제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별<em&gt; 스포 도프 테라 리토 랄</em&gt; DNA 안정 동위 원소를 통해 사용 프로빙<sup&gt; 13</sup&gt; C-포도당

요약

스포 도프 테라 리토 랄리스의 가트와 연관된 활성 박테리아 여행자는 pyrosequencing 기법에 결합 안정 동위체 프로빙 (SIP)에 의해 결정되었다. 이 방법을 사용하여, 지역 사회 내에서 대사 활성 박테리아 종의 식별은 높은 해상도와 정밀도로 이루어졌다.

초록

대부분의 곤충의 내장은 공생 비병원성 박테리아의 복잡한 사회에서 살고있다. 이러한 미생물 지역 사회 내에서 그것은 공생이나 공생 박테리아 종을 식별 할 수 있습니다. 후자의 것, 즉 다른 사람의 ^{사이에서,} 필수 아미노산 ^(4)의 합성을 포함하여 면역 반응 ^2, 페로몬 생산 ^3,뿐만 아니라 영양을 증폭, 곤충 재생 ¹ 도움, 곤충에 여러 기능을 제공하는 것으로 관찰되었다.

때문에 이러한 연결의 중요성에 많은 노력이 개별 구성원에 이르기까지 지역 사회의 특성을되었습니다. 그러나, 이러한 노력의 대부분은 하나 재배 방법에 근거하거나 최종 식별 서열화 된 16S rRNA 유전자 단편의 생성에 의존 하였다. 불행히도, 이러한 방법은 장내에 존재하는 세균 종을 파악하고 더 INFORMAT을 제공하지미생물의 대사 활동에 이온.

곤충의 창자의 대사 활성 세균 종의 특성을 위해, 우리는 보편적 인 기질로 ¹³ C-포도당을 이용한 생체 내 (SIP)를 프로빙 안정 동위 원소를 사용했습니다. 이것은 그들의 특정 신진 대사 활동에 미생물 계통의 결합을 할 수있는 유망한 문화가없는 기술이다. 이는 DNA와 RNA ^5와 같은 미생물의 생체에 기판에서 안정 동위 원소 표지 원자를 추적 가능합니다. DNA가 비 표지 ⁽¹² C)에 비해 한 표지 DNA의 밀도를 증가시킨다 ^(13)에 C의 혼입 동위 원소. 결국, ¹³ C-표지 된 DNA 또는 RNA는 ¹² C-레이블이없는 유사 하나 ^6에서 밀도 구배 초 원심 분리에 의해 분리된다. 분리 된 핵산 분자 동위 원소의 후속 분석 종의 대사 활동 및 ID 사이의 연결을 제공한다.

여기에서, 우리는 제너럴 곤충 (우리의 모델 시스템), 스포 도프 테라 리토 랄 (나비목, Noctuidae)의 창자에있는 대사 활성 박테리아의 특성을하는 데 사용되는 프로토콜을 제시한다. DNA의 계통 발생 학적 분석은 곤충 장내 세균 공동체의 식별에 높은 해상도와 정밀도를 허용 pyrosequencing 기법을 사용하여 수행 하였다. 메인 기판으로서, ¹³ C-표지 된 글루코스가 실험에 사용 하였다. 기판은 인공 사료를 사용하여 곤충에 공급 하였다.

서론

곤충 박테리아의 공생 협회는 곤충 종 ^7의 큰 숫자에 대한 알려져있다. 이러한 공생 협회에서, 미생물은 곤충의 성장과 발달에 중요한 역할을한다. 미생물은 호스트에 곤충 필수 아미노산 ^(4)의 합성을 포함하여 재생 ^1, 페로몬 생합성 ^3, 영양, 및 액세스 음식의 소화에 기여하는 것으로 나타났다. 장내 세균 협회의 광대 한 다양한에도 불구하고, 훨씬 적은들은 곤충에 찬성 재생 기능 역할에 대한 알려져있다. 만 흰개미의 경우에는 목질 섬유소의 공생 소화가 원핵 생물, 원생 동물, 곰팡이에 의해 수행, 널리 ^8,9를 공부하고 있습니다. 이와 대조적으로, 거의가 제너럴 곤충의 용기면 leafworm 즉에 존재하는 공생 관계에 대해 잘 알려져 있습니다, 스포 도프 테라는 일반적으로 인해 식물 호스트의 자신의 빈번한 이동에, 또한. 리토 랄IST 곤충과 그들의 창자 관련된 세균성 지역 사회가 영구적으로 자신의 식습관은 식물성 화학 물질의 과다로 식물을 소비에 연결된 새로운 도전에 노출되어 있습니다. 이 옆에 lepidopterans의 창자 환경은 본질적으로 높기 때문에 장내의 pH ^10의 박테리아의 성장을위한 가혹한 환경....

프로토콜

1. 곤충 사육

1. 구입 또는 스포 도프 테라의 계란 클러치를 얻을 자신의 양육에서 리토 랄. 부화 할 때까지 실온 (RT)에서 무균 배양 접시에서 그들을 유지합니다.
2. 다음과 같이 사육 곤충의 인공 사료를 준비합니다 :
   1. 물 100 ㎖에 하룻밤 500g 지상 흰 콩을 적신다.
   2. H ₂ O 증류수 1,000 ml로 9.0 g 아스 코르 빈산 및 75g의 한천을 추가하고, 그 후 가열한다.
   3. 혼합물이 냉각하게하고 (흰색 밀랍 고체 혼합물) 응고 할 때 사용할 때까지 4 ° C에 보관하십시오.
3. 조명의 16 시간과 어둠의 8 시간과 긴 하루 정권 깨끗한 플라스틱 상자와 23 ~ 25 ° C에서 인공 사료에 후면을에 부화 된 유생을 전송합니다. 애벌레가 여섯 애벌레 령충을 통과 할 때까지 매일 음식을 변경합니다.

대사 활성 창자 박테리아의 DNA의 2. ¹³ C-라벨

1. 증류수, 탈 이온수 (DDH ₂ O)와 완벽하게 ¹³ C-표지 된 포도당 186.1 mg의 용해 및 SIP 실험을위한 인공 사료 ....

결과

곤충 장내 본 대사 활성 균의 충분한 표시를 달성하기 위해, 곤충 한 비 표지 라이터로부터 용이하게 표지 된 중질 분획의 분리를 허용하기에 충분한 미리 최적화 동안 ¹³ C가 풍부한 기판에 노출되어야한다. 우리의 경우는, ¹³ C-글루코스는 일일 (도 1a)에 대한 10 mM의 최종 농도 인공 사료에 첨가 하였다. 정상 글루코스 (도 1b)의 동일 량을 제어 곤충의 인공 사료에 공급 하였다. 전술 한 바와 같이, (라이터에서 울트라) DNA 분획의 분리는 전체 과정의 기초이다. 따라서, 수행되는 첫 번째 단계는 또한 조직으로부터 DNA를 추출이며,이 경우, 세균 여행자는 곤충 가트와 연관​​된. 품질을 확인하기 위해이 모든에서 모든 DNA는 물리 - 화학적 인 매개 변수의 분석에서 얻은 여부를 확인하기 위해 전기 영동 젤을 실행하는 것이 중요합니다제드 자형의 조직. 도 1C에서, 긍정적 DNA 추출.......

토론

대부분의 곤충의 창자는 풍부하고 복잡한 미생물 군집을 품고, 일반적으로 10 ~ ¹² -10 ⁹ 원핵 세포는 대부분의 경우 호스트의 자신의 세포를 상회하는, 거기에 제기. 따라서, 곤충의 창자는 상리 공생 ^(27)를 의무하는 기전에서 미생물 관계의 여러 측면을 대표하는 다양한 미생물의 활동에 대한 "핫 스팟"입니다. 많은 연구가 곤충 장내 미생물 사회의 놀라운 다양성을 설명했지만 장내 미생물의 대사 활동의 특성은 드물다. 안정 동위 원소 프로빙 방법은 현재 재배의 독립, 심지어 생체 내에서 복잡한 미생물의 배경에서 활동중인 회원을 구분하는 가능성을 제공합니다. 우리는 곤충의 모델 시스템,면 잎 웜 (스포 도프 테라 리토 랄)의 장내 미생물을 연구하기 위해이 유용한 도구를 적용했다. 포도당면 leafworm의 창자에있는 지배적 인 설탕이기 때문에,이 데모에서 우리는 고맙다을 공급인공 사료와 VAE는 창자 식물의 대사 활성.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dumont #5 미러 마감 펜치	파인 사이언스 도구	11251-23
Vannas 스프링 가위	파인 사이언스 도구	15000-00
속도 진공 집중 장치 5301	Eppendorf Germany	5305 000.304
플라스틱 유봉	Carl Roth GmbH Co. Germany	P986.1
NanoVue 분광 광도계	GE HealthCare, UK	28-9569-58
Mastercycler pro/thermocycler	Eppendorf Germany	6321 000.515
Agagel 표준 수평 젤 전기영동 챔버	Biometra	단종
초원심분리기 (Optima L-90K)	Beckman	A20684
초원심분리기 로터 (NVT 90)	Beckman	362752
HPLC 펌프	Agilent	1100
퀵-씰, 폴리알로머 튜브	Beckman	342412
트랜스일루미네이터 UVstar 15	바이옴트라