쥐과 장내 신경 전구 세포에 대한 양이 세포 이동의 분석

요약

우리는 다양한 성장 인자의 존재 하에서 장용성 신경 능선 세포 이동 전위의 정확한 정량을 허용 생체 세포 이동 분석을 제시한다.

초록

신경 능선 세포 (NCC)는 등의 신경관에서 유래 및 개발 척추 동물의 배아에 걸쳐 광범위하게 마이그레이션 과도 다 능성 세포 집단이다. 말초 뉴런 및 아교를 제공 할뿐만 아니라, NCC는 멜라닌 세포뿐만 아니라 부교감 얼굴 골격의 대부분을 생성한다. NCC 마이그레이션 및 차별화 신경 튜브 및 지역에 별개의 세포 외 신호에 대한 노출을 따라 자신의 축 원점의 조합에 의해 제어된다. 세포 외 리간드의 이러한 기여는 장용 신경계 (ENS), 복잡한 상호 연결 (다른 것들 사이에) 로컬로 제어하는​​ 신경 중추의 네트워크 창자 근육 운동과 장 운동의 형성시에 특히 분명하다. 꼬리 패션에 주동이의 - - 미래의 창자의 전체 길이를 ENS의 대부분은 정착하기 위해 긴 여행을 수행 NCC의 작은 초기 수영장에서 파생됩니다. 로 알려진 몇 가지 신호 전달 경로 중장내 NCC의 식민지에 영향을 미치는, GDNF / RET 신호가 가장 중요한 것으로 인식되고 있습니다. 사실, 창자의 중간 엽으로 RET 리간드 GDNF의 시공간으로 제어 분비 배아 창자 및 내 매력과 RET - 표현 장내 NCC의 안내를 주로 담당하고 있습니다. 여기, 우리는 GDNF 등 다양한 성장 인자의 존재에 장내 NCC 마이그레이션 가능성 정확한 정량화 할 수 찬란 NCC를 가진 유전자 변형 마우스 라인을 사용하고, 생체 세포 이동 분석에 대해 설명합니다.

서론

신경 능선 세포 (NCC)의 배아를 개발하는 동안 많은 유도체를 형성하는 척추 동물에 고유 한 과도 세포 유형입니다. 이 세포 집단이 아닌 신경 외배엽 ^1에 인접한 신경 판의 경계에서 발생한다. neurulation 동안, 성형 신경관의 등쪽 가장자리를 따라 신경 판의 장소 NCC의 굽힘. NCC는 분리하는 멀리 신경 튜브에서 마이그레이션, 상피 - 간엽 전환을 받고있다. NCC들은 전체 장용 신경계 (ENS)를 형성 소화관 장벽에 내장 신경 신경절의 상호 연결된 네트워크를 포함하는 다양한 배아 구조를 정착. 최근 ^{2,3 리뷰,} 많은 유전자는이 복잡한 구조의 개발에 참여하고있다.

ENS의 대부분은 (즉, 미래의 후뇌 / 척수 경계 정도) 미주 신경 튜브에서 NCC의 원래의 작은 수영장에서 파생 ^4.이 신경 전구 세포는 쥐의 배아 일 (E) 9.0 주위에 foregut에 도달 약 e15.0 전체 배아 창자를 식민지 때까지 용기의 중간 엽에서 꼬리 쪽 마이그레이션 할 수 있습니다. 대장의 신경 전구 세포의 작은 부분 집합은 최대 맹장 ⁴ 반대 방향으로 후방 창자 침입 성례 NCC에 의해 제공됩니다. 미주와 성례의 두 NCC가 필요 여러 마이그레이션,....

프로토콜

윤리 문

마우스를 포함하는 실험은 의학 연구에 사용 된 동물의 관리 및 조작을위한 동물 보호 지침의 캐나다 협의회 다음을 수행 하였다. 동물의 조작을 포함하는 프로토콜은 몬트리올 퀘벡 대학의 기관 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (위원회 (CCT) Institutionnel 드 보호 데 Animaux, 참조 번호 0512-R3-650-0513).

1. 콜라겐 젤의 제조

조직 문화 후드에서 멸균 방식으로 작업 할 수 있습니다.

1. 표준 항생제 등을 포함한 5 배 DMEM (이글의 수정 필수 매체)를 준비합니다. 20 ㎖의 물에 DMEM 분말과 _탄산 수소 나트륨의 0.925 g의 3.37 g을 녹인다. 0.22 μm의 필터를 통해 전달하여 소독. 무균 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 멸균 열 불 활성화 된 소 태아 혈청 25 ㎖의 2.5 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 보관
2. 얼음에서 800 μl를 혼합완전한 배 DMEM 600 ㎕의 1 N NaOH를 17 ㎕의 콜라겐 I 용액 (0.02 N 아세트산, 필터 소독에 3.77 ㎎ / ㎖). 3 ㎖의 최종 부피로 멸균 수로 희석. 믹스 관련 ....

결과

다음과 같은 결과 (그림 1) 여기에 설명 된 기술로 얻을 수있는 대표입니다. 성장 인자 (즉, GDNF)의 사용은 GFP를 발현하는 장 이식편에서 그리고 콜라겐 겔에 장내 NCC (그림 2)의 이동을 자극한다. 일부 세포가 성장 인자의 부재하에 이식편 밖으로 나와 있지만, 이들은 주로 GFP-표지 아니며 패시브 엔트리를 나타낸다. 그것은이 조직이 여전히 크게 형광 세포에 의해 채워지며, 그렇지 않으면 아래 콜라겐 거짓말 세포를 숨기는 것 같은 결과를 기록하기 위해 콜라겐 겔에서 장내 조각을 제거 할 필요가있다. 이러한 결과의 정량화는 GDNF가있을 때 더 많은 세포가 콜라겐 겔 내에서 발견되는 것을 보여줍니다, 그리고 활동적인 이동은 (그림 3) 일어난다. 실제로, 수동 세포는 장 슬라이스의 직경 내에서, 어디 있나, 바로 외식에서 찾을 수 있습니다 적극적으로 콜라겐 겔에 침입 EAS 세포가 떨어져 원래의 자.......

토론

우리는 우리의 생체 이식편 배양 기술은 정확하게 GDNF의 존재에 장내 NCC 이주 가능성을 정량화하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 이러한 정확한 정량이 크게 ^11,12,15 이전에 ^설명 된대로, 200 ㎛ 두께의 vibratome 창자 부분을 사용하는 대신 대략적인 크기의 큰 조각에 의해 촉진된다. 사실, 이것은 우리가 재현성이 높은 환경에서 세포의 적절한 수와 함께 작업 할 수 있습니다. 참고로, 이식편 슬라이스가 절단되는 소장의 꼬리 - 대부분의 영역 내에서 형광 장내 NCC의 균일 한 분포는 하나의 창자 (그림 1A)에서 여러 부분의 분석을 할 수 있습니다. 또한, 장내 NCC와 축삭이 모두 문화 기간 말에 같은 분석 ^(11), 외식의 철수에 조직을 종료 할 수 있습니다 우리가 철새 NCC에 독점적으로 초점을 맞출 수 있다는 없습니다.

가장 중요한 단계는하.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM 분말	Wisent	219-010-XK
NaHCO3	Bioshop	SOB999	생명공학 등급
Steriflip 진공 여과 시스템(0.22 미크론)	EMD Millipore	SCGP00525
페니실린-스트렙토마이신 용액, 100x	Wisent	450-201-EL&	nbsp;
태아 소 세럼	Wisent	095-150	고품질
등급 콜라겐 I	BD 생명과학	354236
NaOH	Bioshop	SHY700	10 N 재고에서 희석한 후 멸균 여과
GDNF	Cedarlane	CLCYT305
Falcon 24웰 플레이트	BD 생명과학	353047
해부 가위	Fisher Scientific	089515
유리 페트리 접시	VWR	89000-306
PBS	Sigma	P5493	세포 배양 등급
해부 현미경	Leica	M125
Dumont #5 펜치	파인 사이언스 도구	11251-20
아가로스	바이오샵	AGA001	생명공학 등급
수술용 칼날	깃털	21
모든 목적용 인스턴트 크레이지 글루 펜	크레이지 글루	KG824
HM 650V 진동 블레이드 마이크로톰	써모 사이언티픽	920110
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148
DAPI	시그마-알드리치	D9564
특정 시약 및 장비 표.

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