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방법 논문

생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 치료 혈관 신생에 대한 프로그래밍 줄기 세포

10.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50736

⸱

2013년 9월 27일

 ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Stanford University , 2Department of Bioengineering, Stanford University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 혈관 신생을위한 치료 인자를 과발현 프로그래밍 줄기 세포의 제조 방법을 설명한다. 설명 과정은 체외에서 지방 유래 줄기 세포를 형질 전환하고, 쥐의 뒷다리 허혈 모델에서 혈관 신생을 촉진하기 위해 프로그램 된 줄기 세포의 효능을 검증 고분자 합성 (가) 있습니다.

초록

제어 혈관 성장은 성공적인 조직 재생 및 상처 치료,뿐만 아니라, 뇌졸중, 심장 마비 또는 말초 동맥 질환과 같은 허혈성 질환의 치료에 중요하다. 혈관 신생 성장 인자의 직접 전달은 새로운 혈관의 성장을 자극 할 수있는 잠재력을 가지고 있지만, 종종 그러한 타겟팅 및 생체 내 짧은 반감기의 부족 등의 한계와 연관된다. 유전자 치료는 혈관 신생 인자를 코딩하는 유전자를 제공함으로써 다른 접근 방식을 제공하지만, 종종 바이러스를 사용해야하고, 안전 문제에 의해 제한된다. 여기에서 우리는 생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 현장에서 혈관 신생 인자를 과발현하는 프로그래밍 줄기 세포가 혈관 성장을 자극하기위한 최근에 개발 된 전략을 설명합니다. 특히 우리의 전략은 생체 내에서 허혈성 조직으로 마이그레이션 할 수있는 능력을 활용하여 배달 차량으로 줄기 세포를 이용했다. 최적화 된 고분자 벡터, 지방 - 유래를 사용하여줄기 세포는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 코딩하는 혈관 신생 유전자를 과발현하도록 변형되었다. 우리는 고분자 합성, 나노 입자 형성을, 시험 관내에서 줄기 세포를 형질 전환뿐만 아니라, 뮤린 뒷다리 허혈 모델에서 혈관 신생을 촉진 VEGF 발현하는 줄기 세포의 효능을 검증하기위한 방법에 대한 과정을 설명했다.

서론

이 기술의 전체적인 목적은 허혈 부위의 치료 인자를 과발현하는 비 바이러스 성 프로그래밍 된 줄기 세포를 이용한 치료 적 혈관 신생을 촉진하는 것이다. 줄기 세포는 실험실에서 합성 된 생분해 성 나노 입자를 이용하여 생체 먼저 수정 한 다음 혈관 및 조직의 회수를 향상을위한 자신의 잠재력을 확인하는 뒷다리 허혈의 쥐 모델에 이식했다.

제어 혈관 성장 중요한 성공적인 조직 재생의 성분뿐만 아니라, 뇌졸중, 허혈 및 심근 경색 등의 다양한 허혈성 질환의 치료이다. 몇 가지 전략이 성장 인자 전달 및 세포 기반 치료 등의 혈관 성장을 촉진하기 위해 개발되었다. 1 동물 질병 모델에서 관찰 된 효과에도 불구하고, 이러한 방법은 아직 부족과 같은 성장 인자 전달을위한 supraphysiological 복용의 필요성 등의 한계에 직면, 또는 주변 분비혼자 세포에 의해 방출. 상기 한계를 극복하기위한 하나의 잠재적 인 전략은 줄기 세포 치료 및 줄기 세포가 유 전적으로 바람직한 치료 인자를 과발현하는 생체 이식 이전에 프로그래밍되어있다 유전자 치료를 결합하는 것이다. 이 방법은 등 뒷다리 허혈이 심장병 3, 뼈 치유 4 및 신경 상해 05을 포함하는 다양한 질병 모델에서 증명되었다. 그러나, 대부분의 유전자 치료 기술은 잠재적 면역 원성 및 insertional 돌연변이 유발 등 안전성 문제와 관련된 바이러스 벡터에 의존하고 있습니다. 비 바이러스 성 유전자 전달을 매개 생체 적합 물질은 이러한 한계를 극복하지만, 종종 낮은 형질 전환 효율에서 고통을 수 있습니다. 효율적인 비 바이러스 성 유전자 전달을위한 새로운 생체​​ 적합 물질의 발견을 가속화하기 위하여, 최근의 연구는 조합 화학 및 높은 처리량 검사 방식을 채택했다. 폴리 (β-아미노 에스 등의 생분해 성 고분자 라이브러리TERS) (PBAE)는 기존의 고분자 벡터의 대응에 비해 크게 개선 된 형질 전환 효율을 선도하는 폴리머의 발견을 주도하는 개발 및 상영되었다. 6-7

여기서, 우리는 뒷다리 허혈의 쥐 모델에서 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 과발현하는 유전자 조작 ADSCs의 후속 이식이어서 PBAE의 합성 및 시험 관내 지방 - 유래 줄기 세포 (ADSCs)를 형질하는 능력의 확인을 설명 . 결과는 생물 발광 영상을 이용하여 세포의 운명을 추적하는 레이저 도플러 관류 영상 (LDPI)를 사용하여 조직의 재관류를 평가하고, 조직 학적으로 혈관 및 조직 회수를 측정하여 평가 하였다.

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프로토콜

1. 고분자 합성

  1. 흄 후드, 부탄디올 디 아크릴 레이트 (C)의 3,523 밀리그램을 무게와 교반 막대를 포함하는 유리 섬광 유리 병에 전송할 수 있습니다.
  2. 예열 5 - 아미노 -1 - 펜탄 (32) 소금을 용해하는 90 ° C에, 다음 몰비가 발생합니다 흄 후드, 1,533 mg의 32을 무게와이 방법 C.를 포함하는 섬광 유리 병에 추가 C의 : 32 = 1:1.2.
  3. 즉시 저어 접시에 두 솔루션을 포함하는 유리 병을 놓습니다. 600 rpm에서 교반 속도를 설정합니다.
  4. 90 ° C로 설정 오븐에 섬광 유리 병을 전송 4 시간 동안 1,000 rpm의 교반 속도를 설정합니다. 교반 막대가 걸리면, 속도를 낮 춥니 다. 4 시간 후, 낮은 300 rpm의 속도와는 다른 12 ~ 16 시간 동안 90 ° C로 유지한다.
  5. 교반 막대를 함유하는 유리 신틸레이션 바이알에 무수 테트라 히드로 푸란 (THF) 10 ㎖에 C32 5 g의 추가. 완전히 용해 될 때까지 높은에 호일 소용돌이에 싸.
  6. 별도의 유리 섬광 유리 병 콘타에서교반 막대 ining, Tetraethyleneglycoldiamine 10 MM (122)를 추가합니다. THF 40 ㎖를 추가합니다.
  7. 5 분 후 함께 결합을 위해 저어 접시에 두 병 (C32, 122)를 배치합니다. 호일 커버하고 24 시간 동안 400 rpm으로 교반 상온에서 둡니다. 최종 제품은 C32-122이라고한다.
  8. C32-122의 각 5g의 일괄 처리에 대한 5 × 50 ML 팔콘 튜브를 달다. 노트북의 각 튜브의 질량을합니다.
  9. 각 50 ㎖의 팔콘 튜브에 전송 무수 디 에틸 에테르 30 ㎖를.
  10. 전송 각 50 ㎖ 팔콘 튜브에 C32-122의 10 ㎖.
  11. 소용돌이 팔콘 튜브는 적극적으로 다음 2 분 동안 2,500 rpm으로 원심 분리기. 참고 : 추출 된 폴리머 튜브의 바닥에 수집합니다.
  12. 상위 솔루션을 취소하고 단계 1.9과 1.11를 두 번 더 반복합니다.
  13. 하룻밤 건조기 및 진공 추출 된 C32-122를 포함하는 오픈 튜브를 놓습니다. 확인 모든 튜브는 빛으로부터 보호됩니다.
  14. 의 최종 질량을 결정하기 위해 C32-122을 포함하는 모든 튜브의 무게를추출 고분자.
  15. 100 ㎎ / ㎖의 농도에서 무수 DMSO에서 추출 된 중합체를 용해.
  16. 빛과 습기로부터 보호 -20 ° C에서 용해 된 폴리머를 저장합니다.

2. 셀 시드

  1. 프리 코트 0.1 % (중량 / 부피) 젤라틴과 T-150 조직 배양 플라스크의 기본. 젤라틴은 30 ~ 45 분 동안 플라스크에 남아 있어야. 젤라틴 코팅 ADSCs의 부착을 할 수 있습니다.
  2. 사전 코팅 T-150 플라스크에서 대기음 젤라틴.
  3. 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 10 NG / ML bFGF와를 포함하는 DMEM 20 ㎖의 플라스크에 4 × 10 6 ADSCs (≤ 통로 (3))를 추가합니다.
  4. 37 ° C, 밤새 5 % CO 2의 인큐베이터에서 T-150 플라스크를 놓습니다.
  5. 다음날 형질 전환 절차를 시작합니다.

3. 나노 입자의 제조 및 형질

  1. 다음 절차는 당 16.1 μg 플라스미드 DNA를 함유하는 나노 입자의 제조이다30:1의 중량비 플라스미드 중합체에서 1.0 × 10 6 세포.
  2. 플라스미드 DNA (1 ㎎ / ㎖, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) 15 ML 팔콘 튜브에 아세트산 나트륨 (25 ㎜)에있는 120 μg / ML의 최종 농도로 희석한다.
  3. 제 15 ㎖의 팔콘 튜브에서 아세트산 나트륨 (25 ㎜)에 3.6 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 C32-122 (100 ㎎ / ㎖)으로 희석한다.
  4. 바로 10 초에 대한 높은에서 하나의 15 ML 팔콘 튜브와 소용돌이에 각 팔콘 튜브의 내용을 결합합니다.
  5. 튜브가 생기는 나노 입자 형성을위한 10 분 동안 실온에서 앉아 보자.
  6. 잠복기 동안, 형질 1.0 × 10 6 세포 당 7.8 ㎖를 완전히 보충 DMEM과 조직 배양 플라스크에 매체를 교체하십시오.
  7. 조직 배양 플라스크에 나노 입자 용액을 전송하고 앞으로 기울고 뒤로 균등하게 확산.
  8. 37 ° C, 4 시간 동안 5 % CO 2의 배양기에서 조직 배양 플라스크를 놓습니다.
  9. 2 시간 후, nanopar 대체DMEM으로 미디어를 포함거나 기사.
  10. 37 ° C, 5 % CO 2에서 추가로 2 시간 배양 한 후, 세포가 생체 내 주입을위한 준비가되어 있습니다.

4. 뒷다리 허혈 절차

  1. 모든 실험은 스탠포드 대학의 동물 관리 및 사용위원회 지침 및 승인 APLAC 프로토콜에 따라 수행되었다. 뒷다리 허혈의 쥐 모델을 생성하는 것은 전술 한 바와 같이 수행된다. 8 자세한 내용에 대한 참조를 참조하십시오. 간단한 설명은 아래에 제공됩니다.
  2. 흡입 / 분 1 L의 산소 유량에 의해 3 % 투여 이소 플루 란으로 마취 마우스를 놓습니다. 발가락 핀치, 호흡 수 감소, 무기력에 의해 마취 깊이를 확인합니다.
  3. 면도 크림 마우스의 복부 및 양쪽 뒷다리 영역에서 머리를 제거합니다.
  4. 중간 선을 향해 안쪽 허벅지의 중앙에 절개를 한 후 전직에 놓인 지방 패드를 통해 절단대퇴 동맥을 제기.
  5. 원심 사이트 (무릎 부근)와 인접 사이트 (사타구니 인대 단지 말초) : 두 개의 사이트에서 동맥을 결찰.
  6. ligations를 만들려면, 정맥 동맥을 분리하고 동맥 주위에 5-0 실크 봉합사를 스레드. 결찰을하기 위해 두 개의 노트와 동맥을 묶어.
  7. 두 결찰 점 사이의 동맥을 제거합니다.
  8. PBS로 수술 부위를 씻어 후 봉합 절개 마감했다.
  9. 마취는 이제 제거 할 수 있습니다. 다시 각성 할 때까지 마우스를 따뜻하게 유지합니다. 수술 치료의 경우, 2 ~ 4 ㎎ / ㎏ 리도카인은 절개 사이트에서 피하 다시 각성하기 전에 주입 할 수있다. 또한 통증 관리 (12)과 24 시간에 0.05 ~ 0.1 ㎎ / ㎏ 프레 놀핀의 피하 배달을 포함 할 수있다. 호흡 패턴 명백한 통증이나 고통과 피부 색의 변화를 관찰함으로써 이레 동안 하루에 한 번 마우스의 건강 상태를 모니터링한다.
  10. 레이저 도플러 관류 영상으로 뒷다리의 허혈을 확인합니다.

5. 세포 주입

  1. 형질 세포와 쥐가 준비가되면,를 Trypsinize, PBS와 원심 분리기를 형질 전환 세포를 세척하고 계산합니다.
  2. PBS에 ML 당 10 × 10 6 세포의 밀도로 세포를 Resuspend.
  3. 세포 현탁액 110 μL의 볼륨에서 별도의 에펜 도르프 튜브로 분리되어야한다. 이것은 각각의 마우스는 세포의 동일한 금액을받을 수 있도록합니다.
  4. (2.5 % 이소 플루 란, 1 L / 분 산소 유량) 마취하에 각 마우스를 놓습니다.
  5. 알코올 물티슈 주사 부위를 청소합니다.
  6. 27 G의 투베르쿨린 주사기를 활용하여, 균일 한 현탁액을 달성하기 위해 주사기에 위아래로 세포를 그립니다. 주사기로 세포 현탁액 볼륨의 100 μL를 그립니다.
  7. 관자 영역으로 반 세포 현탁액을 주입 한 후 종아리 근육 영역으로 나머지 절반을 주입. 주입하면, 적어도 15 ~ 30 초에 그 자리에 주사기를 남겨세포 현탁액의 유출을 방지한다.
  8. 동물 연구에 대한 적절한 컨트롤은 다음을 포함한다 : 비 코딩 플라스미드 (생물학적 활성을 가진 예를 들면 플라스미드)로 형질 1) 세포, 단독 2) 세포 3) PBS를.
  9. 주입이 완료되면, 마취에서 마우스를 제거하고 마우스 재 각성 할 때까지 따뜻하게 유지.

6. 생물 발광 이미징

  1. 생물 발광 영상 (BLI)을 시작하기 위해, 전술 한 바와 같이 마우스를 마취.
  2. 알코올 물티슈 주사 부위를 청소합니다.
  3. 활용 인슐린 주사기, 15 ㎎ / ㎖의 D-루시페린 (반딧불 루시 페라 제의 기판)의 부하 100 μL. 멀리 빛으로부터 기판을 유지합니다.
  4. 복강 내 주사를 수행하기 위해, 자신의 앞쪽에 피부가 팽팽하게 당겨 자신의 뒤의 피부에 마우스를 개최합니다. 복강 복부에 바늘을 삽입하고 기판의 100 μl를 주입.
  5. 마취 IVIS 루시 페라 영상 실에서 마우스를 놓습니다.
  6. 1.0 분의 노출 시간을 이미지 마우스. 파라미터가 설정된 경우에, 이미지를 획득하기 시작한다.
  7. 화상이 획득 될 때, 루시퍼 신호를 측정하기 위해 관심 영역을 표시한다. 이 경우, 세포 주입 부위에서의 허혈성 사지를 표시한다.
  8. 신호가 피크에 도달하고 감소하기 시작할 때까지 루시퍼 신호마다 3-5 분을 측정하는 것을 계속한다. 이 생쥐에 걸쳐 여러 시점에 비교를 위해 사용되는 값입니다.
  9. 완료되면, 챔버 및 마취에서 마우스를 제거합니다. 다시 각성 할 때까지 따뜻한 마우스를 유지합니다.

7. 레이저 도플러 관류 영상

  1. 레이저 도플러 관류 영상은 전술 한 바와 같이 수행된다. 8 절차를 간략히 설명합니다.
  2. 이전 마우스 인해 머리에 유물을 방지하기 위해 뒷다리와 복부 모두를 덮는 부분에 깔끔하게 면도해야한다 이미징 도플러.
  3. 도플러 이미지를 준비 할 때, MOU 체결전술 한 바와 같이 SE 마취한다.
  4. 직장 온도계로 체온을 모니터링하면서 핫 플레이트에서 36 ° C에 마우스를 따뜻하게.
  5. 비 반사 검은 화면에 마우스를 놓고 코 콘에 의해 마취 유지. 마우스는 사지가 균등하게 노출과의 등쪽면에 배치해야합니다.
  6. 대략 15cm 위에 마우스 및 쥐의 서혜부 영역쪽으로 센서로부터 레이저 포인터 연출 레이저 도플러 센서를 위치.
  7. 마우스 및 도플러 센서 위치에있을 때, 이미지는 시작 버튼을 눌러 LDPIwin 소프트웨어를 이용하여 수행 될 수있다.
  8. 상대 관류 측정 이익 (ROI)의 영역으로 (허혈성 및 비 허혈성) 두 뒷다리를 지정하여 수행 할 수 있습니다. 비 허혈성 뒷다리에 허혈의 평균 관류의 비율이 상대적으로 관류를 나타냅니다.

8. 조직 수확 절차

  1. 수확 마우스 TIS에 준비 할 때조직학 및 / 또는 생화학 적 처리를 위해 소송을 제기, 마우스를 안락사되어야한다. 여기에, 마우스는 자궁 경부 전위로 마우스를 안락사 후, 3 ~ 5 분 동안 5 %의 이소 플루 란에 노출에 의해 안락사된다.
  2. 뒷다리에 원심 복부 근위에서 원주 방향으로 뒷다리를 둘러싼 위에있는 피부를 잘라. 피부는 피부가 다리에 뒷다리에 철수 할 수 있도록, 등의 표면에 복부에서 절단됩니다.
  3. 피부를 후퇴하면, 다리는 골반과 대퇴골 관절에서 절단하는 무딘 해부 가위를 이용하여 절단 할 수있다.
  4. 두 가지 주요 조직은 분석을 위해 촬영 : 중간 내전근 근육과 비복근 근육을.
  5. 조직학 들어 저온 절편 제작을위한 최적의 절단 온도 (10 월)에서 한쪽 또는 양쪽 조직을 포함.
  6. 생화학 적 분석을 위해, 1.5 ㎖의 에펜 도르프에 하나 또는 두 조직을 수집하고, 적어도 2 분간 액체 질소 욕에 잠기. 샘플이 될 수 있습니다미래의 처리를 위해 -80 ° C에 저장됩니다.

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결과

함께 혼합하면, 나노 입자에 긍정적으로 충전 된 폴리머 (C32-122)과 음으로 충전 된 DNA 플라스미드 자기 조립. C32-122와 플라스미드 DNA 사이의 복합체는 전기 영동시 DNA의 동원을 방지한다, 즉 나노 입자의 형성은 전기 영동 분석을 통해 확인할 수있다. 중합체는 표적 세포로 DNA의 향상된 흡수 및 인코딩 단백질의 연속 식 (도 2)를 용이하게 형질 감염 시약로서 기능한다. 세포는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)과 형광 현미경 (그림 3)를 사용하여 고효율 고분자 벡터 디자인 및 형질 전환 조건의 빠른 최적화를 촉진하는 등 녹색 형광 단백질 (GFP) 같은 치료 유전자 또는 리포터 DNA로 형질 할 수 있습니다. ADSCs 들어, 20 % 이상 효율이 적합한 것으로 간주된다.

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토론

여기에서 우리는 비 바이러스 성, 생분해 성 나노 입자를 사용하여 치료 인자를 과발현하는 성체 줄기 세포를 프로그래밍하는 방법을보고한다. 이 플랫폼은 국소 빈혈과 암으로, 여기서 줄기 세포가 있습니다 자연스럽게 집 질환의 치료에 특히 유용합니다. 또한, 비 바이러스 성 유전자 전달 플랫폼은 대부분의 조직 재생 및 상처에 적합한 치료 적 요인의 일시적인 과잉 발현을 허용 9-10 프로세스를 치유. 형질 전환 과정은 세포에 효율적으로 DNA 항목에 따라 다르며, 일반적으로 비 분할 세포에서뿐만 아니라하지 활발히 분열하는 세포 유형에서 잘 작동하지만. PBAE 중합체의 형질 전환 효율은 세포 유형에 세포 유형에 따라 다를 수 있고, 개별적으로 최적화되어야하고, 또한 화학 구조의 변형이 특정 표적 세포 집단에서 최적의 형질 전환 효율을 달성하기 위하여 탐구 할 수있다. 상기 한 방법으로 형질 11-12 셀 일반적으로 난 결과하루에 2-4 주위에 달성 피크 유전자 발현 두 주 동안 일시적인 유전자...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

저자는 자금 조달을 위해 미국 심장 협회 (American Heart Association) 국가 과학자 개발 그랜트 (10SDG2600001), 스탠포드 바이오 X 학제 프로그램, 스탠포드 의료 학자 연구 프로그램을 인정하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMInvitrogen11965
소 태아 혈청Invitrogen10082
페니실린/스트렙토마이신Invitrogen15070
기본 섬유아세포 성장 인자Peprotech100-18B
1,4-Butanediol Diacrylate (90 %)Sigma Aldrich411744약어: C
5- 아미노 -1- 펜탄올 (97 %)알파 Aesar2508-29-4약어 : 32
테트라 에틸렌 글리콜 디아민 > 99 %)분자 생명 과학17774약어 : 122
나트륨 아세테이G-BiosciencesR010
인산 완충 식염수Invitrogen14190-144
테트라 히오 푸란 무수 (> 99.9 %)시그마 알드리치401757
디에틸 에테르 무수 (> 99 %)피셔 사이언티픽E138-4
DMSO 무수 (> 99.9 %), 시그마 알드리치, 276855
젤라틴시그마 알드리치G9391
트립신-EDTA,인비트로젠25200
D-루시페린, GoldBio
최적 절삭 온도(O.C.T)티슈-텍4583
쥐, 안티 마우스 CD31BD, 파밍겐
알렉사 Fluor 594 항-쥐 IgGInvitrogenA11007
트 , , , , , , , 550274

참고문헌

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  15. Glover, D. J., Lipps, H. J., Jans, D. A. Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans. Nat. Rev. Genet. 6, 299-310 (2005).
  16. Dave, U. P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Gene therapy insertional mutagenesis insights. Science. 303, 333(2004).

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