Cu(I)를 갖는 메탈로샤페론 모델 펩타이드의 NMR 용액 구조를 결정하고, 시료 준비, 1D 및 2D 데이터 수집에서 3차원 구조에 이르는 상세한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
메탈로샤페론 수송 단백질에 의한 구리(I) 결합은 유해한 산화 환원 반응에 참여할 수 있는 독성 이온의 구리 산화 및 방출을 방지합니다. 서열 MTCSGCSRPG(밑줄이 그어진 것이 보존됨)를 포함하는 Cu(I) 결합 메탈로샤페론 단백질의 펩타이드 모델의 Cu(I) 복합체는 NMR 분광법에 의해 불활성 조건하의 용액에서 측정되었습니다.
NMR은 단백질과 펩타이드의 용액 구조를 결정하기 위해 널리 인정되는 기술입니다. X선 결정학에 적합한 단결정을 제공하기 위한 결정화의 어려움으로 인해 NMR 기술은 특히 고체 상태가 아닌 용액 상태에 대한 정보를 제공하기 때문에 매우 가치가 있습니다. 여기에서는 NMR에 의한 완전한 3차원 구조 결정에 필요한 모든 단계를 설명합니다. 이 프로토콜에는 NMR 튜브의 시료 준비, 1D 및 2D 데이터 수집 및 처리, 피크 할당 및 통합, 분자 역학 계산 및 구조 분석이 포함됩니다. 중요한 것은 사전 설정된 금속-리간드 결합 없이 분석이 먼저 수행되어 편향되지 않은 방식으로 신뢰할 수 있는 구조 결정을 보장한다는 것입니다.
서론
펩타이드는 단백질 모델, 잠재적인 약물 선도 물질 및 치료제로 널리 사용됩니다. 그러나 작은 크기와 높은 수준의 유연성으로 인해 결정화의 어려움으로 인해 X-ray에 의한 구조 결정이 불가능한 경우가 많습니다.
핵자기공명(NMR)은 펩타이드 구조 및 상호 작용을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 국소 및 전체 구조, 결합 및 낮은 친화성 상호 작용에 관한 정보를 제공할 수 있으며 용액 상태에서 수행할 수 있으므로 어려운 샘플에 적용할 수 있습니다.
생물학적 시스템에서 구리 수송은 Cu (I) 이온을 특이적으로 결합하고 일련의 단백질-단백질 상호 작용을 통해 표적 단백질에 전달하는 세포 내 구리 메탈로샤페론 단백질에 의해 이루어져, 이온이 산화되는 것을 방지하고 독성 구리2-5의 방출을 방지합니다. 결합 부위는 보존된 서열 MXH/TCXanyXanyC를 특징으로 하며, 이는 NMR 및 결정학에 의해 Cu(I)를 두 시스테인 잔기의 부드러운 티올라토 리간드에 결합하는 것으로 나타났지만, 추가 외부 리간드도6-8 제안되었습니다. 이러한 단백질의 구조-기능 관계는 집중적인 연구의 주제였습니다9.
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프로토콜
1. 샘플 준비
- Apo-sample: 약 1-2mg의 펩타이드를 450-500μl의 중수소화 NMR 등급 용매에 용해시킵니다(생물학적 샘플에 대한 바람직한 용액은 물에 10% D2O 또는 샘플이 물에 용해되지 않거나 반응하는 경우 d6-DMSO 11-12).
- 구리 반응 샘플: 약 1-2mg의 펩타이드를 450-500μl의 NMR 용매에 등몰량의 금속염으로 용해시킵니다.
- 소결 유리, 여과지 또는 조사 중인 화합물에 적합하고 흡착되지 않는 기타 기술을 사용하여 용액을 여과합니다. 이것은 균질성에 영향을 미치는 금속 입자를 제거하는 데 필수적입니다.
- 용액을 NMR 튜브로 옮기고 닫습니다. 튜브 품질이 사용된 자석 강도에 맞는지 확인하십시오(자세한 내용은 장비 표 참조).
- 샘플이 산소에 민감한 경우 이러한 단계는 불활성 환경에서 수행해야 하며 산화를 방지하기 위해 튜브를 밀봉해야 합니다.
2. NMR 데이터 수집 및 처리13
- apo 및 구리 반응 샘플의 1D 1H 스펙트럼을 기록하고 비교합니다. 구리 함유 펩타이드 스펙트럼은 아미드 영역에서 화학적 변....
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결과
구리 결합 단백질 모델에 관한 지속적인 연구의 일환으로, 선형 펩타이드 MTCSGCSRPG 내의 보존된 서열인 MT/HCXXC의 구조를 용액 상태 NMR로 결정하였습니다. 펩타이드를 불활성 환경에서 CuCl과 반응시켰으며, 범용 측정지로 측정한 pH는 ~3.0이었습니다. 펩타이드의 아미드 영역은 구리와 반응한 후 6.7-8.5 ppm에서 6.6-9.0 ppm으로 확장되었습니다(그림 2). 약간의 구리 산화로 인한 선폭 넓어짐 현상이 기선(baseline)에서 확인됩니다.
구리 반응 펩타이드 샘플은 시간이 지나도 안정적이었으며(그림 7), 스펙트럼은 잘 분해되었고(그림 8), ROESY 실험을 통해 81개의 NOE 상호작용을 얻었습니다. 이는 해당 분자가 NOESY 스펙트럼에서 거의 0에 가까운 NOE 상호작용을 보였기 때문입니다(그림 6의 이론적 설명 참조)........
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토론
결합 메커니즘을 이해하기 위한 구조 정보의 기여는 잘 받아들여지고 있습니다. 펩타이드는 단백질 결합 및 상호 작용의 모델로 유용합니다. 그러나 구조 결정의 주요 방법인 X선 결정학에는 적합하지 않습니다. NMR은 구조가 용액에서 쉽게 해결될 수 있기 때문에 이러한 시스템에 특히 유용합니다. 이는 특히 금속 이온의 산화를 방지하기 위해 불활성 환경에서 구조 결정이 추가로 필요한 메탈로샤페론 모방체의 경우입니다.
보존된 MT/HCXXC 모티프를 포함하는 MTCSGCSRPG 펩타이드는 아포 형태에서 구리와 반응한 펩타이드로 스펙트럼의 유의한 변화에 의해 명백한 바와 같이 Cu(I)에 결합했습니다. NOESY 스펙트럼에서 null 상호 작용이 있는 스펙트럼으로 인해 600MHz 필드에서 ROESY 실험의 필요성은 우리의 경험에 따르면 6-7 잔기의 더 작은 펩타이드가 NOESY 체제의 null 신호에 속하지만 이 크기의 펩타이드는 일반적으로 적절한 신호를 제공합니다. ROESY 스펙트럼.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
재정적 지원을 해주신 휴먼 프론티어 사이언스 프로그램(Human Frontier Science Program, Young investigator grant (RGY)0068-2006)에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Avance DMX 600 MHz 분광계 | Bruker | ||
| NMR 샘플 튜브 | Wilmad | 535-PP | |
| 장갑 상자 | MBraun | LM05-019 | |
| Lyophilizer | VirTis | 벤치탑K | |
| 펩타이드 | BioChemia | 맞춤 제작 | >95% 순도 |
| 구리(1) 염화 | 물 알드리치 | 224332 | |
| 염산 | BioLab | 231-595-7 | |
| 수산화나트륨 | Gadot | 1310-73-2 | |
| d6-Dimethylsulfoxide | Aldrich | 236926 | |
| 중수소산화물 | Aldrich | 151882 |
참고문헌
- Robinson, J. A. Protein epitope mimetics as anti-infectives. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 379-386 (2011).
- Huffman, D. L., Function O'Halloran, T. V. structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annu. Rev. Biochem. 70, 677-701 (2001)....
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재인쇄 및 허가
