생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 치료 혈관 신생에 대한 프로그래밍 줄기 세포

Summary

우리는 생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 혈관 신생을위한 치료 인자를 과발현 프로그래밍 줄기 세포의 제조 방법을 설명한다. 설명 과정은 체외에서 지방 유래 줄기 세포를 형질 전환하고, 쥐의 뒷다리 허혈 모델에서 혈관 신생을 촉진하기 위해 프로그램 된 줄기 세포의 효능을 검증 고분자 합성 (가) 있습니다.

Abstract

제어 혈관 성장은 성공적인 조직 재생 및 상처 치료,뿐만 아니라, 뇌졸중, 심장 마비 또는 말초 동맥 질환과 같은 허혈성 질환의 치료에 중요하다. 혈관 신생 성장 인자의 직접 전달은 새로운 혈관의 성장을 자극 할 수있는 잠재력을 가지고 있지만, 종종 그러한 타겟팅 및 생체 내 짧은 반감기의 부족 등의 한계와 연관된다. 유전자 치료는 혈관 신생 인자를 코딩하는 유전자를 제공함으로써 다른 접근 방식을 제공하지만, 종종 바이러스를 사용해야하고, 안전 문제에 의해 제한된다. 여기에서 우리는 생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 현장에서 혈관 신생 인자를 과발현하는 프로그래밍 줄기 세포가 혈관 성장을 자극하기위한 최근에 개발 된 전략을 설명합니다. 특히 우리의 전략은 생체 내에서 허혈성 조직으로 마이그레이션 할 수있는 능력을 활용하여 배달 차량으로 줄기 세포를 이용했다. 최적화 된 고분자 벡터, 지방 - 유래를 사용하여줄기 세포는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 코딩하는 혈관 신생 유전자를 과발현하도록 변형되었다. 우리는 고분자 합성, 나노 입자 형성을, 시험 관내에서 줄기 세포를 형질 전환뿐만 아니라, 뮤린 뒷다리 허혈 모델에서 혈관 신생을 촉진 VEGF 발현하는 줄기 세포의 효능을 검증하기위한 방법에 대한 과정을 설명했다.

Introduction

이 기술의 전체적인 목적은 허혈 부위의 치료 인자를 과발현하는 비 바이러스 성 프로그래밍 된 줄기 세포를 이용한 치료 적 혈관 신생을 촉진하는 것이다. 줄기 세포는 실험실에서 합성 된 생분해 성 나노 입자를 이용하여 생체 먼저 수정 한 다음 혈관 및 조직의 회수를 향상을위한 자신의 잠재력을 확인하는 뒷다리 허혈의 쥐 모델에 이식했다.

제어 혈관 성장 중요한 성공적인 조직 재생의 성분뿐만 아니라, 뇌졸중, 허혈 및 심근 경색 등의 다양한 허혈성 질환의 치료이다. 몇 가지 전략이 성장 인자 전달 및 세포 기반 치료 등의 혈관 성장을 촉진하기 위해 개발되었다. ¹ 동물 질병 모델에서 관찰 된 효과에도 불구하고, 이러한 방법은 아직 부족과 같은 성장 인자 전달을위한 supraphysiological 복용의 필요성 등의 한계에 직면, 또는 주변 분비혼자 세포에 의해 방출. 상기 한계를 극복하기위한 하나의 잠재적 인 전략은 줄기 세포 치료 및 줄기 세포가 유 전적으로 바람직한 치료 인자를 과발현하는 생체 이식 이전에 프로그래밍되어있다 유전자 치료를 결합하는 것이다. 이 방법은 등 뒷다리 ^허혈이 심장병 ^3, 뼈 치유 ⁴ 및 신....

Protocol

1. 고분자 합성

1. 흄 후드, 부탄디올 디 아크릴 레이트 (C)의 3,523 밀리그램을 무게와 교반 막대를 포함하는 유리 섬광 유리 병에 전송할 수 있습니다.
2. 예열 5 - 아미노 -1 - 펜탄 (32) 소금을 용해하는 90 ° C에, 다음 몰비가 발생합니다 흄 후드, 1,533 mg의 32을 무게와이 방법 C.를 포함하는 섬광 유리 병에 추가 C의 : 32 = 1:1.2.
3. 즉시 저어 접시에 두 솔루션을 포함하는 유리 병을 놓습니다. 600 rpm에서 교반 속도를 설정합니다.
4. 90 ° C로 설정 오븐에 섬광 유리 병을 전송 4 시간 동안 1,000 rpm의 교반 속도를 설정합니다. 교반 막대가 걸리면, 속도를 낮 춥니 다. 4 시간 후, 낮은 300 rpm의 속도와는 다른 12 ~ 16 시간 동안 90 ° C로 유지한다.
5. 교반 막대를 함유하는 유리 신틸레이션 바이알에 무수 테트라 히드로 푸란 (THF) 10 ㎖에 C32 5 g의 추가. 완전히 용해 될 때까지 높은에 호일 소용돌이에 싸.
6. 별도의 유리 섬광 유리 병 콘타에서교반 막대 ining, Tetraethyleneglycoldiamine 10 MM (122)를 추가합니다. THF 40 ㎖를 추가합니다.
7. 5 분 후 함....

Results

함께 혼합하면, 나노 입자에 긍정적으로 충전 된 폴리머 (C32-122)과 음으로 충전 된 DNA 플라스미드 자기 조립. C32-122와 플라스미드 DNA 사이의 복합체는 전기 영동시 DNA의 동원을 방지한다, 즉 나노 입자의 형성은 전기 영동 분석을 통해 확인할 수있다. 중합체는 표적 세포로 DNA의 향상된 흡수 및 인코딩 단백질의 연속 식 (도 2)를 용이하게 형질 감염 시약로서 기능한다. 세포는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)과 형광 현미경 (그림 3)를 사용하여 고효율 고분자 벡터 디자인 및 형질 전환 조건의 빠른 최적화를 촉진하는 등 녹색 형광 단백질 (GFP) 같은 치료 유전자 또는 리포터 DNA로 형질 할 수 있습니다. ADSCs 들어, 20 % 이상 효율이 적합한 것으로 간주된다.

세포의 운명 포스트 transplanta의 추적을 용이하게하기 위해기, 세포는 안정하게 비 침습적 생.......

Discussion

여기에서 우리는 비 바이러스 성, 생분해 성 나노 입자를 사용하여 치료 인자를 과발현하는 성체 줄기 세포를 프로그래밍하는 방법을보고한다. 이 플랫폼은 국소 빈혈과 암으로, 여기서 줄기 세포가 있습니다 자연스럽게 집 질환의 치료에 특히 유용합니다. 또한, 비 바이러스 성 유전자 전달 플랫폼은 대부분의 조직 재생 및 상처에 적합한 치료 적 요인의 일시적인 과잉 발현을 허용 ^9-10 프로세스를 치유. 형질 전환 과정은 세포에 효율적으로 DNA 항목에 따라 다르며, 일반적으로 비 분할 세포에서뿐만 아니라하지 활발히 분열하는 세포 유형에서 잘 작동하지만. PBAE 중합체의 형질 전환 효율은 세포 유형에 세포 유형에 따라 다를 수 있고, 개별적으로 최적화되어야하고, 또한 화학 구조의 변형이 특정 표적 세포 집단에서 최적의 형질 전환 효율을 달성하기 위하여 탐구 할 수있다. 상기 한 방법으로 형질 ^11-12 셀 일반적으로 난 결과하루에 2-4 주위에 달성 피크 유전자 발현 두 주 동안 일시적인 유전자.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
소 태아 혈청	Invitrogen	10082
페니실린/스트렙토마이신	Invitrogen	15070
기본 섬유아세포 성장 인자	Peprotech	100-18B
1,4-Butanediol Diacrylate (90 %)	Sigma Aldrich	411744	약어: C
5- 아미노 -1- 펜탄올 (97 %)	알파 Aesar	2508-29-4	약어 : 32
테트라 에틸렌 글리콜 디아민 > 99 %)	분자 생명 과학	17774	약어 : 122
나트륨 아세테이	G-Biosciences	R010
인산 완충 식염수	Invitrogen	14190-144
테트라 히오 푸란 무수 (> 99.9 %)	시그마 알드리치	401757
디에틸 에테르 무수 (> 99 %)	피셔 사이언티픽	E138-4
DMSO 무수 (> 99.9 %)	, 시그마 알드리치	, 276855
젤라틴	시그마 알드리치	G9391
트립신-EDTA,	인비트로젠	25200
D-루시페린	, GoldBio
최적 절삭 온도(O.C.T)	티슈-텍	4583
쥐, 안티 마우스 CD31	BD, 파밍겐
알렉사 Fluor 594 항-쥐 IgG	Invitrogen	A11007