Method Article

대규모 유전자 넉다운에 C. 엘레 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용

DOI:

10.3791/50693

⸱

September 25th, 2013

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

dsRNA에는 C.에 공급하면서 엘레 대규모 공급 화면 현재 프로토콜이 변수 최저 효율 결과 유전자 기능을 평가하는 강력한 도구입니다. 우리는 유전자 발현의 높은 효능 및 재현성 넉다운 결과 대규모의 RNAi 수유 화면을 수행하기위한 개선 된 프로토콜을 설명한다.

Abstract

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dsRNA에 표현 벌레 박테리아를 먹이로 RNA 간섭 C. 유전자의 기능을 평가하는 유용한 도구이다 엘레. 유전자의 작은 숫자가 최저 대상 때이 전략은 잘 작동하는 동안, 대규모 공급 화면은 자신의 유틸리티를 제한하는 변수 최저 효율을 보여줍니다. 우리는 이전에 출판 된 RNAi의 최저 프로토콜을 해체하고 감소 최저의 기본 소스는 동물에 공급되는 박테리아에서 dsRNA를 코딩하는 플라스미드의 손실에 기인 할 수 있다는 것을 발견했다. 이러한 관찰을 바탕으로, 우리는 크게 줄이거 나 효율, 높은 처리량 최저를 달성하기 위해 플라스미드 손실을 제거하는 dsRNA에 먹이 프로토콜을 개발했습니다. 우리는이 프로토콜은 C의 아래 강력한 재현 노크를 생산 것을 보여 엘레 신경 등 다양한 조직 유형, 유전자, 그리고 대형 화면에 효율적으로 최저를 허용합니다. 이 프로토콜은 시중에서 dsRNA에 먹이를 사용도서관은 도서관을 복제하고 dsRNA에 화면을 수행하는 데 필요한 모든 단계를 설명합니다. 프로토콜은 정교한 장비의 사용을 필요로하지 않으며, 따라서 어떠한 C. 의해 수행 될 수있다 실험실 엘레 간스.

Introduction

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C. 역사적으로, 유전 화면 엘레 DNA 내에 무작위 돌연변이를 만들 에틸 메탄 술폰산 등의 화학적으로 돌연변이 동물을 처리하여 수행되었다. 돌연변이 동물의 자손 또는 grandprogeny는 그 전시에게 원하는 이상 표현형을 격리됩니다. 표현형의 원인에 대한 책임 돌연변이 후 노동 집약적 매핑 절차를 통해 또는 돌연변이 벌레의 전체 게놈을 시퀀싱에 의해 식별됩니다. 이 그들이 모두 이득 함수 지점 기능 상실 표현형을 초래할 수 웜 게놈 내의 영구 병변을 생성 같은 화학적 돌연변이 스크린을 수행하는 많은 장점이 있지만 매핑 절차가 느리고 비싸다.

이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi)가 중요한 생물 학적 과정에 관련된 유전자를 확인하는 다른 방법을 제공합니다. 이 방법에서, 내생 유전자의 코딩 서열과 일치하는 dsRNA는 웜에 도입된다.dsRNA에이 가이드가 파괴 1을 대상으로 일치하는 내생의 mRNA를 찾아 바인딩하는 역할을 소형 (21 ~ 22 염기) RNA를 생성하기 위해 생체 내에서 처리된다. 이 절차는 비교적 빠른이지만 dsRNA에 오히려보다 DNA의 mRNA를 표적으로하기 때문에, 단지 환원의 기능 표현형이이 방법을 사용하여 관찰된다.

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Protocol

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주 :이 프로토콜은 조직 유형의 다양한 생물학적 과정의 다양한 필수 유전자를 확인하는데 사용될 수있다. 화면 중에 필요한 품질 관리로, 동물은 대상 조직에 RNAi의 효과를 입증 할 수있는 컨트롤 dsRNA를 발현하는 박테리아 공급 모두 긍정적이고 부정적인입니다.

게시 된 다른 공급 프로토콜은 50 ㎍ / ㎖의 암피실린 25 ㎍ / ml의 카르 베니 실린 8-10 하나의 존재에 dsRNA를 발현하는 박테리아를 성장. 우리는 이러한 상황에서 성장 박테리아가 높은 주파수에서 dsRNA에 플라스미드를 잃는 것으로 나타났습니다. 사실, 우리는 박테리아가 암피실린의 매우 높은 농도 (최대 2 ㎎ / ㎖) 박테리아의 50 % 이상에서 하룻밤 성장하는 경우에도 더 이상 플라스미드를 포함하지 않는 것을 발견했다. 카르 베니 실린 성장은 일반적으로 플라스미드의 높은 보존 귀착 동안 25 ㎍ / ml의 플라스미드의 손실을 방지하기에 충분하지 않았다. 대신, 우리는 그 베니 실린의 농도를 발견500 ㎍ / ㎖가 tions 액체 문화와 박테리아 고체 한천 기판 위에 성장 된 때 2 ㎎ / ㎖의 카르 베니 실린이 플라스미드 손실을 차단하도록 요구되었다 성장하는 동안 플라스미드 손실을 차단하기 위해 필요했다.

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Results

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P0의 최저 표현형은 dsRNA에 세균을 표현하는 동물 먹이를 2 ~ 3 일 후에 나타나기 시작합니다. 일부 초기 표현형은 유충의 체포와 치사를 포함하고있는 모든 공급 우물 2 ~ 3 %가 관찰되어야한다. 이 같은 표현형은 F1 세대의 동물에서 관찰됩니다. 부화에 실패 F1 계란의 존재는 또 다른 일반적인 F1 표현형, 그리고 함께,이 세 가지 표현형은 F1 화면에있는 우물의 약 10 %에서 관찰됩니다.

우리는 P0과 F1 표현형 모두 조직 유형의 다양한 표현 몇개의 유전자 녹다운의 효과를 조사하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜을 사용했다. 우리는 또한 신경 조직에 최저의 효과를 테스트하고 싶었 기 때문에, 우리는 에리-1을 사용, 우리의 스크린에서 LIN-15B의 돌연변이. 에리-1 및 LIN-15B의 돌연변이는, RRF-3의 돌연변이와 함께, RNAi의 8,13,14에 향상.......

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Discussion

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우리는 C.에 대형 화면을 수행하기 위해 시판하는 dsRNA 수유 라이브러리를 사용하는 프로토콜을 기술했다 엘레. 우리는 라이브러리를 복제하고 효과적으로 사용하는 모든 지침을 제공합니다. 우리는이 방법은 동물의 조직에서 다른 여러 생물학적 과정에 관여하는 유전자를 식별 할 수 있다는 것을 보여준다. 우리가 여기에서 설명하는 표현형 (UNC, EGL, 그리고 DPY) 쉽게 관찰 할 수 있지만,이 프로토콜은 거의 모든 생물학적 과정에 필요한 유전자를 검색에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 웜 (25) 신경 전달에 필요한 유전자를 확인하기 위해 프로토콜을 사용 해왔다. 동물 dsRNA를 표현 박테리아에 공급하면 (일반적으로 P0 스크린, F1 화면에 대한 6~7일을위한 3 일)은, 그들은 먹이 판에서 제거하고 행동 표현형에 대한 검사를 할 수 있습니다.

플라스미드 손실 :

.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 건강 MH097163의 국립 연구소에서 기금에 의해 지원되었다. 일부 균주 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40-OD010440)에 의해 투자 된 CGC에 의해 제공되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent/Material
96-well Falcon flat bottom plate Fisher Scientific353072멸균
접착 호일USA Scientific2923-0100
Nunc 옴니플레이트Fisher Scientific267060
2.0ml 깊이 96-웰 폴리프로필렌 MasterblockUSA Scientific5678-0285
딥 웰 플레이트용USA Scientific5665-6101
50ml 콤비팁USA Scientific4796-5000개별 포장
ReservoirUSA Scientific2977-8500오토클레이브 12
웰 플레이트USA ScientificCC7682-7512개별 포장
dsRNA 공급 라이브러리OpenBiosystemsRCE1181스토어 -80 ° C
암피실린피셔 사이언티픽BP1760-5
테트라사이클린피셔 사이언티픽BP912-100
카르베니실린은배송에 2-4주를 허용합니다 www.biochemicaldirect.com
Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A Affymetrix10906웜 플레이트
Equipment
Brayer rollerUSA Scientific9127-2940
B– kel 96-pin replicatorFisher Scientific05-450-9오토클레이브
가능한 마이크로쉐이커Thomas Scientific1231A933 mm 궤도
12 채널 다채널 피펫 (0.5-10 μ l)USA Scientific7112-0510
12채널 멀티채널 피펫 (30-300 μ l)USA Scientific7112-3300
리피터 플러스 수동 피펫터USA Scientific4026-0201
오토클레이브 뚜껑 용

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mello, C. C., Conte, D. Jr Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  2. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Tabar....

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RNA InterferenceC elegansdsRNA FeedingPlasmid LossGene KnockdownHigh ThroughputWorm FeedingPhenotypic ScreeningBacterial LibraryTissue Specificity

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