방법 논문

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

DOI:

10.3791/50752

⸱

2014년 2월 24일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Greehey Children's Cancer Research Institute, UT Health Science Center at San Antonio, 2Department of Cellular and Structural Biology, UT Health Science Center at San Antonio, 3Department of Pathology, UT Health Science Center at San Antonio, 4Department of Microbiology, UT Health Science Center at San Antonio, 5Cancer Therapy and Research Center, UT Health Science Center at San Antonio

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최근, 그것은 게놈 불안정성 단단히 많은 발달 장애, 암, 노화 관련되어 있다는 것이 명백되고있다. 줄기 세포가 생활 전반에 걸쳐 조직의 항상성 및 수리를 보장하는 책임이 있음을 감안할 때, 그것은 줄기 세포 인구는 조직의 게놈 무결성을 보존하는 중요한 가설하는 것이 합리적이다. 따라서, 상당한 관심이 줄기 세포 기초 질환의 병인을 이해하는 것을 목표로, 게놈 줄기 세포의 무결성 및 그들의 자손에서 내인성 및 환경 적 요인의 영향을 평가 생겨났다.

LACI 형질 전환 마우스는 LACI 유전자가 돌연변이 기자 역할을하는 LACI 기자 시스템을 암호화하는 복구 λ 파지 벡터를 수행합니다. 돌연변이 LACI 유전자의 결과는 클리브 파란색으로 돌려 발색 기질을, β-갈 락토시다 아제의 생산이다. LACI 기자 시스템은 수행의 i줄기 / 전구 세포를 포함하고 쉽게 복구이어서 E. 감염하는 데 사용할 수있는 모든 셀에 N, 대장균. 감염된 E. 배양 한 후 정확한 기판을 포함 아가로 오스에 대장균, 패 득점 수 있으며, 맑은 플라크가 야생형 항구 파란색으로 플라크는 돌연변이 LACI 유전자를 나타냅니다. 플라크 (클리어 중) 블루의 주파수는 DNA가 추출 된 원래 세포 인구의 돌연변이 빈도를 나타냅니다. 돌연변이 LACI 유전자를 시퀀싱 유전자의 돌연변이의 위치와 돌연변이의 종류를 표시합니다.

LACI 유전자 변형 마우스 모델에서 생체 내 돌연변이 분석으로 잘 확립되어있다. 또한, 분석을위한 마우스 및 시약은 시판되고있다. 여기에서 우리는이 모델이 자발적으로 줄기 세포가 풍부한 린의 DNA 돌연변이 발생 빈도를 측정하기 위해 적용 할 수있는 방법을 자세히 설명 - IL7R - 무서-1 + CKIT + + (LSK) 세포 및 조혈 시스템의 다른 부분 모집단.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

대부분의 조직에서 분화 된 세포는 제한된 수명이 있습니다. 기능적 무결성을 유지하기 위해, 수명이 긴, 조직 특이 적 줄기 세포는 지속적으로 차례로 특정 조직의 기능에 필요한 완전히 분화 된 세포에 야기 전구 세포를 생성한다. 줄기 세포는자가 재생 (self-renewal)이라는 과정을 통해 자신의 구획을 보충. 따라서, 줄기 세포들은 따라서 안으로있는 조직의 기능 무결성을 유지할 책임이 있으며, 그것은 그들이이 손상된 DNA를 감지하고 잠재적으로 복구하는 강력한 메커니즘을 갖추고 있습니다 것이 필수적입니다. 그렇지 않은 경우, 그들은 그들의 자손에 의해 상속 할 수있는 여러 게놈 (유해) 섭동을 획득 할 수있다. 줄기 세포는 유기체의 수명 동안 자신의 게놈을 안전 보호하는 방법을 이해하는 것은 중요한 문제이며, 게놈 불안정성은 암 (1,2 검토) 다른 연령과 관련된 질병에 링크 된 이유를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

줄기 세포 또는 초기 전구 세포 집단의 수준에서 조직의 게놈 무결성을 제어하는​​ / 세포의 죽음, 노화 또는 차별화를 통해 세포에 결함이 줄기 (또는 전구)를 제거하고, 하나 또는 효율적인 수리에 의해 달성 될 수있다 손상된 DNA. 최근의 연구는 이러한 희소 인구 3-6에서

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C57BL / 6 배경에 LACI 형질 전환 마우스에서 백혈구가 무서-1 (그림 1) 표현하지 않습니다. 무서-1 세포의 정화에 사용되는 마커 따라서,이 마우스는 무서-1의 발현을 얻을 수있는 적절한 긴장과 교차 할 필요가,이 프로토콜의 정규 C57BL / 6 (B6) 마우스 및 LACI 사이의 십자가의 F1 (C57BL / 6) 형질 전환 마우스 (LACI)는 (도 1)를 사용 하였다. 이 프로토콜에서 사용되는 세포 집단 중에서 LSKs 및 CMP한다은 골수의 작은 집단을 나타낸다. 만 뒷다리 또는 적어도 네 마우스에서 골수를 수확 할 때 최소 2 각 × 10 5 / 종류, 약 10 생쥐에서 골수를 결합 정화하기 위해 경우에도 엉덩이, 앞 다리 -, 척추 뼈, 흉골이 사용됩니다.

골수 및 비장에서 단일 세포 현탁액을 확인합니다. 골수의 작은 비율은 그대로, 대다수는 PUR하는데 사용된다 사용(FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 LSKs 차별화 된 골수 전구 세포, 즉 CMP한다과 과립 / 단핵 전구 세포 (GMP를)를 쓸어. 골수 세포의 분리 및이 인구의 FACS 정화 다른 곳에서

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생체 내 돌연변이 분석은 드문 경우 많은 이벤트들 (돌연변이 PFUs) (모든 PFUs)를 측정한다. 세포의 소수로 분석을 수행하여, 그 결과가 상당히 긍정적 거짓 및 위음성 결과에 좌우되는 것이 가능하다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 3 가지 동물로부터 수확 된 분획 골수 세포와 일련의 희석 실험을 수행 하였다. 우리는, 1.4 × 106, 7.0 × 105을 사용하여 이들 동물의 골수에서 3.5 × 105을 돌연변이 빈도를 측정하고, 1.75 × 105 세포. 결과 (도 7)는 입력 셀 개수와 PFU의 발생의 수 사이의 선형 관계를 나타낸다. 중요한 것은, 돌연변이 주파수는 세포의 높거나 낮은 숫자로 측정 여부, 일치합니다. 직접 (으로 인해 세포의 소수에) 테스트하지 않지만,이 LSKs 및 GMP를위한 이론이 아니라고 믿을 이유가 없습니다.

t ">이 돌연변이 분석에서 가장 중요한 .......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 명세서에 기재된 생체 내 돌연변이 유발 분석은 원래 콜러 등. 18이 모델의 lacI 리포터 유전자를 운반하는 λ 파지 벡터를 이용하여 생성 LACI 트랜스 제닉 마우스 모델에 기초한다. 벡터 전염성 파지 입자로 상대적으로 단순 복구 이후의 포장을 허용 측면에서는 두 COS 사이트, E.를 감염하는 데 사용 대장균. 블루 플라크는 파지에 감염된 E.에 의해 생성됩니다 돌연변이의 lacI 유전자를 포함하는 대장균. 블루 플라크는 따라서 크게 돌연변이 득점의 작업을 단순화, 무색의 배경에 대해 설정됩니다. DNA 시퀀싱 기술은 돌연변이 유발을 기본 메커니즘으로 추가 조사를 도울 수도 발생한 돌연변이의 위치와 형태를 식별하기 위해 사용될 수있다.

본 돌연변이 분석의 프로토콜로 만들어진 변형 한 FACS-정제 hema.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는이 원고에서 그래픽 디자인 및 사진 데이비드 R. 리 게스, MA에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 UTHSCSA 유동 세포 계측법 핵심 시설 UTHSCSA 고급 핵산 핵심 시설에 GCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) 및 암 센터 지원 그랜트 (P30CA054174)에서 자금에 의해 지원되었다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

E. coli

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
LacI 형질전환 마우스 
RecoverEase DNA 분리 키트
170-3635
0.025 mM 기공 크기 멤브레인 Fisher (Millipore)VSWP 025 00
245 mm2 생물학적 분석 접시(트레이) 피셔 (코닝)07-200-600
NZY 육수 (분말)피셔 (Teknova)N1144
한천피셔BP1423-500
아가 로즈피셔E-3120-500
N, N- 디메틸 포름 아미드피셔AC34843-5000
X-galResearch Products Intl Corp (RPI)B71800-10.0
Proteinase KRoche3-115-852
PCR 연장제 Taq Polimerase kit5 PRIME2200500
Agencourt AMPure XP 클린업 키트Beckman/CoulterA63880
RNace-It 리보뉴클레아제 칵테일 Agilent Technologies(Stratagene)720202 Transpack Packaging Extract를 포함한 BioReliance Corporation , 주황색 및 파란색 트랜스팩 튜브 및 SCS-8 Agilent Technologies(Stratagene)200221 DNA 크기 표준 – lambda ladder Bio Rad

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (10), 963-969 (2009).
  2. Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat. Rev. Genet. 9 (3), 204-217 (2008).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

LacIDNALacI

관련 논문