원래의 라이브러리 판을 이동합니다.
  4. 37 ° C (microshaker, 궤도 3mm 450 RPM)에서 8 ~ 10 시간 동안 평면 중복 라이브러리 판의 문화를 흔들어.
  5. 각 중복 라이브러리 판에 플라스미드 손실을 결정합니다. 우리는 원래의 라이브러리 플레이트의 각 웰에있는 박테리아의 비율이 높은 dsRNA에 플라스미드를 포함하지 않은 것으로 나타났습니다. 이들 박테리아가 중복 된 라이브러리의 성장에 기여하지 않는 것이 중요합니다. 자신의 성장을 방지하기 위하여, 카르 베니 실린의 고농도 라이브러리 듀플리 미디어 (3 ㎎ / ㎖)에 사용된다. 이러한 조건을 사용하여 중복 판의 배양 후 우리는 박테리아의 90 % 이상이 dsRNA에 플라스미드를 포함하는 것으로 나타났습니다. 각 중복 판의 대표적인 문화 우물에서 10 ㎕의 샘플을 제거하고 450 ㎕의 멸균 수에 추가합니다. 이러한 희석 된 샘플을 사용하여, 각 중복 라이브러리 플라스미드 손실을 결정단계 1.1 ~ 1.4에 따라 판. 플라스미드 상당한 손실이 관찰되는 경우 (> 중복 도서관에서 박테리아의 20 %가 플라스미드를 포함하지 않는다), 카르 베니 실린을 사용하여 신선한 배양액을 개작 단계 2.1에서 프로토콜을 반복한다.
  6. 배양 후, 중복 판 우물에 직접 새 호일 접착 시트를 배치하고,이 호일 위에 접시 뚜껑을 놓습니다. -80 ° C의 냉동고 (최소 30 분) 냉동 될 때까지 똑바로 중복 라이브러리 판을 놓습니다. 일단 냉동 장기 보관을위한 중복 도서관 수납 상자에 플레이트를 이동.

3. Omniplates에 도서관의 임시 복사본 만들기

개요 : dsRNA를 화면에 음식을 준비하기 시작, 중복 라이브러리 접시에서 세균 고체 한천 omniplates로 옮겨 밤새 재배하고 있습니다. 고체 매체에 플라스미드 손실을 방지하기 위해, omniplates 2 ㎎ / ㎖에 실린가 포함되어 있습니다. 이 판에 박테리아 기간 동안 사용될 수있다의 경우 1 주일, 더 플라스미드 손실을 보여. 에 일주일 이상 omniplates에 성장 박테리아에서 플라스미드 손실에 대한 검사를하지 않았습니다.

  1. -80 ° C 냉동고에서 중복 라이브러리 판 (들)을 제거하고 문화가 계속 동결하는 동안 호일 씰을 제거한다. 호일을 제거한 후, 플레이트의 플라스틱 커버를 교체하고 (더 이상 30 분 이상) 실온에서 해동 평평한 표면에 중복 된 라이브러리 판을 설정하지 않습니다.
  2. Boekel 96 핀 복제를 소독. 깨끗한 복제의 핀을 증류수로 세척 한 다음 각 사용하기 전에 소독해야한다. , 복제 소독 에탄올 목욕 (파이렉스 접시에 깊은의 3 / 4)에 위치하게 한 후, 분젠 버너를 사용 떨어져 핀을 코팅 에탄올을 레코딩합니다. 불길이 진화하고 반복 할 수 있습니다.
  3. 해동 중복 플레이트의 우물에 살균 복제를 놓고 부드럽게 문화를 자극하기 위해 사용합니다. 문화의 작은 볼륨은 복제의 핀을 준수합니다.
    4. <리> 조심스럽게 중복 플레이트의 우물에서 복제를 제거하고 한천 표면을 관통하지 않도록주의하고, 부드럽게 omniplate의 표면에 (핀 아래)에 배치합니다. 복제의 핀에서 세균이 한천 표면에 전사되도록 3 ~ 4 초 동안 omniplate의 표면에 복제를 남겨주세요.
  4. 복제를 제거하고 세균 배양의 작은 양 (2 ~ 3 μL)은 한천에 흡수 할 수 있습니다. 37 ℃에서 15 ~ 18 시간 동안 반전 omniplates을 품어 이 omniplates 96도 액체 문화를 접종 다음 날 아침에 사용할 수 있습니다. 또한, 하룻밤 세균성 식민지를 포함 omniplates 4 ℃에서 칠일까지 저장할 수 있습니다
  5. 복제 전송 추가 중복 판에, 멸균 물 복제기 팁을 세척하고 에탄올의 복제를 배치하고 이전과 같이, 두 번 타오르는하여 살균 과정을 반복합니다. 일단 소독, 복제는 다음 중복 접시에 사용할 수 있습니다.
    6. omniplates에 하룻밤 배양 후 플라스미드 손실을 결정합니다. 하룻밤 성장 후 omniplates에 세균 콜로니 먹이 화면 식품의 임시 소스가 될 것입니다. 각 콜로니에서 박테리아의 80 % 이상을 dsRNA를 포함하는 것이 중요하다. 박테리아는 액체 배양에 비해 고체 한천 미디어에 더 빠르게 플라스미드를 잃는 경향이있다. 각 콜로니로부터 박테리아의 소량의 멸균 수 1 ㎖를 접종하고 단계 1.1-1.4에 따라 플라스미드 손실을 결정하기 위해이 희석 된 시료를 사용하여 omniplates 두 대표 콜로니위한 플라스미드의 손실을 결정한다. 기대 : 각 식민지에있는 박테리아의 90 % 이상이 dsRNA에 플라스미드를 포함합니다. 중요한 플라스미드 손실이 관찰되는 경우 (> omniplate에 식민지에서 박테리아의 20 %가 플라스미드를 포함하지 않는), 신선한 베니 실린을 사용하여 omniplate 미디어를 리메이크 단계 3.1 프로토콜을 반복합니다.

4. 웜을 공급하는 박테리아의 준비

Overview : 먹이 웜 박테리아가 omniplates에서 박테리아를 사용하여 (96 웰의 형식) 1 ㎖의 액체 배양으로 제조된다. 이 액체 문화 포화 nonlogarithmic 박테리아 문화를 생성하기 위해 밤새 성장하고 있습니다. 밤새 성장은 모든 문화는 박테리아의 비슷한 농도를 포함하고, 따라서 모든 벌레가 음식의 동일한 금액을 공급 될 것이라는 점을 보증한다. 이러한 성장 중에 플라스미드 손실이 관찰 될 수 없습니다.

  1. 반복 피펫 및 50 ㎖를 사용 Combitip 2 ㎖ 깊은 웰 96 웰 플레이트의 각 웰에 세균 성장​​ 배지 1 ㎖를 분주한다.
  2. 3.1-3.6이 핀은 96 세균성 식민지의 각과 접촉하는 것을 확실히하는 단계에서 발생하는 세균성 식민지를 포함 omniplates의 표면에 멸균 복제를 놓습니다.
  3. 조심스럽게 성장 매체에 몰입 할 때까지 핀이 깊은 우물의 측면을 긁어하지 않는 것이 확실하고 깊은 우물 판에 omniplate의 표면에서 복제를 이동합니다. 이동복제 천천히 성장 배지에 균을 제거 할 수있는 깊은 우물 판의 안쪽 벽에 다음과 같은 사각형 모션. 스플래시와 크로스가 우물을 오염하지 않도록주의하십시오.
  4. 제어 우물 : 각 96 웰 깊은 우물 문화 판의 경우 그 예상 최저 표현형에 대한 긍정적 인 제어 역할을하고 다른 음성 대조군으로 빈 dsRNA를 벡터 (pL4440)를 포함하는 박테리아를 잘 추가됩니다 잘 하나에 dsRNA를 발현하는 박테리아를 추가 . 우리는 다시 연속 제어 dsRNA를 발현하는 박테리아는 신선한 남아 플라스미드를 유지하도록 테트라 사이클린 (15 ㎍ / ㎖), 카르 베니 실린 (2 ㎎ / ㎖)을 함유하는 LB 플레이트 상에 일주일에 한 번 박테리아.
  5. 멸균 접종 루프를 사용하면 (복제에 의해 전송 박테리아의 동일한 양에 대한) 제어 판에서 단일 잘 격리 된 식민지를 제거하고 깊은 우물 배양 접시의 빈 잘 접종. 접종 한 우물의 위치를​​ 기록합니다. 또한, 박테리아 C와 루프250 ㎕의 성장 배지를 함유하는 에펜 도르프 튜브에 이동, 볼 텍싱 한 다음 여러 웰에 접종하는데 사용.
  6. 밤새 37 ° C에서 : (3mm 궤도) microshaker에 650 rpm에서 평평한 위치에 깊은 - 웰 플레이트를 흔들어. 문화는 다음날 아침에 포화 될 것입니다. 어쨌든, 이러한 배양에서 사용 베니 실린의 농도는 플라스미드의 손실을 방지한다.
  7. 1 ㎖ 하룻밤 문화에 플라스미드 손실을 결정합니다. 문화가 화면에 벌레 먹이를 직접 사용됩니다. 각 배양에서 세균의 80 % 이상은 dsRNA에 플라스미드를 포함하는 것이 중요하다. 단계 1.1 ~ 1.4에 따라 두 대표 문화에 플라스미드 손실을 결정합니다. 기대 : 각 문화에 박테리아의 90 % 이상이 dsRNA에 플라스미드를 포함합니다. 우리는 포화로 성장도 이러한 하룻밤 문화에서 중요한 플라스미드 손실을 관찰 적이 없다. 플라스미드 상당한 손실이 관찰되는 경우, (> 20 %), 카르 베니 실린 및 신선한 기라하여 성장 배지를 개작단계 4.1에서 프로토콜을 먹는다. 문화는 한 omniplates 미만 1~2주 오래된으로 원래 omniplates에서 다시 시작할 수 있습니다.
  8. 화면을 완료하고 재검사 문화를 시작하기 위해 음식의 소스로 사용할 수있을 때까지 일단 1 ㎖ 문화를 시작하는 데 사용, omniplates 4 ° C에 저장됩니다.
  9. 문화의 하룻밤 배양 한 후, 깊은 우물 판에서 균 배양 150 μl를 제거하고 공급 판의 표면에 배출하는 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 이 웜은 dsRNA를 발현하는 박테리아에 먹이 뚫하지 않으므로 전송하는 동안 한천의 표면을 관통하지 않는 것이 중요합니다. 전송 시간 (그림 1) 4 개의 우물을 수행 할 수 있습니다. 이렇게하려면 (행 당 4 우물이 공급 판에 있기 때문에) 멀티 채널 피펫의 모든 제 3 채널에 피펫 팁을 배치합니다. 4 우물의 각 세트가 전송 된 후, 새로운, 멸균 피펫 팁을 변경합니다. 각 96 깊은 - 웰 배양 플레이트 (96) 조언이 필요합니다8 ~ 12 잘 먹이 접시에 전송.
  10. 박테리아가 한천에 흡수 할 수 있도록 저장소는 어두운 야간에 수직으로 판을 시드.

5. 생성 L1은 C를 체포 엘레 애벌레

개요 : L1-체포 애벌레는 dsRNA에 먹이 접시에 동기화 된 웜 문화를 시작하는 데 사용됩니다. 이 유충은 건강한 계란을 분리 임신하는 성인 인구를 표백하고 계란이 음식없이 S-완전한 미디어에서 부화 할 수 있도록함으로써 생성된다. 음식의 부재에서 부화 L1 유충 L1 애벌레의 동기 인구를 생성, 발전을 체포합니다. 이 굶주린 동물이 시간이 지남에 따라 병이 폐기해야합니다 같이 화면 동안, 매주 신선한 L1-체포 애벌레를 준비합니다. LIN-15B의 돌연변이가 권장되며, 신경 세포의 화면에 에리-1 dsRNA에 공급 변형에 사용되는 동물의 유전 적 배경의 선택은 응용 프로그램에 따라 달라질 수 있습니다.

  1. 10-20 L4 라를 선택OP50 박테리아의 잔디를 포함하고 번호판까지 6~7일 대기 여섯 별도의 NGM 플레이트에 rvae 많은 갓 계란을 마련하고 임신하는 성인이 포함되어 있습니다.
  2. 각 판의 표면에 물 3 ㎖를 추가하여 접시에서 동물과 계란을 제거하고 물에 각 판의 표면에서 계란, 박테리아, 동물을 제거하기 위해 장갑을 낀 손가락을 사용합니다. 세균 잔디에 특별한주의를 기울이고, 판의 모든 영역을 커버해야합니다. 유리 피펫을 사용하여 각 플레이트에서 물, 박테리아, 벌레와 알을 제거하고 하나의 멸균 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다.
  3. 남아있는 세균, 벌레와 알을 제거하기 위해 표면을 가로 질러 아래로 pipetting, 각 판의 표면에 물을 또 다른 3 ML을 추가합니다. 50 ML 원뿔 관에이 볼륨을 추가합니다.
  4. 테이블 탑 원심 분리기에서 1 분 동안 1,500 rpm에서 원뿔 튜브를 스핀. 웜과 계란은 튜브의 바닥에 펠렛해야하며 박테리아 현탁 유지한다. 조심스럽게 4 ㎖를 제외한 모든 대기음튜브 펠렛 웜과 계란을 피하기 위해 확인되는 액체.
  5. 잔류 물에 웜 펠렛을 재현 탁하고 유리 피펫을 사용하여 멸균 15 ML 원뿔 관에 전송할 수 있습니다. 멸균 물 10 ㎖에 볼륨을 가져와.
  6. 이전 1 분 동안 1,500 rpm으로 회전. 웜 / 계란 펠렛을 방해하지 않도록 200 ㎕의 물을 떠나 뜨는을 대기음.
  7. 벌레와 계란을 씻어 추가 박테리아를 제거하기 전에 회전하는 원뿔에 10 ㎖의 물을 추가합니다.

참고 :에서가 5.8-5.11 웜 단계와 계란 표백제 용액에 노출되어 있습니다. 표백제는 벌레를 파괴하고 상대적으로 무사히 알을 떠날 것입니다. 계란이 너무 오래 표백제 용액에 남아있는 경우, 이들은 또한 파괴 될 것이다. 계란이 남아보다 10 분 표백제에 노출하지 않는 것이 확신 할 표백제 단계 5.8에 추가 된 타이머를 설정합니다.

  1. 상층 액 200 ㎕를 제외하고 모두 제거, 다시 펠릿을 피하고, 다음 10 추가ML 표백제 용액과 타이머를 시작합니다.
  2. 때때로 반전에 의해 혼합, 3 ~ 4 분 동안 표백 용액에 웜 및 알​​을 품다. 그런 탁상 원심 분리기에서 45 초 동안 1,500 rpm으로 회전. 튜브의 바닥에 펠릿을 찾습니다, 원래 펠렛보다 작고 컴팩트해야하며, 노란색 외관에 걸릴 수 있습니다.
  3. 펠렛을 방해하지 않도록 뒤에 200 μl를 떠나는 표백제 솔루션을 대기음.
  4. 또 다른 10 ㎖ 신선한 표백제 솔루션을 추가하고 이전과 같이 반전. 타이머가 10 분을 읽을 때, 다시 회전 및 표백제 솔루션을 대기음, 뒤에 200 μl를 떠나 빠르게 10 ㎖에게 멸균 물을 추가합니다. 해부 현미경 솔루션을 검사합니다. 애벌레와 성인의 대부분은 뒤에 주로 계란을 떠나, 표백제 용액에 용해해야합니다.
  5. 45 초 동안 이전과 스핀, 다시 펠렛을 방해하지 않도록 뜨는을 대기음. 이 펠렛은 주로 계란을 포함해야합니다 매우 느슨한 될 것입니다.
  6. anot 추가그녀의 10 ㎖의 물은 뒤 물을 조금 남겨 스핀과 대기음을 혼합하는 반전. 그것은 극력 표백제 용액을 제거하는 것이 중요하다.
  7. , 원뿔 튜브에 4 ㎖의 S-완전한 미디어를 추가 계란을 재현 탁하고 멸균 된 100 ㎖의 삼각 플라스크에 옮긴다. 다만 충분히 빨리 플라스크의 내용이 소용돌이하게 이동 통 세트에 20 ° C 배양기에서 플라스크를 놓습니다. 이것은 그들이 부화 때 L1 유충을 지원하기 위해 충분한 통풍을 제공 할 것입니다. 15 시간 안에 계란의 모든 L1 체포 애벌레의 동기 인구를 생산 부화한다.

체포 L1 유충은 화면 동안 매주 신선한해야한다. 첫 번째 일괄 처리가되었습니다되면, 이후의 일괄 처리 (OP50 100 μL 하룻밤 문화를 포함) 4 개의 표준 시드 6cm 판의 각 (이전 주에 배치부터) 500 체포 L1 애벌레를 추가하여 시작하고, 20에서 배양 할 수있다 4 일 동안 C를 °. 네 번째 날 플레이트를 포함해야많은 계란과 임신하는 성인과 더 많은 동기 L1 유충에 신선한 계란을 준비하기 위해 표백 될 수있다.

6. 급지 판에 체포 L1 유충을 전송

개요 : dsRNA에 화면을 수행하려면, 20 ~ 30 L1 체포 애벌레는 dsRNA에 먹이 접시에 전송됩니다. 동물 2 ~ 3 일 dsRNA를 발현하는 박테리아에 공급 한 후 같은 애벌레 체포 또는 치사 등의 초기 넉다운 효과가 관찰됩니다. 진행 화면에 따라 원하는 표현형은 먹이 접시에 놓인 원고 동물 (P0 동물) 또는 자신의 자손 (F1 동물)에 하나 관찰 할 수있다. 표현형의 프리젠 테이션은 그 발현 넉다운되는 유전자와 그 유전자가 요구되는 발전 동안의 시간에 의해 코드되는 단백질의 perdurance 포함한 변수의 수에 의존 할 것이다. 만 20 ~ 30 동물과 dsRNA에 수유 문화를 시작하는 것은 전에 P0과 F1 모두 표현형의 관찰을 허용해야imals는 식품 소스를 배출.

쉽게, 먹이 접시에 20 ~ 30 동물을 전송 먼저 확인하려면 L1의 농도는 체포 L1 문화에있는 동물을 체포했다.

  1. 동물을 배포 할 수 체포 L1 애벌레가 들어있는 삼각 플라스크를 섞는다.
  2. 4-5에 시드되고 6cm의 NGM 플레이트에 10 ㎕의 분취 및 드롭 현명한 장소를 제거는 모든 미디어가 피펫에서 추방되어 있는지 확인하는 판의 중심을 아래로 떨어진다.
  3. 피펫 팁의 끝을 사용하여 플레이트의 직경에 걸쳐 액체의 하나의 연속 선을 형성하도록 웜 현탁액의 점 확산.
  4. 액체가 플레이트로 흡수하고 동물은 분산 전에 해부 현미경을 사용하여, 액체 라인의 일단에서 시작하여 타 단부까지 계속 모든 동물을 센다. 이것은 어떤 동물이 누락되지 않았는지 확인하기 위해 해부 범위의 지속적인 재 집중을 필요로 할 수있다.
  5. 세 개의 분리 된 10 μL에 대해이 단계를 반복분취 량 및 웜 현탁액 μL 당 웜의 평균 수를 결정하고 삼각 플라스크에 직접 수를 기록하는 세 개의 숫자를 평균.

7. 먹이 화면 시작

개요 : dsRNA에 화면을 시작하려면, 20-30 체포 L1 유충은 dsRNA를 발현하는 박테리아의 얇은 잔디를 포함하는 12 - 웰 공급 플레이트의 각 웰에 추가됩니다. 공급 플레이트는 표준 선충 성장 미디어 (NGM)를 포함하고 500 ㎍ / ml의 카르 베니 실린 (플라스미드의 손실을 방지하기 위해) 및 1mM의 IPTG (dsRNA를 발현을 유도하는)로 보충된다. 동물은 20 ℃에서 몇 일 동안 먹이를 개발하는 데 사용할 수 있습니다 F1 화면을 수행 할 때 P0 화면 6 ~ 7 일 수행 할 때 동물에 대한 두 가지 일반적인 먹이는식이 요법은 3 일입니다. 공급의 지속 시간은, 그러나, 화면 상 모색 특정 표현형에 따라 변화 될 수있다.

  1. 그래서 준비를 L1 체포 유충과 멸균의 서스펜션을 사용하여2000 웜 / ㎖를 함유 lution. 각 12도 먹이 판은이 웜 현탁액 120 μl를 필요로 할 것이다. 동물의 고른 분포를 보장하고 피펫의 멸균 저수지에 동물을 전송하기 위해 철저하게 섞는다.
  2. 모든 세 번째 위치에있는 팁을 설정 한 멀티 채널 피펫을 사용하여 직접 먹이 접시의 박테리아 잔디 위에 전송 웜 용액 10 μL (그림 1 참조). 벌레가 dsRNA를 발현하는 박테리아에 먹이 한천로 뚫하지 않으므로, 한천의 표면을 관통하지 않도록주의하십시오.
  3. 벌레가 빠르게 정착, 먹이 판 매 2 행 후 (부드럽게에 대해서는 슬로 싱에 의해) 저수지 웜 솔루션을 리믹스. 모든 먹이 접시 벌레가 될 때까지 웜 현탁액을 분배 계속합니다. 각 웰에 20 ~ 30 벌레를 받고 있는지 확인하기 위해 해부 범위에서 초기에 몇 우물을 검사합니다.
  4. 20 ° C 배양기에서 가습 상자에 똑바로 저장 판. 다음 날, WO 후RM 서스펜션 플레이트에 흡수 한, 판을 거꾸로하고 20 ℃에서 담배 저장 상자로 돌아 이 판에 동물 (P0의 표현형에 대한) 3 일 후에 관찰하고 다시 육일 후 (F1 표현형의 경우) 할 수 있습니다.

주의 : 웜 성장 7 일 이후에 먹이 접시에 남아있는 박테리아는 플라스미드 손실을 테스트 한 거의 100 % dsRNA에 플라스미드를 유지했다.

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결과

P0의 최저 표현형은 dsRNA에 세균을 표현하는 동물 먹이를 2 ~ 3 일 후에 나타나기 시작합니다. 일부 초기 표현형은 유충의 체포와 치사를 포함하고있는 모든 공급 우물 2 ~ 3 %가 관찰되어야한다. 이 같은 표현형은 F1 세대의 동물에서 관찰됩니다. 부화에 실패 F1 계란의 존재는 또 다른 일반적인 F1 표현형, 그리고 함께,이 세 가지 표현형은 F1 화면에있는 우물의 약 10 %에서 관찰됩니다.

우리는 P0과 F1 표현형 모두 조직 유형의 다양한 표현 몇개의 유전자 녹다운의 효과를 조사하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜을 사용했다. 우리는 또한 신경 조직에 최저의 효과를 테스트하고 싶었 기 때문에, 우리는 에리-1을 사용, 우리의 스크린에서 LIN-15B의 돌연변이. 에리-1 및 LIN-15B의 돌연변이는, RRF-3의 돌연변이와 함께, RNAi의 8,13,14에 향상...

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토론

우리는 C.에 대형 화면을 수행하기 위해 시판하는 dsRNA 수유 라이브러리를 사용하는 프로토콜을 기술했다 엘레. 우리는 라이브러리를 복제하고 효과적으로 사용하는 모든 지침을 제공합니다. 우리는이 방법은 동물의 조직에서 다른 여러 생물학적 과정에 관여하는 유전자를 식별 할 수 있다는 것을 보여준다. 우리가 여기에서 설명하는 표현형 (UNC, EGL, 그리고 DPY) 쉽게 관찰 할 수 있지만,이 프로토콜은 거의 모든 생물학적 과정에 필요한 유전자를 검색에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 웜 (25) 신경 전달에 필요한 유전자를 확인하기 위해 프로토콜을 사용 해왔다. 동물 dsRNA를 표현 박테리아에 공급하면 (일반적으로 P0 스크린, F1 화면에 대한 6~7일을위한 3 일)은, 그들은 먹이 판에서 제거하고 행동 표현형에 대한 검사를 할 수 있습니다.

플라스미드 손실 :

...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 건강 MH097163의 국립 연구소에서 기금에 의해 지원되었다. 일부 균주 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40-OD010440)에 의해 투자 된 CGC에 의해 제공되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Reagent/Material
96-well Falcon flat bottom plate Fisher Scientific353072멸균
접착 호일USA Scientific2923-0100
Nunc 옴니플레이트Fisher Scientific267060
2.0ml 깊이 96-웰 폴리프로필렌 MasterblockUSA Scientific5678-0285
딥 웰 플레이트용USA Scientific5665-6101
50ml 콤비팁USA Scientific4796-5000개별 포장
ReservoirUSA Scientific2977-8500오토클레이브 12
웰 플레이트USA ScientificCC7682-7512개별 포장
dsRNA 공급 라이브러리OpenBiosystemsRCE1181스토어 -80 ° C
암피실린피셔 사이언티픽BP1760-5
테트라사이클린피셔 사이언티픽BP912-100
카르베니실린은배송에 2-4주를 허용합니다 www.biochemicaldirect.com
Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A Affymetrix10906웜 플레이트
Equipment
Brayer rollerUSA Scientific9127-2940
B– kel 96-pin replicatorFisher Scientific05-450-9오토클레이브
가능한 마이크로쉐이커Thomas Scientific1231A933 mm 궤도
12 채널 다채널 피펫 (0.5-10 μ l)USA Scientific7112-0510
12채널 멀티채널 피펫 (30-300 μ l)USA Scientific7112-3300
리피터 플러스 수동 피펫터USA Scientific4026-0201
오토클레이브 뚜껑 용

참고문헌

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