1D 및 2D 1HNMR을 사용한 펩타이드-금속 복합체의 구조 및 배위 측정

Summary

Cu(I)를 갖는 메탈로샤페론 모델 펩타이드의 NMR 용액 구조를 결정하고, 시료 준비, 1D 및 2D 데이터 수집에서 3차원 구조에 이르는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

메탈로샤페론 수송 단백질에 의한 구리(I) 결합은 유해한 산화 환원 반응에 참여할 수 있는 독성 이온의 구리 산화 및 방출을 방지합니다. 서열 MTCSGCSRPG(밑줄이 그어진 것이 보존됨)를 포함하는 Cu(I) 결합 메탈로샤페론 단백질의 펩타이드 모델의 Cu(I) 복합체는 NMR 분광법에 의해 불활성 조건하의 용액에서 측정되었습니다.

NMR은 단백질과 펩타이드의 용액 구조를 결정하기 위해 널리 인정되는 기술입니다. X선 결정학에 적합한 단결정을 제공하기 위한 결정화의 어려움으로 인해 NMR 기술은 특히 고체 상태가 아닌 용액 상태에 대한 정보를 제공하기 때문에 매우 가치가 있습니다. 여기에서는 NMR에 의한 완전한 3차원 구조 결정에 필요한 모든 단계를 설명합니다. 이 프로토콜에는 NMR 튜브의 시료 준비, 1D 및 2D 데이터 수집 및 처리, 피크 할당 및 통합, 분자 역학 계산 및 구조 분석이 포함됩니다. 중요한 것은 사전 설정된 금속-리간드 결합 없이 분석이 먼저 수행되어 편향되지 않은 방식으로 신뢰할 수 있는 구조 결정을 보장한다는 것입니다.

Introduction

펩타이드는 단백질 모델, 잠재적인 약물 선도 물질 및 치료제로 널리 사용됩니다. 그러나 작은 크기와 높은 수준의 유연성으로 인해 결정화의 어려움으로 인해 X-ray에 의한 구조 결정이 불가능한 경우가 많습니다.

핵자기공명(NMR)은 펩타이드 구조 및 상호 작용을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 국소 및 전체 구조, 결합 및 낮은 친화성 상호 작용에 관한 정보를 제공할 수 있으며 용액 상태에서 수행할 수 있으므로 어려운 샘플에 적용할 수 있습니다.

생물학적 시스템에서 구리 수송은 Cu (I) 이온을 특이적으로 결합하고 일련의 단백질-단백질 상호 작용을 통해 표적 단백질에 전달하는 세포 내 구리 메탈로샤페론 단백질에 의해 이루어져, 이온이 산화되는 것을 방지하고 독성 구리^2-5의 방출을 방지합니다. 결합 부위는 보존된 서열 MXH/TCXanyXanyC를 특징으로 하며, 이는 NMR 및 결정학에 의해 Cu(I)를 두 시스테인 잔기의 부드러운 티올라토 리간드에 결합하는 것으로 나타났지만, 추가 외부 리간드도^6-8 제안되었습니다. 이러한 단백질의 구조-기능 관계는 집중적인 연구의 주제였습니다⁹.

여기에 제시된 연구에서는 구리 메탈로샤페론의 보존된 서열을 포함하는 펩타이드 모델을 합성하고 불활성 환경에서 Cu(I)와 반응시켰습니다. 제시된 프로토콜은 샘플 준비, 데이터 수집, 데이터 처리, 구조 생성 및 구조 분석을 포함하여 NMR에 의한 구조 결정 단계를 설명합니다. 분석은 두 단계로 수행되었습니다.첫 번째 구조는 구리 이온에 대한 펩타이드의 결합 모드에 관한 정보 없이 생성되었습니다. 바인딩 모드가 경험적으로 설정되면 고해상도 구조를 제공하기 위해 이러한 제약 조건이 도입되었습니다. 바인딩 모드는 모델의 필수 포인트이므로 편향되지 않은 방식으로 결정되었습니다.

모델 펩타이드의 NMR 구조 측정은 화학자와 생물학자가 자주 사용하는 매우 가치 있는 기술입니다. 그것은 다른 조건 하에서 다른 펩티드에 상대적으로 쉽게 적용될 수 있으며, 따라서 관련 메커니즘에 대한 실마리를 제공할 수 있습니다¹⁰. 구조 규명 과정을 이해하면 제안된 구조의 강점과 약점을 더 잘 이해할 수 있습니다.

Protocol

1. 샘플 준비

1. Apo-sample: 약 1-2mg의 펩타이드를 450-500μl의 중수소화 NMR 등급 용매에 용해시킵니다(생물학적 샘플에 대한 바람직한 용액은 물에 10% D2O 또는 샘플이 물에 용해되지 않거나 반응하는 경우 d6-DMSO ^11-12).
2. 구리 반응 샘플: 약 1-2mg의 펩타이드를 450-500μl의 NMR 용매에 등몰량의 금속염으로 용해시킵니다.
3. 소결 유리, 여과지 또는 조사 중인 화합물에 적합하고 흡착되지 않는 기타 기술을 사용하여 용액을 여과합니다. 이것은 균질성에 영향을 미치는 금속 입자를 제거하는 데 필수적입니다.
4. 용액을 NMR 튜브로 옮기고 닫습니다. 튜브 품질이 사용된 자석 강도에 맞는지 확인하십시오(자세한 내용은 장비 표 참조).
5. 샘플이 산소에 민감한 경우 이러한 단계는 불활성 환경에서 수행해야 하며 산화를 방지하기 위해 튜브를 밀봉해야 합니다.

2. NMR 데이터 수집 및 처리¹³

1. apo 및 구리 반응 샘플의 1D ¹H 스펙트럼을 기록하고 비교합니다. 구리 함유 펩타이드 스펙트럼은 아미드 영역에서 화학적 변화의 상당한 변화를 보여야 하며 아포-펩타이드가 유연하고 평균적인 형태를 나타내기 때문에 피크가 분해되었지만 구리와 반응할 때 결합 펩타이드 아미드는 단일 구조를 갖습니다(그림 2).
   1. 스펙트럼이 변경되지 않으면 반응이 실패한 것으로 가정합니다.
   2. 샘플이 녹색으로 변하면 구리가 대기 중에서 산화되어 결합 특성이 변경될 수 있습니다.
   3. 이 두 경우 모두 샘플을 다시 만들어야 합니다.
2. 좁은 선 너비로 아미드 잔류물의 겹침을 최소화하는 NMR 측정을 위한 최적의 온도 조건을 찾습니다.
3. 동일한 조건(온도, pH 등)에서 COSY¹⁴, TOCSY¹⁵ 및 NOESY¹⁶ 또는 ROESY¹⁷ NMR 실험을 설정하고 순서대로 실행합니다.
   1. COSY(그림 3) 및 TOCSY(그림 4) 실험은 각각 인접 및 장거리 인접 양성자-양성자 상호 작용의 결합 통과 상호 작용을 감지합니다. COSY 스펙트럼은 HN-Hα 상관 관계에 대한 정보를 제공하는 반면 TOCSY 스펙트럼은 상관 잔기의 HN 및 기타 H 지방족 양성자에 대한 정보를 제공합니다.
   2. NOESY 및 ROESY(그림 5) 실험은 구조 정보를 제공하기 위해 결합에 의존하지 않고 공간을 통한 근접성을 감지합니다. 둘 사이의 선택은 화합물의 유효 크기와 전계 강도에 따라 다릅니다. 이러한 조합 중 일부는 이론적인 제로 신호를 제공하며(그림 6) NOE 상호 작용^10,18을 감지하기 위해 ROESY 실험을 실행해야 합니다.
   3. 샘플이 물 속에 있는 경우 실험에는 수분 억제 구성 요소가 있어야 합니다. 이것은 경사도¹⁹를 사용하여 가장 효율적으로 수행됩니다. 이 경우, Hα 수소에 대한 상호 작용을 얻기 위해 순수_D2O에서 일단 할당되면 샘플을 다시 실행하여 유리합니다.
   4. 스핀 확산에 대한 손실을 최소화하면서 최대 신호 축적을 찾기 위해 여러 가지 짧은 실험을 실행하여 TOCSY 및 NOESY 또는 ROESY 혼합 시간의 지속 시간을 최적화합니다. 이것이 빌드업 곡선의 선형 영역인지 확인하십시오. 600MHz 필드에서 펩타이드에 대한 일반적인 값에는 TOCSY의 경우 약 100msec, NOESY 또는 ROESY 실험의 경우 150msec의 혼합 시간이 포함됩니다.
   5. 각 실험 사이에 1D 실험을 실행하여 데이터 수집 전반에 걸쳐 샘플 조성이 일정하게 유지되는지 확인합니다(그림 7).
4. 적절한 아포다이제이션 기능을 사용하여 스펙트럼을 처리하여 신호 강도의 손실을 최소화하면서 최대 분해능을 얻고 t1 차원에 영점 충전을 추가합니다.
   1. F2 차원에서 F1 차원의 기준선을 2차 다항식 함수로 추가로 수정합니다.
   2. 알려진 표준물질(각각 TMSP 또는 TMS)로부터의 이동에 따라 각 용매의 잔류 수분 또는 DMSO 피크에 따라 스펙트럼의 화학적 이동을 신중하게 보정합니다.

3. SPARKY²⁰을 사용한 피크 할당 및 통합

1. NOESY 또는 ROESY 스펙트럼에 중첩된 COSY 및 TOCSY 스펙트럼 세트를 준비합니다(그림 8).
2. Wüthrich²¹에서 개발한 순차 할당 방법론에 따라 스펙트럼의 모든 NOE 피크를 할당합니다.
   1. 지문 영역에서 TOCSY 신호와 겹치는 피크를 할당하는 것부터 시작하면 SPARKY 프로그램을 사용하여 후속 피크 할당을 용이하게 할 수 있습니다(그림 9). 할당 화학적 이동(그림 10) 및 ^3JHNHα 값(그림 11)을 등록합니다.
3. 피크를 거리 제약 조건으로 변환하고 ^3JHNHα 값을 이면각으로 변환합니다.
   1. 이는 프로그램 내에서 피크를 통합하고 알려진 거리의 상호 작용(예: 메틸렌기의 두 양성자 또는 방향족 아미노산의 방향족 수소 원자 사이의 거리)을 사용하여 거리 제약 조건으로 변환하여 수행할 수 있습니다.
   2. 피크가 겹치고 적분 방법을 사용할 수 없는 경우 시각적 추정을 통해 강-중간-약함-매우 약함으로 레이블을 지정할 수 있으며 이러한 지정은 각각 최대 2.5, 3.5, 4.5 및 5.5Å의 거리로 변환될 수 있습니다. 이것은 펩티드와 함께 일할 때 가장 효과적입니다.
   3. ³JHNHα 값은 Karplus 방정식에 따라 이면각을 나타내며, 대부분의 주어진 결합 값은 둘 이상의 이면각에서 발생할 수 있습니다. 이는 2차 구조(나선 또는 시트), 무작위 코일 또는 이의 구조적 평균을 나타낼 수 있습니다. 따라서 제약 조건을 신중하게 사용하거나 구조적 결과를 확인하는 데 사용하는 것이 중요합니다.

4. XPLOR22를 사용하여 구조 앙상블을 생성하기 위한 분자 역학 계산

1. 거리 제약 조건과 이면각을 XPLOR에 대한 올바른 형식으로 가져옵니다. (그림 12, 잔차 간 제약 조건만 해당). XPLOR는 구조적 공간을 검색하여 실험적으로 발견된 거리 제약 조건 외에도 결합 길이, 각도, 키랄성 등과 같은 표준 기하학적 화학적 제약 조건을 준수하는 구조를 찾아 위의 매개변수 중 어느 것도 위반되지 않는 앙상블을 생성합니다. 이것이 선발 앙상블을 구성합니다.
2. 첫 번째 구조 결정 실행은 금속에 대한 제약 조건을 사용하지 않고 수행됩니다. 이것은 어떤 잔류물이 편향 없이 금속 결합에 참여하는지 보여줍니다. 4.4단계로 건너뜁니다.
3. NMR 유래 거리 제약 조건 외에도 결정된 잔기에 금속 결합 제약 조건을 추가합니다.
   1. 금속 이온과 그 토폴로지를 설명하기 위해 적절한 파라미터를 추가합니다.
   2. 적절한 물리적 정보(질량, 다른 원자와의 결합 길이, 각도 및 비결합 반발 매개변수)를 매개변수 파일에 넣어야 합니다.
   3. 토폴로지 파일에 바인딩 정보를 추가합니다: 어떤 결합이 형성되고 끊어지며 바인딩의 결과로 어떤 공식 전하가 변경되는지.
4. 보통 10명으로 구성된 소규모 앙상블을 만듭니다.
   1. 백본-백본 상호 작용에서 시작하여 백본-사이드체인, 사이드체인-사이드체인 상호 작용, 잔여 내 순차 상호 작용에서 점점 더 긴 범위의 상호 작용으로 이동하여 제약 조건을 점진적으로 도입합니다. 이렇게 하면 할당의 실수를 쉽게 식별할 수 있습니다.
   2. NOE 에너지를 50kcal/mol•Å²의 일정한 힘 상수를 갖는 제곱 웰 전위로 소개합니다. 시뮬레이션된 어닐링은 1,500K에서 1,500개의 3-fsec 단계와 500K로 냉각하는 동안 3,000개의 1-fsec 단계로 수행해야 합니다. 마지막으로, 4,000회 반복 동안 켤레 기울기 에너지 최소화를 사용하여 구조를 최소화합니다. 이는 XPLOR 내에서 변경할 수 있는 변수입니다.
5. 보통 50명으로 구성된 최종 앙상블을 만듭니다. 전체 앙상블에서 4.4단계의 단계를 수행합니다.
   1. 그림 13과 같이 발견된 각 NOE 상호 작용 유형의 수를 보고합니다.
6. 표준 화학 기하학과 경험적 NMR 파생 제약 조건을 준수하는 구조의 앙상블을 만듭니다.
   1. 총 형태 수, NMR 유도 제약 조건을 위반하는 이러한 수의 수, 전체 앙상블의 RMSD, 두 백본 및 모든 무거운 원자 RMSD 값을 보고합니다.

5. 구조 분석

1. 해결된 앙상블은 NMR 측정 중에 펩타이드가 채택한 구조적 공간을 나타냅니다. 국소 유연성은 분자의 다른 영역에서 변할 수 있으며 이는 구조적 또는 기능적 이유에 기인할 수 있습니다(구조 분석의 목적은 안정성과 작용 메커니즘에 대한 구조적 기초를 결정하는 것입니다).
   1. 구조의 모든 형태를 MolMol 프로그램23으로 가져와 시작 앙상블을 만듭니다(그림 14).
2. 앙상블을 검사하여 분자의 국소 안정성을 결정합니다.
   1. 시퀀스를 따라 후속 4개 잔기 영역을 선택하고 프로그램이 RMSD를 가장 낮은 에너지 구조 또는 평균으로 계산하도록 하여 backbone 및 sidechain RMSD 값을 결정합니다.
   2. 국소 RMSD를 염기서열의 함수로 플로팅하여 분자의 어느 영역이 국소 안정성을 보이는지 확인합니다(그림 15).
   3. 분자의 이 영역을 따라 앙상블을 오버레이하고 추가 분석을 위해 이 앙상블을 사용합니다(그림 16).
3. NMR 유래 제약 조건(위반되지 않음)을 준수하는 저에너지 형태를 선택합니다. 이것들은 "저에너지 앙상블"을 형성할 것입니다.
   1. 앙상블의 형태 수, 형태 선택 기준 및 4.6.1단계에서 정의한 RMSD 값을 보고합니다.
   2. 금속 바인딩 모드가 이미 결정된 경우 다음 단계를 계속합니다. 그렇지 않은 경우: 저에너지 앙상블을 분석하고 금속 이온을 결합할 수 있도록 서로 올바른 근접 위치에 있는 잔류 측쇄를 확인합니다. 이러한 값이 결정되면 3.3단계로 돌아가서 구리 결합 데이터를 포함한 분석을 다시 수행합니다(그림 17은 앙상블, 그림 18은 저에너지 컨포머).
4. 앙상블을 검사하고 MolMol 프로그램의 기본 검색 파라미터를 사용하여 분자 내의 국소 2차 구조를 결정합니다. 2차 구조는 수소 결합에 의해 유지되며 분자의 안정적인 영역을 나타냅니다.
   1. 각 conformer의 2차 구조를 결정합니다(그림 19).
      1. 각 2차 구조를 보여주는 앙상블의 conformers의 백분율에 대한 테이블을 만듭니다.
      2. 2차 구조의 영역이 local-RMSD에 의해 안정적인 영역으로 결정된 영역과 겹치는지 여부를 확인합니다. 이것은 종종 경우입니다.
5. 분자 내의 거리와 수소 결합을 측정합니다.
   1. 앙상블을 Chimera²⁴로 가져옵니다.
   2. Chimera를 사용하여 금속 결합이 의심되는 원자 사이의 분자 내 거리를 측정합니다. 앙상블의 평균 거리를 계산합니다.
   3. Chimera를 사용하여 프로그램의 기본 완화된 수소 결합 매개변수(20%)를 사용하여 앙상블의 각 컨포머에서 분자 내 수소 결합을 측정합니다(그림 20).
   4. 각 수소 결합을 보여주는 앙상블의 컨포머(conformours)의 백분율에 대한 테이블을 만듭니다. 대부분의 형태에서 반복되는 수소 결합은 구조의 안정성을 더하는 안정적인 결합을 나타냅니다.
6. 분자 내의 정전기 상호 작용을 결정합니다.
   1. 충전된 사이드체인 간의 상호 작용을 식별합니다.
   2. 각 정전기 상호 작용을 보여주는 앙상블의 conformers의 백분율에 대한 테이블을 만듭니다.
7. Delphi²⁵ 프로그램 내에서 Amber²⁶ 역장을 사용하여 정전기 전위 분포를 계산합니다.
   1. 앙상블에서 정전기 전위 계산을 수행할 단일 대표 구조를 선택합니다.
   2. Poisson-Boltzman 방정식과 전체 쿨롱 계산을 사용하여 정전기 전위를 도출합니다. 필요한 매개 변수에는 용액의 이온 강도, 용액의 유전 값 (물의 경우 80, DMSO의 경우 40)이 포함됩니다. 내부 펩타이드 (보통 약 5.0); 그리드의 크기(보통 65'65'65 포인트); 펩타이드와 그리드 가장자리 사이의 최소 거리 (10 Å). 결과는 주요 결과가 펩티드 자체에 의해 통제되기 때문에 일반적으로 이러한 값과 관련하여 매우 견고합니다(그림 21).
   3. 펩타이드의 Van der Waals 표면에 매핑된 정전기 전위를 조사합니다(그림 22).
   4. 동일한 전위를 가진 위치를 설명하는 정전기 전위 iso-surfaces를 검사합니다. 다른 단백질이나 리간드를 끌어당기거나 밀어낼 수 있는 확장된 포지티브 또는 네거티브 표면과 같이 생물학적 관련성을 암시하는 iso-surfaces 또는 양친매성 분포 또는 다른 특성의 패치와 같이 중요성을 나타내는 분포를 찾습니다(그림 23).
8. 모든 구조적 발견을 요약하여 그들이 어떻게 서로를 강화하는지 확인하십시오.
9. 해당되는 경우 4.3-5.7.4 단계를 반복합니다.

Results

구리 결합 단백질 모델에 대한 지속적인 연구의 일환으로, 선형 펩타이드 MTCSGCSRPG 내의 보존된 서열 MT/HCXXC의 구조는 용액 상태 NMR에 의해 결정되었습니다. 펩타이드는 불활성 환경에서 CuCl과 반응 시켰고 pH는 범용 스틱에 의해 ~ 3.0으로 측정되었습니다. 펩티드의 아미드 영역은 구리와의 반응에 따라 6.7-8.5에서 6.6-9.0ppm으로 팽창했습니다(그림 2). 약간의 구리 산화로 인한 라인 확장이 기준선에서 분명합니다.

구리 반응 펩타이드 샘플은 시간이 지남에 따라 안정적이었고(그림 7) 스펙트럼은 잘 분리되었으며(그림 8) 분자가 NOESY 스펙트럼에서 거의 0에 가까운 NOE 상호 작용을 제공했기 때문에 ROESY 실험에 의해 획득된 81개의 NOE 상호 작용을 제공했습니다(그림 6의 이론적 설명 참조).

Discussion

결합 메커니즘을 이해하기 위한 구조 정보의 기여는 잘 받아들여지고 있습니다. 펩타이드는 단백질 결합 및 상호 작용의 모델로 유용합니다. 그러나 구조 결정의 주요 방법인 X선 결정학에는 적합하지 않습니다. NMR은 구조가 용액에서 쉽게 해결될 수 있기 때문에 이러한 시스템에 특히 유용합니다. 이는 특히 금속 이온의 산화를 방지하기 위해 불활성 환경에서 구조 결정이 추가로 필요한 메탈로샤페론 모방체의 경우입니다.

보존된 MT/HCXXC 모티프를 포함하는 MTCSGCSRPG 펩타이드는 아포 형태에서 구리와 반응한 펩타이드로 스펙트럼의 유의한 변화에 의해 명백한 바와 같이 Cu(I)에 결합했습니다. NOESY 스펙트럼에서 null 상호 작용이 있는 스펙트럼으로 인해 600MHz 필드에서 ROESY 실험의 필요성은 우리의 경험에 따르면 6-7 잔기의 더 작은 펩타이드가 NOESY 체제의 null 신호에 속하지만 이 크기의 펩타이드는 일반적으로 적절한 신호를 제공합니다. ROESY 스펙트럼...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avance DMX 600 MHz 분광계	Bruker
NMR 샘플 튜브	Wilmad	535-PP
장갑 상자	MBraun	LM05-019
Lyophilizer	VirTis	벤치탑K
펩타이드	BioChemia	맞춤 제작	>95% 순도
구리(1) 염화	물 알드리치	224332
염산	BioLab	231-595-7
수산화나트륨	Gadot	1310-73-2
d6-Dimethylsulfoxide	Aldrich	236926
중수소산화물	Aldrich	151882