정정: 나이프 엣지 스캐닝 현미경(Knife-edge Scanning Microscopy)을 위한 시료 준비, 이미징 및 분석 프로토콜

요약

Knife-edge Scanning Microscopy를 위한 시료 준비, 이미징 및 분석 프로토콜에 대한 수정이 이루어졌습니다. Nissl 염색 프로토콜에 중요한 변경 사항이 적용되었습니다.

초록

나이프 엣지 스캐닝 현미경을 위한 시료 준비, 이미징 및 분석 프로토콜에 수정 사항이 반영되었습니다. Nissl 염색 프로토콜에 중요한 수정이 이루어졌습니다.

프로토콜

나이프 엣지 스캐닝 현미경의 시료 준비, 이미징 및 분석 프로토콜에 수정 사항이 반영되었습니다. Nissl 염색 프로토콜이 다음과 같이 수정되었습니다:

2. 시료 준비: Nissl 염색

1. 마우스를 케타민과 자일라진을 복강 내 주사하여 깊게 마취시킨 후, 실온의 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 50 mL를 사용하여 경심장 관류를 실시하고, 이어서 실온의 10% 중성 완충 포르말린(pH 7.4) 250 mL, 마지막으로 희석하지 않은 인도 잉크 3.0 cc를 사용하여 관류합니다.
2. 식염수와 고정액을 이용한 전신 관류는 심혈관계에서 혈액을 제거하고 조직을 고정하는 데 필요합니다. 인도 잉크 관류는 심혈관계의 혈관을 완전히 채우기 위해 필요합니다.
3. 추출한 뇌를 농도가 단계적으로 높아지는 에틸 알코올 시리즈(25%{}-100%)로 탈수시킨 후, 위의 1.8-1.9 프로토콜에 따라 araldite 플라스틱에 매립합니다. 매립 매질로 LR white를 사용하는 경우에는 위의 1.10 프로토콜을 따릅니다.
4. 마우스를 케타민과 자일라진을 복강 내 주사하여 깊게 마취시킨 후, 실온의 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 50 mL를 사용하여 경심장 관류를 실시하고, 이어서 실온의 10% 중성 완충 포르말린(pH 7.4) 250 mL, 마지막으로 희석하지 않은 인도 잉크 3.0 cc를 사용하여 관류합니다.
5. 식염수와 고정액을 이용한 전신 관류는 심혈관계에서 혈액을 제거하고 조직을 고정하는 데 필요합니다. 인도 잉크 관류는 심혈관계의 혈관을 완전히 채우기 위해 필요합니다.
6. 추출한 뇌를 농도가 단계적으로 높아지는 에틸 알코올 시리즈(25%{}-100%)로 탈수시킨 후, 위의 1.8-1.9 프로토콜에 따라 araldite 플라스틱에 매립합니다. 매립 매질로 LR white를 사용하는 경우에는 위의 1.10 프로토콜을 따릅니다.
7. 마우스를 케타민과 자일라진을 복강 내 주사하여 깊게 마취시킨 후, 실온의 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 50 mL를 사용하여 경심장 관류를 실시하고, 이어서 실온의 10% 중성 완충 포르말린(pH 7.4) 250 mL, 마지막으로 희석하지 않은 인도 잉크 3.0 cc를 사용하여 관류합니다.
8. 식염수와 고정액을 이용한 전신 관류는 심혈관계에서 혈액을 제거하고 조직을 고정하는 데 필요합니다. 인도 잉크 관류는 심혈관계의 혈관을 완전히 채우기 위해 필요합니다.
9. 추출한 뇌를 농도가 단계적으로 높아지는 에틸 알코올 시리즈(25%{}-100%)로 탈수시킨 후, 위의 1.8-1.9 프로토콜에 따라 araldite 플라스틱에 매립합니다. 매립 매질로 LR white를 사용하는 경우에는 위의 1.10 프로토콜을 따릅니다.

~까지:

2. 시료 준비: 니슬(Nissl) 염색

1. 본 프로토콜은 Mayerich 등의 프로토콜을 밀접하게 따릅니다.⁷
2. 마우스의 복강 내에 케타민(ketamine)과 자일라진(xylazine)을 주입하여 깊게 마취시킨 후, 실온의 인산완충생리식염수(phosphate-buffered saline, pH 7.4) 50 mL로 경심장 관류를 실시하고, 이어서 차가운 4% 인산완충 파라포름알데히드(phosphate-buffered paraformaldehyde, pH 7.4) 250 mL로 관류합니다.
3. 그 다음 마우스에 탈이온수에 희석한 0.1% 티오닌(thionin) 염료 용액 100 mL를 관류하고, 사체를 냉장고(4 °C)에 24시간 동안 보관합니다.
4. 24시간 후, 두개골에서 뇌를 적출하여 신선한 0.1% 티오닌 용액에 넣고 4 °C에서 7일 동안 둡니다. 이 과정의 기간을 길게 잡은 것은 티오닌이 적출된 뇌 조직 전체에 충분히 침투하도록 하기 위함입니다.
5. 그 후 뇌의 염색을 제거하고, 50% 에탄올과 물 혼합액부터 시작하여 6주에 걸쳐 100% 에탄올까지 단계별 에탄올 시리즈를 통해 탈수시킵니다. 50%에서 70% 사이의 에탄올 교체 단계에서는 냉장고(4 °C)에 보관하며, 70% 이상의 모든 에탄올 교체 단계에서는 실온에 보관합니다.
6. 아세톤을 세 번 교체한 후(각 용액에서 실온으로 2-4일), 위의 1.8-1.9 프로토콜에 따라 뇌를 araldite 플라스틱에 매립합니다. 매립제로 LR white를 사용하는 경우에는 위의 1.10 프로토콜을 따릅니다.