성상 세포 운송업자 전류의 디컨 볼 루션 분석 글루타민산 정리의 시간 과정을 도출

Summary

우리는 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류의 전기 생리학 녹음에서 성상 세포 막에 글루타민산의 수명을 추정하는 분석 방법을 설명합니다.

Abstract

뇌의 글루타메이트 수송의 가장 높은 밀도는 성상 세포에서 발견된다. 3 나 ⁺ 1 H의 공동 수송 ⁺ 1 K의 반대 교통과 막에 걸쳐 글루타민산 글루타민산 염 수송 커플 운동 ^+. 전송 프로세스에 의해 생성 된 화학 양론 현재는 성상 세포에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음으로 모니터링 할 수 있습니다. 기록 된 현재의 시간 코스는 성상 세포가 노출하는 글루타메이트 농도 프로파일, 글루타민산 염 수송의 동역학, 그리고 성상 세포 세포막의 수동 electrotonic 속성의 시간 경과에 의해 형성된다. 여기에서 우리는 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류를 기록하고 성상 세포 수송 전류의 파형을 형성하는 다른 모든 요인 글루타민산 정리의 시간 과정을 분리하는 데 사용할 수있는 실험 및 분석 방법에 대해 설명합니다. 여기에 설명 된 방법은 수명 (을)를 추정하는 데 사용할 수 있습니다F 플래시 uncaged 건강과 질병 동안 중추 신경계의 지역에서 성상 세포 막에 글루타민산 시냅스 발표.

Introduction

성상 세포는 별 모양의 형태와 neuropil를 통해 확장하고 이웃 시냅스 연락처 ^{1,2에 도달} 미세 막 돌기 두뇌에있는 가장 풍부한 세포 유형 중 하나입니다. 성상 '세포막 밀도가 글루타민산 염 수송 분자 ^3로 포장된다. 생리적 조건, 글루타민산 염 수송 빠르게 막 세포 측면에서 글루타민산 염을 바인딩하고 세포의 세포질에 전송할 수 있습니다. 이렇게함으로써, 수송은 세포 공간 ⁴ 글루타민산 낮은 기저 농도를 유지한다. 시냅스를 흥분성에 인접 좋은 성상 과정에서 글루타민산 염 수송은 이상적으로는 멀리 시냅스에서의 확산으로 시냅스 이벤트 기간 동안 출시 된 글루타메이트를 바인딩 할 수있는 좋은 위치에 있습니다. 이렇게하면, 전송기는 흥분성 신호의 공간적 확산을 감소 요정 여분의 시냅스 지역을 향해와 인근 시냅스 위에 글루타민산 유출을 제한^5-7 뇌의.

글루타민산 염 수송 화학 양 론적 3의 움직임에 결합 electrogenic 과정 나 ⁺ 1 H의 자신의 전기 화학적 구배에 따라 ⁺ 1 K ^{+ 8} 반 수송. (안산)> NO ₃ ^{- -} (질산) ≈ CLO

Protocol

1. 슬라이스 준비

1. 119의 NaCl, 2.5 KCl을, 0.5 _{염화칼슘,} 1.3 _황산 마그네슘 · 7H ₂ O, 4 MgCl _2, 26.2 NaHCO3를 _3, 1의 NaH ₂ PO _4, 22 포도당, 320 : 포함 / 스토리지 솔루션 (MM)에 깔끔히 500 ML을 준비합니다 mOsm, 산도 7.4
2. 슬라이스 침수 챔버를 준비하는 250 비이커를 사용하여 / 스토리지 솔루션을 깔끔히 200 ml의 그것을 채울, 34에서 물을 욕조에 따뜻하게 ° C 및 95 % O ₂ 5 % CO _2와 거품을.
3. 4에서 유리 병에 남아있는 슬라이스 / 스토리지 솔루션 ° C를 유지
4. vibratome 샘플 홀더에 작은 한천 블록 (6 %, ACSF에서 준비)를 부착하고이를 4 ℃에서 저장하는 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용
5. 30 분 깔끔히 시작하기 전에, 얼음, 95 % O _2, 5 % CO ₂ 거품을 가득 양동이에 슬라이스 / 스토리지 솔루션을 포함하는 유리 병을 놓습니다.

Results

분석 방법의 성공은 매우 중추 신경계의 지역에서 성상 세포에서 수송 전류 고품질의 전기 생리학 녹음을 얻기에 따라 여기에 설명. 급성 마우스 해마 슬라이스, 성상 세포는 쉽게 때문에 그들의 작은 세포 기관 (Ø = 10 ㎛)와 저명한 핵 (그림 1)의 Dodt 조명이나 IR-DIC에서 확인할 수 있습니다. 세포 솔루션 (그림 1)에 알렉사 594 (50 μM)과 같은 형광 물질을 추가 할 때 자신의 독특한 별 모양의 형태는 공 촛점 epifluorescence에, 또는 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경으로 감상 할 수 있습니다. 전기 생리학 수준에서 성상 세포는 낮은 입력 저항, 과분극 막 전위 (~ -90 MV)와 활동 전위를 생성하는 무능력에 의해 특징입니다. 성상 세포는 이웃 뉴런의 전기 또는 optogenetic 자극과 CA의 UV 광분해에 대한 응답으로 전류를 생성MNI-L-글루타민산 같은 GED 화합물.

.......

Discussion

여기에 우리가 성상 세포의 전기 생리학 녹음을 얻기 위해 실험 방법을 설명 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류를 분리하는 분석 프로토콜에 대한 수학적 방법은 성상 세포 수송 전류에서 글루타민산 정리의 시간 코스를 파생시킵니다.

분석의 성공은 성상 세포에서 고품질의 패치 클램프 녹음을 취득 할 수있는 능력과 수송 전류를 설명하는 데 사용되는 피팅 알고리즘의 정확성에 의존합니다. 디컨 볼 루션 분석은 다음과 같은 두 가지 가정에 의존한다. (1) 실험적 기록 운송업자 현재에 글루타민산 정리의 시간 과정을 왜곡 여러 프로세스가 선형 시스템으로 표현 될 수있다. 절대 측면에서 비록 모양 운송업자 전류가 비선형 시스템 (원리 글루타민산 바인딩 및 전송에 모두 채도를 치룰 수있다), 실험적 증거 indica의 것을 요인의 많은그들의 선형 정권이 넓은 것을 TES. 따라서, 수송 전류와 글루타민산 정리의 시간 과정은 자극 강도, 방출 확률과 글루타메이트 농도 ^13.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
(R, S< / em>) -CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 disodium salt	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX disodium salt	Tocris	1044
D, L-TBOA	Tocis	1223
Picrotoxin	Sigma	P1675
MNI-L-글루타메이트	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	선택적
매트릭스 전극	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
붕규산 유리 모세관	World Precision Instruments	PG10165-4
듀얼 스테이지 유리 마이크로 피펫 풀러	Narishige	PC-10
Loctite 404 순간 접착제	Ted Pella	46551
Xe 램프	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics