지방 조직 (AT)는 강력한 면역 세포 활성화와 상호 작용의 사이트입니다. 면역 시스템의 거의 모든 세포는 AT의 존재와 그 비율은 비만에 의해 변경됩니다. 면역 세포 인구 AT의 적절한 분리, 정량 및 특성은 immunometabolic 질병에서 자신의 역할을 이해하는 데 중요하다.
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이 논문에서
요약
초록
비만 설치류와 인간의 지방 조직의 증가 식세포 침윤 (AT)의 발견은 로컬 및 전신 인슐린 저항 면역 세포 공헌에 대한 관심 강화하게되었다. 엎드려서 비만 AT 다른 면역 세포 집단의 분리 및 정량 지금 immunometabolism 실험실에서 일반적으로 활용 기법, 아직 극도의주의를 얻을 데이터가 안정적이고 해석되도록 기질 혈관 세포의 분리 및 유동 세포 계측법 분석을 모두 수행해야 . 이 비디오에서 우리는, 말하다 소화와 면역 세포가 풍부한 기질 혈관 부분을 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 후, 우리는 항체 라벨 식세포와 T 림프구 방법과 유동 세포 계측법 실험에서 그들에 제대로 게이트하는 방법을 보여줍니다. 저지방 먹이 엎드려서 고지방 먹이 비만 쥐에서 대표 유동 세포 계측법 플롯이 제공됩니다. 이 분석의 중요한 요소는 어떻게 항체를 사용하는 것입니다대 식세포 AT 자연 autofluorescent중인 채널뿐만 아니라, 적절한 보상 컨트롤의 사용 형광 없습니다.
서론
역사적으로, 지방 조직 (AT)는 에너지 균형에 대한 응답으로 신축 지질 스토리지의 불활성 기관으로 조회되었습니다. 우리는 지금 AT 적극적으로 직접 먹이 행동과 조직의 포도당 항상성에 영향을 미치는 호르몬의 숫자를 분비 동적 내분비 기관을 나타내는 것을 알 수 있습니다. 또한, 지난 10 년 동안 각막 혈관 분획 (SVF)뿐만 아니라 항상성에 그들의 공헌 AT에 거주하는 면역 세포의 다양한 인구에 대한 증가하는 감사가있다.
1964 1 Rodbell에 의해 설명 된 지방 세포와 SVF는 콜라게나 다이제스트를 사용하여 AT를 분리하는 기능은 차등 원심 분리에 의해 따랐다. 콜라게나 II는 대부분 지방 세포의 인슐린 수용체 1의 보수에 의한 지방 세포와 SVF 분리하는 데 사용됩니다. AT의 초기에, 효소 분획은 주로 adipo을 연구하기 위해 고용되었다신진 대사를 cyte 및 preadipocytes를 분리 할 수 있습니다. 더 최근에, 흐름 cytometers의 광범위한 가용성과 상업적으로 이용 가능한 형광 - 복합 항체의 계속 증가와 함께이 기술은 면역 세포 AT의 특성을 촉진했다.
AT 염증 면역 세포의 존재가 이전에이 설명되어
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프로토콜
1. 시약 및 소모품
앞서 실험 프로토콜을 시작하려면 다음 시약을 준비 :
- 70 % 에탄올
- 1X PBS
- 1X DPBS은 (칼슘과 마그네슘 제외) 0.5 % BSA가 첨가
- FACS 버퍼 : 1X DPBS (칼슘과 마그네슘 제외), 2 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % FCS
- ACK 버퍼 : 150 MM의 NH 4 망할 CIA, 10 MM KHCO 3, 물에 0.1 밀리미터 나 2 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)
2. 지방 조직의 수확 및 준비
- 각 기관에 특정한 IACUC 승인 된 절차에 따라 쥐를 안락사.
- 철저하게 70 % 에탄올로 모피 젖은.
- 검상 돌기 프로세스의 수준 (흉골의 하부)에서 절개를하고 모든 주요 혈관을 절단되지 않도록주의, 심장을 노출 흉강을 엽니 다.
참고 :이 시점에서만큼 진동판이 그대로 유지하는 것도 도움이 그 것이다가능한 혈액을....
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결과
차등 원심 분리 한 다음 AT의 콜라 소화 저지방 (지방에서 10 % 킬로 칼로리) 또는 높은 지방 (지방 60 %의 킬로 칼로리) 다이어트 (LFD 및 HFD을 공급 수컷 C57BL/6J 마우스의 부고환 지방 패드에서 SVF를 분리하는 데 사용되었다 각각) 16 주. SVF의 세포는 다음 FACS 분석을 통해 가능한 ATM 기기 (그림 1)과 T 세포 (그림 2) AT 비율을 정량화하는 형광 - 복합 일차 항체로 표지 하였다. 빛의 산란, 쌍으로 차별과 생존 게이트 등의 초기 게이트는 그림 1A와 2A에 묘사되어 있습니다. 이 그림 2A의 초기 빛의 산란 게이트 autofluorescent 골수 세포를 포함하여 방지하기 위해 림프구 인구로 제한됩니다 것을 강조해야한다. 수정 FMO를 사용하는 예제는 그림 1B에 묘사되어 실험 게이트를 설정하는 제어합니다. 이 예에서, F4/8.......
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토론
비만의 신진 대사 결과에서 면역 체계의 역할에 대한 관심의 증가는 AT의 면역 세포를 특성화 유동 세포 계측법의 광범위한 사용하게되었다. 정확한 프로토콜은 자신의 경험과 장비를 사용할 기준으로 실험실 사이에 다를 수 있지만, 중요한 단계는 콜라 소화, 차등 원심 분리하고, 세포 표면 항원 라벨 (가) 있습니다. 본 문서의 목적은 AT 및 / 또는 유동 세포 계측법을 수행하는 작업에 대한 경험을 가진 수사관 SVF AT의 분리에 대한 자세한 프로토콜과 실용적인 가이드를 제공하는 것입니다.
모든 실험 기법으로, 또는 현저하게 원하는 결과에 영향을 미치지 않을 수도 있습니다 많은 차이가 있습니다. 우리의 경험을 바탕으로, 프로토콜 상세한 여기에 시간, 자원, 세포 수율 및 세포 생존 능력 사이의 가장 효율적인 균형을 나타냅니다. 예를 들어, 우리는 그 증가를 발견했습니다콜라게나 비슷한 농도에서 교원질 II 소화 기간을만큼 60 분 셀룰러 수율에 영향을 거의 미치지있다, 따라서 우리.......
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공개 사항
우리는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
JSO는 NIH 루스 L. 키르 NRSA (F32 DK091040)에 의해 지원됩니다, AK는 미국 당뇨병 협회 (7-10-MI-05)에서 박사후 원정대에 의해 지원되며, AHH는 미국 심장 협회 설립 탐정 수상에 의해 지원됩니다 (12EIA8270000). 유동 세포 계측법 실험은 VMC 유동 세포 계측법 공유 리소스에서 수행 하였다. VMC 유동 세포 계측법 공유 리소스는 밴더빌트 소화기 질환 연구 센터 (DK058404)에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DPBS(Ca 또는 Mg 없음) 10 x 500ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| 콜라겐분해효소 | Sigma | C6885-5G | |
| 프로피듐 요오드화물 용액 | Sigma | P4864-10 ml | |
| 안정 스택 20 마이크로리터 | Rainin | SS-L10 | |
| 20 마이크로리터 필터 팁 | Rainin | SRL10F | |
| 안정 스택 250 마이크로리터 팁 | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 마이크로리터 팁 | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 마이크로리터 필터 팁 | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 마이크로리터 필터 팁 | Rainin | SR-L200F | |
| FC 블록 | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn 스트레이너 | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| 중간 무게 접시 | Fisherbrand | 02-202B | |
| 알루미늄 호일 | Fisherbrand | 1213100 | |
| 다진 가위 | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50ml 원뿔형 튜브 | BD Falcon | 14-959-49A | |
| 필터 상단 FACS 튜브 | BD Falcon | 352235 | |
| 10ml 피펫 케이스 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| 라운드 바닥 튜브 | BD Falcon | 352058 | |
| 5ml 주사기 | BD Falcon | 309646 | |
| V 바닥 플레이트 | Costar | 07-200-107 | |
| 전사 벌브 피펫 | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| 접착 매트 | Thermo Scientific | 1368750 | |
| 배양 원심분리기 | Sorvall | 75253839 | |
| 어댑터 | Sorvall | 75003723 | |
| 쥐 안티 마우스 CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | 농도 : 0.5 - 1 μ g / 10 6 < / sup > 세포 |
| 쥐 안티 마우스 F4 / 80 | eBioscience | 17-4801 | 형광 접합체 : APC 농도 : 0.2 μ g/ 106 세포 이소타입 제어 카탈로그 번호: 17-4321 |
| 쥐 안티 마우스 CD11b | eBioscience | 11-0112 | 형광단 접합체: FITC 농도: 0.5 μ g/ 106 세포 이소타입 제어 카탈로그 번호: 11/1/4031 |
| 아르메니아 햄스터 안티-마우스 CD11c | eBioscience | 12-0114 | 형광단 접합체: PE 농도: 0.8 μ g/ 106 셀 이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: Dec-88 |
| 염소 안티 마우스 MGL1/2 | R& D 체계 | FAB4297P | Fluorophore 켤레: PE 농도: 0.1 & g/ 106 셀 아이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: IC108P |
| 염소 안티 마우스 CD206 | R& D 체계 | FAB2535P | Fluorophore 켤레물: PE 농도: 0.1 & g/ 106 셀 아이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: IC108P |
| 쥐 안티 마우스 CCR2 | R& D 체계 | FAB5538P | Fluorophore 켤레물: PE 농도: 0.1 μ g/ 106 셀 이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: IC013P |
| 아르메니안 햄스터 안티-마우스 TCRβ | BD Biosciences | 553174 | 형광단 접합체 : APC 농도 : 0.2 μ g / 10 6 < / sup > 세포 동종 제어 카탈로그 번호 : 553956 |
| 쥐 안티 마우스 CD8a | BD Biosciences | 552877 | 형광 단 접합체 : PE-Cy7 농도 : 0.8 μ g / 10 6 < / sup > 세포 Isotype 제어 카탈로그 번호 : 552784 |
| 쥐 안티 마우스 CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate : Alexa Fluor 700 농도 : 0.2 μ g/ 106 셀 아이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: 557963 |
표 1. 재료 및 시약 목록. |
참고문헌
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-ind....
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재인쇄 및 허가
