다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.
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방법 논문
분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
TH17 세포는 17 (IL-17) 인터루킨 생산하는 것으로 확인 된 T 세포의 서브 세트 별개이며, TH1, TH2, 규제 T 세포를 포함한 다른 T 세포의 서브 세트에서 기능이 다르다. TH17 세포는 많은자가 면역 질환과 관련된 지나치게 염증 면역 반응의 중심 원인으로 등장했습니다. 이 방법에서 우리는 C57BL / 6 마우스의 비장과 림프절에서 T 림프구를 정화하고, 제어 및 TH17 유도하는 환경에서 정제 된 CD4 + T 세포를 자극한다. TH17 유발 환경은 항 CD3 및 항 CD28 항체, IL-6와 TGF-β의 존재에 자극을 포함한다. 최소 72 시간 동안 배양 한 후 37 ° C에서 최대 5 일 동안 세포는 이후 세포 계측법, qPCR에, 및 ELISA를 흐름을 통해 IL-17을 생산하는 기능을 분석하고 있습니다. TH17 분화 된 CD4 + CD25-T 세포는 또한 TH17 세포가자가 면역 및 호스트 드의 발병 및 진행에서 재생하는 역할을 규명하기 위해 이용 될 수있다범법. 또한, 별개의 쥐 녹아웃 / 질병 모델에서 CD4 + CD25-림프구의 TH17 분화는 세포의 운명의 가소성에 대한 우리의 이해에 기여할 수있다.
서론
CD4 + T 림프구 (T 세포) 전염성 미생물에 대한 면역 체계가 중재 방어에 중요한 역할을한다. 역으로, T 세포들은 속속들이 예컨대 제 1 형 당뇨병, 전신성 홍 반성 루푸스, 류마티스 관절염과 같은자가 면역 질환의 발병 및 진행과 연관된다. CD4 + T 림프구는 T 세포 수용체 동족 항원 / 주요 조직 적합성 복합체 II (MHCII) 분자 (TCR)의 상호 작용의 결합을 통해 활성화되고, B7.1/B7.2와 CD28 수용체의 상호 작용은 15 리간드. TCR 자극 및 CD28 동시 자극의 제공뿐만 아니라, 항원 제시 세포는 또한 이에 관련 항원에 T 림프구의 응답을 연출, T 림프구의 분화 상태를 결정 사이토킨 환경을 제공한다. 고유 병원체 / 항원 제시 세포 상호 작용은 T는 엘리에 초점을 맞춘 독특한 경로를 림프구 왜곡 별개의 사이토 카인 환경을 만들고,시작 병원체의 mination. 불행하게도, 원래 병원균을 침해 근절하기 위해 디자인 된 T 림프구의 음향 경로는 잘못 자기 조직 (15)에 대항 할 수 있습니다. 따라서, 각 별개의 CD4 + T 세포의 부분 집합의 분화 상태를 더 잘 이해 병원균의 제거 및 자기 내성 사이의 균형을 조절하는 방법에 대한 우리의 이해에 중요합니다.
TH....
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프로토콜
모든 동물의 사용은 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 검토를 실시하였습니다.
1. 믹스 미디어의 준비
- 멸균 PBS 산도 : 7.3 (1 L)
0.23 g의의 NaH 2 PO 4
1.15 g 나 2 HPO 4
9.0 g의 NaCl
DI 물과 볼륨을 차지합니다. 오토 클레이브로 멸균. - 세포 배양 배지 (100 ㎖)
89 ML의 RPMI
10 ㎖의 10 % FBS
1 ㎖ 항생제 항진균 (ABAM) 100 μg하는 50 mM 2 - 머 캅토 에탄올 (96.5 μg PBS에 3.5 μg 주식 2 - 머 캅토 에탄올) - 멸균 PBS에 FACS 버퍼 (형광 활성화 셀 정렬) (유동 세포 계측법 동안 사용되는) 2 % FBS
- iTh17 믹스 (샘플 수에 따라 모든 믹스 및 미디어에 필요한 양을 결정)
1.5 ㎍ / ㎖의 항-CD....
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결과
이 TH17 분화 프로토콜은 비장의 제거와 겨드랑이, 상완, 장간막, 자궁 경부, 서혜부 림프절로 시작합니다. 각각의 위치의 표현은,도 2 및 3에서 찾을 수있다. 그림 1과 5는 모두이 프로토콜에 설명 된 방법의 시각적 표현을 제공합니다.
이 TH17 프로토콜은 CD4 + CD25-T 림프구 인구에서 차별화에 초점을 맞추고 있습니다. 그것은 autoMACS 프로 세포 분리가 풀링 된 총 림프절, 비장 (그림 4)에서 우리의 원하는 CD4 + CD25-인구를 풍요롭게하는 방법을 효율적으로하는 것이 중요하다. 미분 획, 풀링 림프절과 비장 세포 및 autoMACS 분리 분획을 유세포 분석 (그림 4) 다음 antiCD4 및 antiCD25 항체로 염색 하였다. 그림 4a는 CD4 + CD25 +의 .......
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토론
여기에서 우리는 체외 TH17 차별화를 달성하기 위해 프로토콜을 설명했다. T의 분화가 인간의 병원균 (13)의 효과적인 제거를위한 중요 TH17 하위 집합으로 림프구로 TH17 분화 연구는 중요하다. 반대로, IL17의 생산은자가 면역 질환의 진행 (13)와 연결되어 있습니다. 이 면역 조절 및자가 면역의 수많은 별개의 뮤린 모델에 적용 할 수 TH17 분화의 방법은 많은 연구의 설정에 적용 가능하다. 이 방법은 면역 반응을 조절하는 IL-17A의 생산 및 전사 인자 RORγT의 표현으로이 프로토콜에 표시 TH17 세포로 분화하는 T 림프구의 기능,,,에 대한 질문에 대답하는 데 도움이됩니다. 또한, TH17 세포도 IL17F, Il22 및 GM-CSF 08 (12)의 생산에 의해 식별 될 수있는 다른 사람에 의해 밝혀졌다. 이 프로토콜은 서로에 대한 중요더 나은 T 림프구의 이펙터 기능이 면역 시스템 운영에 관한 방법을 이해하기 위해 이러한 프로토콜.......
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공개 사항
선언 할 수 없음 공개.
감사의 글
이 작품은 플로리다 TL1 TR000066 및 UL1 TR000064, 건강의 국립 연구소, BD Biosciences는 시약 부여에서 부모 그랜트 R01AI056152에서 다양성 보충 대학에 NIH / NCATS 임상과 번역 상 과학 포상 및 대학에 의해 부분적으로 지원됩니다 플로리다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약/재료 | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| 프리미엄 현미경 슬라이드, | Frosted Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1"1 mm |
| 5 ml 21G1 라텍스 프리 주사기 및 바늘 | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15ml 원심분리기 튜브 | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 나일론 40 | 마이애미 양식 | 나일론 40/26 | |
| Microtest 조직 배양 플레이트 96 웰 U 바닥 | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24웰 세포 배양 플레이트 | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 정제 NA/LE 햄스터 안티 마우스 CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| 정제 NA/LE 햄스터 안티 마우스 CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| 마우스 IL-6 재조합 단백질 | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R& D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan 블루 솔루션 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| 세포 내 사이토카인 염색 스타터 키트-마우스 | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ 조절 T 세포 분리 키트, 마우스 | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt– 탄올 | MP 생물의학 | 194834 | 유해 |
| 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) | |||
| 아이오노마이신 칼슘염 | 시그마-알드리치 | 13909-1ML | 유해 |
| 브레펠딘 A(BFA) | MP 생의학 | 159027 | |
| ELISA IL-17A 캡처 mAb | BD 생명과학 | 555068 | |
| ELISA IL-17A 검출 mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A 표준 | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA 키트 | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB 기질 시약 세트 | BD Biosciences | 555214 | |
| 장비 | |||
| autoMACS Pro 세포 분리기 | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ 원심분리기 | ThermoScientific | ||
| Napco 시리즈 8000 WJ CO2 인큐베이터 | ThermoScientific | ||
| PTC-200 펠티에 열 순환기 | Biorad |
참고문헌
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleuk....
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재인쇄 및 허가
