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방법 논문

지방 조직 면역 세포의 분리

36.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50707

⸱

2013년 5월 22일

 ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine

이 논문에서

요약

지방 조직 (AT)는 강력한 면역 세포 활성화와 상호 작용의 사이트입니다. 면역 시스템의 거의 모든 세포는 AT의 존재와 그 비율은 비만에 의해 변경됩니다. 면역 세포 인구 AT의 적절한 분리, 정량 및 특성은 immunometabolic 질병에서 자신의 역할을 이해하는 데 중요하다.

초록

비만 설치류와 인간의 지방 조직의 증가 식세포 침윤 (AT)의 발견은 로컬 및 전신 인슐린 저항 면역 세포 공헌에 대한 관심 강화하게되었다. 엎드려서 비만 AT 다른 면역 세포 집단의 분리 및 정량 지금 immunometabolism 실험실에서 일반적으로 활용 기법, 아직 극도의주의를 얻을 데이터가 안정적이고 해석되도록 기질 혈관 세포의 분리 및 유동 세포 계측법 분석을 모두 수행해야 . 이 비디오에서 우리는, 말하다 소화와 면역 세포가 풍부한 기질 혈관 부분을 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 후, 우리는 항체 라벨 식세포와 T 림프구 방법과 유동 세포 계측법 실험에서 그들에 제대로 게이트하는 방법을 보여줍니다. 저지방 먹이 엎드려서 고지방 먹이 비만 쥐에서 대표 유동 세포 계측법 플롯이 제공됩니다. 이 분석의 중요한 요소는 어떻게 항체를 사용하는 것입니다대 식세포 AT 자연 autofluorescent중인 채널뿐만 아니라, 적절한 보상 컨트롤의 사용 형광 없습니다.

서론

역사적으로, 지방 조직 (AT)는 에너지 균형에 대한 응답으로 신축 지질 스토리지의 불활성 기관으로 조회되었습니다. 우리는 지금 AT 적극적으로 직접 먹이 행동과 조직의 포도당 항상성에 영향을 미치는 호르몬의 숫자를 분비 동적 내분비 기관을 나타내는 것을 알 수 있습니다. 또한, 지난 10 년 동안 각막 혈관 분획 (SVF)뿐만 아니라 항상성에 그들의 공헌 AT에 거주하는 면역 세포의 다양한 인구에 대한 증가하는 감사가있다.

1964 1 Rodbell에 의해 설명 된 지방 세포와 SVF는 콜라게나 다이제스트를 사용하여 AT를 분리하는 기능은 차등 원심 분리에 의해 따랐다. 콜라게나 II는 대부분 지방 세포의 인슐린 수용체 1의 보수에 의한 지방 세포와 SVF 분리하는 데 사용됩니다. AT의 초기에, 효소 분획은 주로 adipo을 연구하기 위해 고용되었다신진 대사를 cyte 및 preadipocytes를 분리 할 수​​ 있습니다. 더 최근에, 흐름 cytometers의 광범위한 가용성과 상업적으로 이용 가능한 형광 - 복합 항체의 계속 증가와 함께이 기술은 면역 세포 AT의 특성을 촉진했다.

AT 염증 면역 세포의 존재가 이전에이 설명되어 있었지만, 와이즈 버그 등으로 정액 논문. 그리고 쑤 하였다. 출판은 2003 년에 염증성 사이토 카인을 분비하고 AT 별 및 조직 인슐린 저항성 3,4와 연관 비만 식세포 AT의 축적 (현금 인출기)을 문서화하는 첫번째이었다. 이러한 관찰은 연구의 새로운 분야의 기초 최근에, "immunometabolism,"10 신조어로 제공하고 돌기 세포 6, 비만 세포 7, T 세포 8 등 다양한 면역 세포 인구를, 연루 연구에 의해 미행 당하고있다 -10, B 세포 11, NKT 세포 12, 호산구 13, 및 호중구 비만 관련 인슐린 저항의 개발에 14,15.

이 문서의 목적은 SVF AT의 세포를 분리하고 현금 인출기의 특성 및 유동 세포 계측법을 통해 T 세포 AT에 사용되는 콜라 다이제스트 기술에 대한 자세한 설명을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 AT 마우스에 최적화되어 있지만, 시청자는 16 AT 인간이 기술의 최적화에 대한 광범위한 세부 정보를 제공하는 우수한 기사를 읽고 혜택을 누릴 수 있습니다. 이 문서의 대상은 제한된 경험 AT 마우스 작업 및 유동 세포 계측법을 수행하기에 수사관을 포함합니다. 시간과 자원을 가진 세포 수율과 생존의 균형을위한 몇 가지 실제적인 고려 사항은 면역 세포 인구 AT 특성화뿐만 아니라 최적의 유동 세포 계측법 컨트롤로 표시됩니다. 우리의 프로토콜뿐만 아니라, 독자 referr 있습니다적절한 컨트롤과 보상 17를 포함하는 유동 세포 계측법의 기술적 측면의 일부 훌륭한 토론 바수 등.의 최근 조브 기사에 에드.

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프로토콜

1. 시약 및 소모품

앞서 실험 프로토콜을 시작하려면 다음 시약을 준비 :

  1. 70 % 에탄올
  2. 1X PBS
  3. 1X DPBS은 (칼슘과 마그네슘 제외) 0.5 % BSA가 첨가
  4. FACS 버퍼 : 1X DPBS (칼슘과 마그네슘 제외), 2 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % FCS
  5. ACK 버퍼 : 150 MM의 NH 4 망할 CIA, 10 MM KHCO 3, 물에 0.1 밀리미터 나 2 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)

2. 지방 조직의 수확 및 준비

  1. 각 기관에 특정한 IACUC 승인 된 절차에 따라 쥐를 안락사.
  2. 철저하게 70 % 에탄올로 모피 젖은.
  3. 검상 돌기 프로세스의 수준 (흉골의 하부)에서 절개를하고 모든 주요 혈관을 절단되지 않도록주의, 심장을 노출 흉강을 엽니 다.

참고 :이 시점에서만큼 진동판이 그대로 유지하는 것도 도움이 그 것이다가능한 혈액을 허용하고 흉강에서 흘러 관류하는 흉곽의 오른쪽의 노치를 잘라합니다.

  1. 혈액을 허용하고 순환 시스템을 탈출하기 위해 관류하는 우심방 클립.

참고 : AT 비만 쥐, 과도한 심낭을 처리 할 때 심장에 대한 액세스를 허용하기 위해 제거해야 할 수도 있습니다.

  1. 집게와 함께 마음을 잡고 조심스럽게 정점을 통해 좌심실에 바늘을 삽입합니다. 천천히 15 ML 멸균 PBS와 마우스를 붓는다.

참고 : 폐 작성하고 확장하기 시작하면 혈류의 속도를 줄입니다.

  1. 복강을 열고있는 성선 조직을 피하기 위해주의를 사용하여 perigonadal 지방 패드를 제거합니다.
  2. 지방 패드를 배치하는 것은 0.5 % BSA가 첨가 2 ML 1X DPBS을 (마그네슘 또는 칼슘없이) 포함 얼음에 보트를 달아 정밀한 조각으로 AT를 말하다.

참고 : 당 AT의 양을 제한 1.2 g에 배를 무게. AT의 양이 1.2 g을 초과하는 경우, 두 개의 무게 보트 사이에 균등하게 나눕니다.

  1. 얼음에 샘플 AT 유지하고 0.5 % BSA, 10 MM 염화칼슘 2, 4 MG / ML 콜라, 유형 II와 보충 1X DPBS로 구성된 샘플을 당 ML 콜라 다이제스트 솔루션을 준비합니다.

3. 콜라게나 소화

  1. 균질를 따르고, 1 ML의 DPBS (0.5 % BSA) 3 ML 콜라 II 다이제스트 솔루션 보트의 무게를 세척하여 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다.
  2. 20 분 37 회전 흔드는 (200 RPM) ° C에서 균질 품다.
  3. 얼음에 원뿔 튜브와 장소에 10 ML의 DPBS를 (0.5 % BSA)를 추가합니다.
  4. 10 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 여러 번 균질 씹다, 새로운 50 ML 원뿔 관에 100 μm의 필터를 통해 세포 현탁액을 전달합니다.
  5. 4 & D에서 10 분 500 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기예를 들어, C.
  6. 가만히 따르다 뜨는을 Resuspend SVF 세포 펠렛 3 ML ACK 버퍼에 적혈구의 오염을 용해합니다.
  7. 4시 10 분 500 XG에 12 ML의 FACS 버퍼와 원심 분리기 세포 현탁액을 추가 ° C.
  8. FACS 버퍼에서 가만히 따르다 뜨는을 Resuspend SVF 세포 펠렛.

참고 : 세포 펠렛은 50 ML 원뿔 튜브의 바닥을 커버하는 경우, 0.5 ML 외과 버퍼를 사용 인치 resuspend을하는 방법에 많은 FACS 버퍼에 대한 가이드로 세포 펠렛의 크기를 사용하고, 그렇지 않은 경우 0.25-0.5에 resuspend을 ML.

  1. 장소 얼음 샘플 및 혼합 40 μL FACS 버퍼 50 μL 판 블루 용액 (0.2 %), 10 μL 세포 현탁액으로 세포 계수에 대한 각 시료 1:10으로 희석 분주을 준비합니다.
  2. 판 블루 배제에 따라 가능한 세포를 계산하고 5-10 X 10 6 세포 / ML의 최종 농도로 세포 현탁액을 희석.

4. 세포 표면 항원 염색

  1. 0.5 μg/10 6 세포의 최종 농도 항 - 마우스 CD16/CD32 항체 (FC 블록)을 추가하고 10 분 동안 얼음에 품어.
  2. 전송 샘플 (≥ 10 6 세포) 12 X 75mm의 폴리스티렌 원형 바닥 튜브. 현금 지급기와 T 세포를 분석하면 별도의 튜브를 준비하고, 필요한 보상 및 수정 형광 뺀 (FMO) 컨트롤을 수용하기 위해 튜브의 적절한 수를 준비하는 여분의 세포를 결합합니다.

참고 : 예를 들어, F4/80 및 CD11b, 다음과 같은 보상 및 FMO 컨트롤에 따라 현금 인출기의 비율을 정량화 할 때하는 준비를해야합니다 :

- 흠 (세포)

- DAPI 또는의 propidium 요오드화 물의 (PI) 단일 얼룩 (세포, 단계 5.1까지 생존 염료를 추가하지 마십시오)

- F4/80 APC 얼룩 하나 (세포 나 보상 비즈)

- CD11b FITC (얼룩 단일 세포 또는보상 비즈)

- FMO 1 (셀) : 쥐 IgG2a κ 이소 타입 제어 APC + CD11b FITC + 생존 염료 (단계 5.1에 추가)

- FMO 2 (셀) : F4/80 APC + 쥐 IgG2b κ 이소 타입 제어 FITC + 생존 염료 (단계 5.1에 추가)

  1. (시약 및 재료의 표 참조) 적절한 농도에서 형광 - 복합 일차 항체 및 / 또는 이소 타입의 컨트롤을 추가합니다.
  2. 30 분 동안 4 ° C에서 빛과 부화에서 샘플을 보호합니다.
  3. 4시 5 분 500 XG에 2 ㎖의 FACS 버퍼와 원심 분리기 세포 현탁액을 추가 ° C.
  4. 2 ㎖ FACS 버퍼에서 가만히 따르다 뜨는을 Resuspend SVF 세포 펠렛.
  5. ≥ 400 μL FACS 버퍼에 5 ° C에서의 분, 및을 Resuspend SVF 세포 펠렛을 위해 세포 현탁액 500 XG에 원심 분리기.
  6. 35 μm의 셀 스트레이너 관 정상을 갖춘 12 X 75mm의 폴리스티렌 원형 바닥 튜브에 샘플을 전송합니다.
  7. 4에 빛 및 저장 샘플로부터 보호 ° C를 FACS 분석까지.

참고 : 최적의 결과를 세포 immeadiately 분석해야하지만,이 프로토콜 FACS 분석을 성공적으로 4 ℃에서 1-2 시간 동안 FACS 버퍼에 저장된 라벨 세포에서 수행되었다 세포는 저장 시간이 증가하도록 수정해야 할 경우, 레이블이 세포는 FACS 분석을하기 전에 24 시간 동안 4 2 % 파라 포름 알데히드 ° C로 고정 할 수 있습니다. 항체 회사라는 세포가 1 주일로 저장할 수 있습니다하는 것이 좋습니다 있지만, 이것은이 절차의 컨텍스트 내에서 테스트되지 않았습니다.

5. FACS 분석

  1. 이전 FACS 분석에 죽은 / 라이브 셀 차별을 허용하도록 샘플 및 적절한 컨트롤에 생존 염료를 추가합니다.

참고 : 많은 가능성 염료 상업적으로 사용할 수 있지만, DAPI 및 PI는 여기 / 방출 교수에 따라 추천형광 - 복합 항체의 레스가 사용되고있다. DAPI와의 propidium 요오드화물은 0.2 밀리그램 / ML의 최종 농도에서 각각의 샘플에 추가됩니다.

  1. 관심의 세포 인구 (들) 규모가되도록 측면 산란 (SSC) 앞으로 분산 형 (FSC)를 조정하는 실험 샘플과 같은 조직에서 고립 된 흠없는 대조군 샘플, 바람직 세포를 사용합니다.

참고 : SVF 세포 AT의 분석을 위해, 그것은 SSC는 리니어 스케일에 FSC 대 로그 스케일로 표시하는 것이 좋습니다. 종종 매우 크고 세분화되어 현금 인출기를 분석 할 때 SSC에 대한 로그 스케일의 사용은 특히 중요합니다.

  1. 분석되고 셀 (들)의 유형에 따라 초기 빛의 산란 문을 그리고 흠없는 세포까지 (약 10 2)를 중심으로 단일 매개 변수 히스토그램의 왼쪽에 위치하도록 광전 튜브 (PMT)는 게인 조정 해당 채널.

주 : 림프구와 대 식세포 (또는 다른 골수 세포) 때문에자가 형광의 차이에 개별적으로 분석하는 것이 좋습니다.

  1. 멀티 컬러 보정을 수행하는 하나의 스테인드 컨트롤이나 항체 캡처 보상 비즈를 사용하고 있습니다.

참고 : 보상 구슬의 사용이 권장되지만, 각 항체의 호환성을 보장해야합니다. 예를 들어, 보상 비즈 고립 된 세포가 적절한 하나의 얼룩 제어를 얻기 위해 요구되는 경우에 토끼 항체와 교차 반응하지 않을 수 있습니다.

  1. 수정 FMO 컨트롤에 따라 실험 게이트를 설정합니다.
  2. 그 인구의 보급에 따라 이벤트의 해당 번호를 수집하고 실험 데이터를 기록하는 흐름 cytometer에 설정합니다.
  3. 수출 FCS 데이터를 오프라인 분석을 위해 파일. 흐름 cytometr 가능한 많은 프로그램이 있습니다Y 데이터 분석. 우리는 Cytobank, investigatores 인터넷 액세스 18와 함께 모든 컴퓨터에서 그림을 저장하고 분석 데이터 및 생성 할 수있는 웹 기반의 플랫폼을 권장합니다. 또한, Cytobank 데이터 공개에 액세스 할 수 있도록하거나 공동 작업자에 대한 액세스를 제한 할 수있는 기능을 제공합니다.

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결과

차등 원심 분리 한 다음 AT의 콜라 소화 저지방 (지방에서 10 % 킬로 칼로리) 또는 높은 지방 (지방 60 %의 킬로 칼로리) 다이어트 (LFD 및 HFD을 공급 수컷 C57BL/6J 마우스의 부고환 지방 패드에서 SVF를 분리하는 데 사용되었다 각각) 16 주. SVF의 세포는 다음 FACS 분석을 통해 가능한 ATM 기기 (그림 1)과 T 세포 (그림 2) AT 비율을 정량화하는 형광 - 복합 일차 항체로 표지 하였다. 빛의 산란, 쌍으로 차별과 생존 게이트 등의 초기 게이트는 그림 1A와 2A에 묘사되어 있습니다. 이 그림 2A의 초기 빛의 산란 게이트 autofluorescent 골수 세포를 포함하여 방지하기 위해 림프구 인구로 제한됩니다 것을 강조해야한다. 수정 FMO를 사용하는 예제는 그림 1B에 묘사되어 실험 게이트를 설정하는 제어합니다. 이 예에서, F4/8...

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토론

비만의 신진 대사 결과에서 면역 체계의 역할에 대한 관심의 증가는 AT의 면역 세포를 특성화 유동 세포 계측법의 광범위한 사용하게되었다. 정확한 프로토콜은 자신의 경험과 장비를 사용할 기준으로 실험실 사이에 다를 수 있지만, 중요한 단계는 콜라 소화, 차등 원심 분리하고, 세포 표면 항원 라벨 (가) 있습니다. 본 문서의 목적은 AT 및 / 또는 유동 세포 계측법을 수행하는 작업에 대한 경험을 가진 수사관 SVF AT의 분리에 대한 자세한 프로토콜과 실용적인 가이드를 제공하는 것입니다.

모든 실험 기법으로, 또는 현저하게 원하는 결과에 영향을 미치지 않을 수도 있습니다 많은 차이가 있습니다. 우리의 경험을 바탕으로, 프로토콜 상세한 여기에 시간, 자원, 세포 수율 및 세포 생존 능력 사이의 가장 효율적인 균형을 나타냅니다. 예를 들어, 우리는 그 증가를 발견했습니다콜라게나 비슷한 농도에서 교원질 II 소화 기간을만큼 60 분 셀룰러 수율에 영향을 거의 미치지있다, 따라서 우리...

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공개 사항

우리는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

JSO는 NIH 루스 L. 키르 NRSA (F32 DK091040)에 의해 지원됩니다, AK는 미국 당뇨병 협회 (7-10-MI-05)에서 박사후 원정대에 의해 지원되며, AHH는 미국 심장 협회 설립 탐정 수상에 의해 지원됩니다 (12EIA8270000). 유동 세포 계측법 실험은 VMC 유동 세포 계측법 공유 리소스에서 수행 하였다. VMC 유동 세포 계측법 공유 리소스는 밴더빌트 소화기 질환 연구 센터 (DK058404)에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DPBS(Ca 또는 Mg 없음) 10 x 500mlLife Technologies14190-250
DAPILife TechnologiesD3571
BSASigmaA2153-100G
콜라겐분해효소SigmaC6885-5G
프로피듐 요오드화물 용액SigmaP4864-10 ml
안정 스택 20 마이크로리터RaininSS-L10
20 마이크로리터 필터 팁RaininSRL10F
안정 스택 250 마이크로리터 팁RaininSS-L250
1000 마이크로리터 팁RaininGPS-L1000
1000 마이크로리터 필터 팁RaininGP-L1000F
250 마이크로리터 필터 팁RaininSR-L200F
FC 블록BD Biosciences553142
fisher 100mn 스트레이너Fisherbrand22-363-549
중간 무게 접시Fisherbrand02-202B
알루미늄 호일Fisherbrand1213100
다진 가위Fisherbrand089531B
VortexFisherbrand2215365
50ml 원뿔형 튜브BD Falcon14-959-49A
필터 상단 FACS 튜브BD Falcon352235
10ml 피펫 케이스 200BD Falcon1367520
라운드 바닥 튜브BD Falcon352058
5ml 주사기BD Falcon309646
V 바닥 플레이트Costar07-200-107
전사 벌브 피펫Thermo Scientific13-711-22
ShakerThermo Scientific11 676 071
접착 매트Thermo Scientific1368750
배양 원심분리기Sorvall75253839
어댑터Sorvall75003723
쥐 안티 마우스 CD16/CD32BD Biosciences553142농도 : 0.5 - 1 μ g / 10 6 < / sup > 세포
쥐 안티 마우스 F4 / 80eBioscience17-4801형광 접합체 : APC
농도 : 0.2 μ g/ 106 세포
이소타입 제어 카탈로그 번호: 17-4321
쥐 안티 마우스 CD11beBioscience11-0112형광단 접합체: FITC
농도: 0.5 μ g/ 106 세포
이소타입 제어 카탈로그 번호: 11/1/4031
아르메니아 햄스터 안티-마우스 CD11ceBioscience12-0114형광단 접합체: PE
농도: 0.8 μ g/ 106 셀
이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: Dec-88
염소 안티 마우스 MGL1/2R& D 체계FAB4297PFluorophore 켤레: PE
농도: 0.1 & g/ 106 셀
아이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: IC108P
염소 안티 마우스 CD206R& D 체계FAB2535PFluorophore 켤레물: PE
농도: 0.1 & g/ 106 셀
아이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: IC108P
쥐 안티 마우스 CCR2R& D 체계FAB5538PFluorophore 켤레물: PE
농도: 0.1 μ g/ 106 셀
이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: IC013P
아르메니안 햄스터 안티-마우스 TCRβBD Biosciences553174형광단 접합체 : APC
농도 : 0.2 μ g / 10 6 < / sup > 세포
동종 제어 카탈로그 번호 : 553956
쥐 안티 마우스 CD8aBD Biosciences552877형광 단 접합체 : PE-Cy7
농도 : 0.8 μ g / 10 6 < / sup > 세포
Isotype 제어 카탈로그 번호 : 552784
쥐 안티 마우스 CD4BD Biosciences557956Fluorophore conjugate : Alexa Fluor 700
농도 : 0.2 μ g/ 106 셀
아이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: 557963

표 1. 재료 및 시약 목록.

세포

참고문헌

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  10. Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
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  18. Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10(2010).
  19. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
  20. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).

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