성체 해마 신경 발생 동안, 정지된 신경 줄기 세포가 순차적으로 진행하고 회로에서 기능적으로 통합된 뉴런으로 발달할 때 뚜렷한 유전적 마커 세트가 발현됩니다. 열 유도 항원 회수를 사용하면 다른 방법으로는 검출하기 어려운 전구 세포 유형을 향상된 효과로 식별할 수 있습니다.
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방법 논문
열 유도 항원 검색: 성체 해마 신경 발생 중 전구 세포 유형을 감지하고 식별하는 효과적인 방법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
조직 고정 후 기존의 면역조직화학(IHC) 방법을 사용하면 다양한 세포 유형을 시각화할 수 있습니다. 이들은 일반적으로 항원에 결합하고 고유한 생물학 및 발달의 기능인 특성을 가진 세포를 식별하기 위해 항체를 적용하면서 진행됩니다. 성체 해마 신경 발생은 정지된 신경 줄기 세포가 활성화되고 증식, 분화, 성숙 및 기능 통합 단계를 거쳐 진행될 수 있는 순차적인 과정입니다. 각 단계는 유전자의 특징적인 형태와 상향 조절로 구별됩니다. 이러한 단계를 식별하는 것은 쇠약해지는 장애의 병태생리학의 기초가 되는 이 과정의 변화와 작용하는 조절 메커니즘의 변화를 이해하는 데 중요합니다. 당사의 열 유도 항원 회수 접근법은 감지된 신호의 강도를 개선하고 전구 세포 유형을 정확하게 식별할 수 있도록 합니다. 이 논문에서 논의한 바와 같이, 특히 특정 전구 세포 유형을 검출할 때 발생하는 현재의 문제를 우회할 수 있습니다.
서론
신경 줄기 세포에서 새로운 뉴런을 생성하는 신경 발생은 이제 뇌의 두 가지 특수 영역에서 성인이 될 때까지 지속적으로 발생하는 것으로 알려져 있습니다. 여기에는 후각구의 뇌실하부(subventricular zone, SVZ)와 해마(hippocampus)의 치상회(dentate gyrus)의 입하영역(subgranular zone, SGZ)이 포함됩니다. 지난 10년 동안 성체 해마 신경 발생 분야는 상당한 성과를 거두었습니다. SGZ의 신생아 뉴런이 특정 뇌 기능을 유지할 수 있는 향상된 신경 가소성에 기여하기 때문에 이 영역은 많은 관심을 끌었습니다1-5. 성체 해마 신경 발생은 기분 조절, 재생, 학습 및 기억에 중요한 역할을 하는 것과 관련이 있습니다. 따라서 이 풍부한 신경인성 틈새 시장에서 뉴런의 발달과 조절을 이해하기 위한 공동의 노력이 있었습니다.
성체 해마 신경 발생을 연구하는 데 있어 피할 수 없고 중요한 측면은 활성화된 신경 줄기 세포가 완전한 기능을 하는 뉴런이 되기 위해 거치는 별도의 단계를 식별하는 것입니다. 이 과정에서 정지된 신경 줄기 세포가 활성화되고 일련의 초기 활성 및 후기 활성 전구 세포 유형을 통해 진행됩니다(그림 1). 이러한 뚜렷한 신경 전구 세포 집....
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프로토콜
1. 면역조직화학: 관류 및 조직학
- 마우스에 적합한 일반적인 심간 프로토콜에 따라 마우스를 관류하고 뇌를 4% 파라포름알데히드(PFA)9로 추출합니다.
- 뇌를 PFA에 4°C에서 하룻밤 동안 둡니다(예: PFA로 채워진 10ml 원추형 튜브). PFA에서 최소 12-24시간 동안 보관하고 전체 고정을 위해 36시간 이상 보관하지 마십시오. 하룻밤 동안 고정한 후 원뿔형 튜브에서 PFA를 비우고 뇌는 내부에 남겨둡니다. 튜브에 30% 자당을 붓고 뇌를 5초 동안 세척하여 잔류 PFA를 제거합니다. 마지막으로 뇌가 들어 있는 튜브에 30% 자당을 다시 채웁니다. 뇌가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 뇌를 4°C의 자당에 유지합니다.
- 마이크로톰에서 40μm의 뇌 절편을 자릅니다. 마우스 뇌 지도(brain atlas)를 참조하여 치상회(dentate gyrus)의 시작부터 끝까지 절편을 수집하기 시작합니다. 면역조직화학이 준비될 때까지 부동액(간단한 제조법은 500ml, 0.1M PBS 및 300ml 에틸렌 글리콜에 300g의 자당)에서 절편을 보존합니다.
- 조직에 강하게 부착되도록 특별히 설계된 현미경 슬라이드에 절단된 조직을 장착합니다. 이 슬라이드는 끓는 단계에서 조직을 강력하게 붙입니다....
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결과
성인 해마 신경발생은 순차적인 과정이며, 각 단계의 대표적인 전구세포 유형은 마커의 조합으로 식별할 수 있습니다. 세심한 화학적 고정과 항원 회복 과정은 평소 검출하기 어려운 마커들의 효율성과 접근성을 향상시킵니다. 이러한 마커 중 하나인 nestin은 방사형 글리아 유사 신경줄기세포 및 일부 초기 활성 전구세포 유형에서 발현됩니다. 줄기세포나 전구세포가 이후 성숙한 뉴런으로 분화하면 nestin의 발현이 사라지므로, nestin은 초기 전구세포 유형을 식별하는 핵심 단백질이 될 수 있습니다.
SGZ에서 발생하는 성인 해마 신경발생의 순차적 과정에 대한 모식도가 그림 1A에 제시되어 있습니다. 이 과정은 유사분열 단계와 분열 후 단계로 나뉩니다. 식별이 가능한 유전자 마커들이 발현 스펙트럼에 따라 표시되어 있습니다. 방사형 글리아 유사 신경줄기세포는 방사형 돌기를 구성하는 중간 필라멘트 단백질인 GFAP와 nestin의 발현을 통해 식별할 수 있습니.......
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토론
전구 세포 유형의 성공적인 항원 회수 및 염색을 위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 최적의 관상 두께의 잘 관류되고 고정된 조직을 활용합니다. 2) 항원 검색 중 끓여서 및 후속 냉각을 위한 충분한 시간을 허용하는 단계; 3) 고정된 관상 부분을 장착하고 그렇게 할 때 손상을 방지하는 손재주.
IHC에서는 충분한 고정을 거쳤지만 과잉 고정은 아닌 관류 조직을 사용하는 것이 중요합니다. 주요 어려움은 항체에 대한 항원의 접근이 불가능하다는 것입니다. 우리의 방법은 접근성을 향상시키기 위해 고안되었습니다. 수술 중 동물을 올바르게 관류하고 후속 고정을 하는 것이 첫 번째 단계로 필수적입니다. 우리의 프로토콜에서는 뇌를 추출하기 전에 4% PFA가 최소 5분 동안 동물을 통해 관류되도록 합니다. 그 후, 우리는 추출된 뇌를 4% PFA에 밤새 최소 12시간에서 최대 24-36시간 동안 방치하는 것이 중요하다고 생각합니다. 이것은 PFA에서 최적의 기간이며 더 긴 기간은 더.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 방법론은 원래 존스 홉킨스 의과대학 신경과 세포공학연구소의 송홍준 박사 연구실에서 개발되었습니다. 본 연구는 NIMH (R00MH090115), NARSAD, Fraternal Order of Eagles' Mayo Cancer Research Fund, 그리고 M.H.J.에 수여된 Mayo 재단의 스타트업 패키지와 한국연구재단(NRF)의 기초과학연구 프로그램, 교육과학기술부 자금 지원, A3014385 지원, W.R.K. 등에 수여되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| SuperFrost Plus Slide | Fisherbrand | 12-550-15 | 끓는 동안 해마 조직에 강한 접착력을 제공합니다 |
| PVA/DABCO 마운팅 미디어 | Sigma Aldrich | 10981-100 ml | |
| Nestin (닭) | Aves Lab | NES | 신경 줄기 세포 마커 |
| GFAP (토끼) | Dako North America | Z033401-2 | 성상세포 및 신경 줄기 세포 마커 |
| MCM2 (마우스) | BD Transduction Laboratory | 610701 | Proliferation marker |
| DCX (goat) | Santa Cruz Biotechnology | SC8066 | Immature neuron marker |
| Tbr2 (rabbit) | Abcam | Ab23345 | Amplifying progenitor marker |
| NeuN (mouse) | Millipore | MAB377 | Mature neuron marker |
| Cy2 (anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch | 111-226-047 | |
| Cy2 (안티-닭) | Jackson Immunoresearch | 303-165-006 | |
| Cy5 (안티-마우스) | Jackson Immunoresearch | 315-175-047 | |
| Cy5 (안티-염소) | Jackson Immunoresearch | 305-165-047 | |
| DAPI | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Dako Pen | S2002 | Dako | 발수 펜 |
참고문헌
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).
- Santarelli, L., Saxe, M., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants....
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재인쇄 및 허가
