방법 논문

열 유도 항원 검색: 성체 해마 신경 발생 중 전구 세포 유형을 감지하고 식별하는 효과적인 방법

DOI:

10.3791/50769

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2013년 8월 30일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurologic Surgery, Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Anatomy, Korea University College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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성체 해마 신경 발생 동안, 정지된 신경 줄기 세포가 순차적으로 진행하고 회로에서 기능적으로 통합된 뉴런으로 발달할 때 뚜렷한 유전적 마커 세트가 발현됩니다. 열 유도 항원 회수를 사용하면 다른 방법으로는 검출하기 어려운 전구 세포 유형을 향상된 효과로 식별할 수 있습니다.

초록

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조직 고정 후 기존의 면역조직화학(IHC) 방법을 사용하면 다양한 세포 유형을 시각화할 수 있습니다. 이들은 일반적으로 항원에 결합하고 고유한 생물학 및 발달의 기능인 특성을 가진 세포를 식별하기 위해 항체를 적용하면서 진행됩니다. 성체 해마 신경 발생은 정지된 신경 줄기 세포가 활성화되고 증식, 분화, 성숙 및 기능 통합 단계를 거쳐 진행될 수 있는 순차적인 과정입니다. 각 단계는 유전자의 특징적인 형태와 상향 조절로 구별됩니다. 이러한 단계를 식별하는 것은 쇠약해지는 장애의 병태생리학의 기초가 되는 이 과정의 변화와 작용하는 조절 메커니즘의 변화를 이해하는 데 중요합니다. 당사의 열 유도 항원 회수 접근법은 감지된 신호의 강도를 개선하고 전구 세포 유형을 정확하게 식별할 수 있도록 합니다. 이 논문에서 논의한 바와 같이, 특히 특정 전구 세포 유형을 검출할 때 발생하는 현재의 문제를 우회할 수 있습니다.

서론

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신경 줄기 세포에서 새로운 뉴런을 생성하는 신경 발생은 이제 뇌의 두 가지 특수 영역에서 성인이 될 때까지 지속적으로 발생하는 것으로 알려져 있습니다. 여기에는 후각구의 뇌실하부(subventricular zone, SVZ)와 해마(hippocampus)의 치상회(dentate gyrus)의 입하영역(subgranular zone, SGZ)이 포함됩니다. 지난 10년 동안 성체 해마 신경 발생 분야는 상당한 성과를 거두었습니다. SGZ의 신생아 뉴런이 특정 뇌 기능을 유지할 수 있는 향상된 신경 가소성에 기여하기 때문에 이 영역은 많은 관심을 끌었습니다1-5. 성체 해마 신경 발생은 기분 조절, 재생, 학습 및 기억에 중요한 역할을 하는 것과 관련이 있습니다. 따라서 이 풍부한 신경인성 틈새 시장에서 뉴런의 발달과 조절을 이해하기 위한 공동의 노력이 있었습니다.

성체 해마 신경 발생을 연구하는 데 있어 피할 수 없고 중요한 측면은 활성화된 신경 줄기 세포가 완전한 기능을 하는 뉴런이 되기 위해 거치는 별도의 단계를 식별하는 것입니다. 이 과정에서 정지된 신경 줄기 세포가 활성화되고 일련의 초기 활성 및 후기 활성 전구 세포 유형을 통해 진행됩니다(그림 1). 이러한 뚜렷한 신경 전구 세포 집단은 형태학과 MCM2, nestin, Tbr2 및 Doublecortin(DCX) 및 NeuN과 같은 분자 마커의 발현으로 식별될 수 있으며, 이는 RGL을 각각의 전구 세포 유형으로 전환하도록 안내합니다. Nespin은 방사상 신경교세포와 같은 세포와 일부 초기 전구 세포 유형에 걸쳐 발현되는 중간 필라멘트 단백질입니다. 또 다른 마커는 증폭 전구 세포에서 특이적으로 발현되는 Tbr2입니다. Tbr2 전이유전자 발현은 초기에 Type-1 세포(radial-glia like)에서 꺼졌다가 Type-2a, Type-2ab 및 Type-2b 전구세포에서 활성화되었으며 더 분화된 Type-3 및 미성숙 뉴런 사이에서 꺼졌습니다(그림 1). DCX는 Type-2ab, Type-2b 및 Type-3 신경 전구 세포에서 발현되는 신경 세포 이동 마커입니다. 이 세 가지 마커의 조합을 사용하여 신경 전구체의 뚜렷한 하위 유형에 레이블을 지정할 수 있습니다. 여기에는 Type-1(MCM2+nestin+Tbr2-), Type-2a(MCM2+nestin+Tbr2+), Type-2ab(부분 MCM2+nestin-Tbr2+ 및 부분 MCM2+Tbr2+DCX-), Type-2b(MCM2+Tbr2+DCX+) 및 Type-3(MCM2+Tbr2-DCX+)이 포함됩니다. 미성숙 뉴런과 기능적으로 통합된 뉴런과 같은 유사분열 후 세포는 DCX와 성숙한 뉴런 마커인 NeuN을 활용하여 식별할 수 있습니다.

전통적인 IHC 방법은 항체를 사용하여 유전자 발현을 기반으로 특정 세포 유형에 대한 항원을 식별합니다. 컨포칼 현미경과 같은 고해상도 이미징 기술을 통한 후속 시각화를 식별에 활용할 수 있습니다. 그러나 현재 이러한 방법에는 방사상 신경교세포와 같은 세포와 초기 전구 세포 유형을 효율적으로 식별할 수 없는 문제가 있습니다. 이러한 특정 세포 유형을 식별하기 어려운 이유는 적용된 항체가 nestin 단백질을 침투하여 효율적으로 결합할 수 없기 때문입니다. Nespin은 방사형 신경교세포(radial glia-like cell)에 의해 생성되는 방사형 돌기를 구성하는 중간 필라멘트 단백질입니다. 항원에 대한 항체의 비효율적인 결합은 고정 시간, 온도 및 사용된 기술을 포함한 많은 요인의 결과일 수 있습니다6-7. 이러한 문제를 해결하기 위해 당사는 항원 회수 또는 "끓는" 방법을 개발했습니다. nestin 외에도 이 항원 검색 방법은 Ki67, BrdU, 신경교섬유산단백질(GFAP), Tbr2 및 MCM2와 같은 다른 마커의 염색을 개선합니다. 우리의 방법은 화학적 및 물리적 접근 방식을 결합합니다. 그것은 파라포름알데히드에 조직을 화학적으로 고정하고 변성제 및 카오트로픽 처리의 완충액에서 얇은 관상 해마 절편을 고온에서 끓이는 것을 포함합니다. 이는 항체에 대한 항원의 접근성을 향상시키고, 항체 특이성을 개선하며, 전구 세포 유형의 식별을 개선할 수 있습니다. 당사의 접근 방식은 사용이 간편하여 실험실에서 이미 사용 가능한 도구와 시약이 필요합니다. 우리는 신경 줄기 세포의 발달과 내재적 유전적 또는 외적 환경 요인을 통한 조절을 연구하기 위해 이를 광범위하게 활용했습니다8.

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프로토콜

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1. 면역조직화학: 관류 및 조직학

  1. 마우스에 적합한 일반적인 심간 프로토콜에 따라 마우스를 관류하고 뇌를 4% 파라포름알데히드(PFA)9로 추출합니다.
  2. 뇌를 PFA에 4°C에서 하룻밤 동안 둡니다(예: PFA로 채워진 10ml 원추형 튜브). PFA에서 최소 12-24시간 동안 보관하고 전체 고정을 위해 36시간 이상 보관하지 마십시오. 하룻밤 동안 고정한 후 원뿔형 튜브에서 PFA를 비우고 뇌는 내부에 남겨둡니다. 튜브에 30% 자당을 붓고 뇌를 5초 동안 세척하여 잔류 PFA를 제거합니다. 마지막으로 뇌가 들어 있는 튜브에 30% 자당을 다시 채웁니다. 뇌가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 뇌를 4°C의 자당에 유지합니다.
  3. 마이크로톰에서 40μm의 뇌 절편을 자릅니다. 마우스 뇌 지도(brain atlas)를 참조하여 치상회(dentate gyrus)의 시작부터 끝까지 절편을 수집하기 시작합니다. 면역조직화학이 준비될 때까지 부동액(간단한 제조법은 500ml, 0.1M PBS 및 300ml 에틸렌 글리콜에 300g의 자당)에서 절편을 보존합니다.
  4. 조직에 강하게 부착되도록 특별히 설계된 현미경 슬라이드에 절단된 조직을 장착합니다. 이 슬라이드는 끓는 단계에서 조직을 강력하게 붙입니다. 티슈를 장착한 후 슬라이드를 10분 동안 또는 완전히 마를 때까지 건조시키십시오. 슬라이드가 종이 타월에 슬라이드의 하단 가장자리가 있는 수직 표면에 놓여 있으면 건조를 촉진할 수 있습니다. 둘 이상의 슬라이드를 장착하는 경우 다음 단계를 진행할 준비가 될 때까지 해당 시간(1-2시간 이상) 동안 다른 슬라이드를 건조한 상태로 둘 수 있습니다.
  5. 슬라이드가 건조되면 PBS로 각각 5분 동안 세 번 세척하고 다시 건조합니다(PBS 버퍼 = 0.137 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.0119 M Na2PO4). 이렇게 하면 이전의 모든 화학 물질(예: 부동액 저장 용액의 글리세롤)이 충분히 제거되고 슬라이드에 대한 조직의 접착력을 손상시키지 않습니다.

2. 시약 및 보조 장비 준비

  1. 조직 절편을 끓일 용액 A(0.1M 또는 19.21g/L 구연산)와 용액 B(0.1M 또는 24.9g/L 트리스-구연산나트륨)를 준비합니다.
  2. 눈금이 매겨진 실린더에서 9ml의 용액 A와 41ml의 용액 B를 결합합니다.이 혼합물에 450ml의 ddH2O를 추가합니다.
  3. 이 혼합물을 전자레인지에 사용할 수 있는 빈 용기(예: 빈 피펫 팁 상자)에 붓습니다.

3. 열 유도 항원 회수

  1. 2단계에서 만든 용액을 표준 설정으로 표준 전자레인지에서 5분 동안 끓입니다. 용액은 100 °C 이상에서 끓기 시작합니다.
  2. 끓는 것이 완료되면 전자레인지에서 용기를 조심스럽게 제거하고 건조된 슬라이드를 그 안에 넣고 해마 부분이 있는 슬라이드 면이 아래를 향하고 액체에 완전히 노출되도록 합니다. 가능하면 슬라이드를 상자 벽에 비스듬히 놓고 그 주위에 다른 슬라이드를 쌓습니다. 상자 내부의 "핏"이 단단히 조여져 슬라이드가 서로 위로 움직일 공간이 없도록 합니다.
  3. 이 혼합물을 전자레인지의 표준 설정에서 7분 동안 슬라이드와 함께 끓입니다. 이 시간 동안 용액은 100°C 이상에서 끓습니다.
  4. 이 끓는 단계에서 두 개의 얼음 양동이에 얼음을 반쯤 채웁니다.
  5. 3.3단계에서 끓는 것이 완료되면 전자레인지에서 용기를 꺼내 얼음 양동이 중 하나에 넣습니다. 다른 양동이의 나머지 얼음을 용기 전체에 붓고 완전히 덮습니다. 1시간 동안 그대로 두십시오.

4. 1차 및 2차 항체 염색

  1. 1시간의 대기 시간이 끝나면 용기에서 슬라이드를 제거하고 TBS-T 버퍼로 각각 5분 동안 3회 세척합니다. 이러한 기본 세척을 수행하기 위해 모든 장치를 사용할 수 있습니다. (완충액 TBS = 50mM Tris HCl, 150mM NaCl, TBS-T = 0.05% Triton X-100 TBS 완충액, TBS-TT = 4% 당나귀 혈청 TBS-T 완충액).
  2. 세탁 후 어두운 곳(예: 벤치 서랍 내부, 서랍 내부에 종이 타월을 놓고 슬라이드를 기울임)에서 5-10분 동안 또는 슬라이드가 완전히 마를 때까지 슬라이드를 말리십시오. 이 기간 동안 하룻밤 동안 1차 항체 염색을 위한 챔버를 준비합니다. 단순 염색 챔버는ddH2O로 채워진 넓은 표면적을 갖는 용기와 용기 내부의 스테이지를 포함할 수 있으며, 그 위에 슬라이드가ddH2O위에 놓일 수 있습니다.
  3. 슬라이드가 마르면 발수 펜을 사용하여 조직 섹션 주위에 윤곽을 그립니다. 4.5단계에서 이 개요는 항체 혼합물이 흘러내리는 것을 방지하는 장벽 역할을 합니다.
  4. TBS-TT에서 1차 항체 혼합물을 준비합니다. 예를 들어, 항체 스톡이 1:500 농도인 경우 TBS-TT 500μl에 특정 항체 1μl를 추가합니다. 시약 표에 언급된 대로 1차 항체를 활용합니다.
  5. 건조된 슬라이드를 염색 챔버의 스테이지 위에 놓습니다. 1차 항체 500μl를 천천히 추가하고 전체 표면을 덮습니다. 전체 장치를 덮고 알루미늄 호일로 싸서 외부 빛을 차단합니다. 실온에서 하룻밤 동안 그대로 두십시오.
  6. 다음날 TBS-T 버퍼로 슬라이드를 5분씩 3회 세척합니다. 4.2단계에서 설명한 대로 어두운 곳에서 건조시킵니다.
  7. 단계 4.4와 유사하게 2차 항체 혼합물을 준비합니다. 2차 항체에 대해서는 시약 표를 참조하십시오.
  8. 4.2단계 및 4.5단계에 설명된 대로 건조된 슬라이드를 염색 챔버에 놓습니다. 2차 항체 500μl를 천천히 추가하고 전체 표면을 덮습니다. 염색 챔버를 알루미늄 호일로 싸서 외부 광선으로부터 보호합니다. 실온에서 최소 2시간 동안 덮개를 덮고 외부 조명으로부터 보호하여 두십시오.
  9. 2차 염색이 완료된 후 TBS-T 버퍼로 슬라이드를 각각 5분씩 3회 세척합니다. 어두운 곳에서 슬라이드를 말리십시오. 건조 후 마운팅 용액을 넣고 기포가 유입되지 않도록 조심스럽게 커버 슬립으로 슬라이드를 덮습니다. 후속 분석 전에 슬라이드를 최소 2시간 동안 어두운 곳에 두십시오.
  10. 염색된 조직에 대해 타임 랩스 또는 컨포칼 분석을 수행합니다.

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결과

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성체 해마 신경발생은 일련의 순차적인 과정이며, 각 단계의 대표적인 전구세포 유형은 마커들의 조합을 통해 식별할 수 있습니다. 세심한 화학적 고정과 항원 회복 과정은 평소 검출하기 어려운 마커들의 효능과 접근성을 향상시킵니다. 이러한 마커 중 하나인 nestin은 방사형 글리아 유사 신경줄기세포와 일부 초기 활성 전구세포 유형에서 발현됩니다. 줄기세포나 전구세포가 이후 성숙한 뉴런으로 분화되면 nestin의 발현이 사라지기 때문에, nestin은 초기 전구세포 유형을 식별하는 핵심 단백질이 될 수 있습니다.

SGZ에서 일어나는 성체 해마 신경발생의 순차적 과정에 대한 도식도는 그림 1A에 나와 있다. 이는 유사분열 단계와 유사분열 후 단계로 나뉜다. 식별이 가능하게 하는 유전적 마커들이 그 발현 범위에 따라 표시되어 있다. 방사형 글리아 유사 신경줄기세포는 방사형 돌기를 구성하는 중간 필라멘트 단백질인 GFAP 및 nestin의 발현을 통해 식별될 ...

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토론

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전구 세포 유형의 성공적인 항원 회수 및 염색을 위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 최적의 관상 두께의 잘 관류되고 고정된 조직을 활용합니다. 2) 항원 검색 중 끓여서 및 후속 냉각을 위한 충분한 시간을 허용하는 단계; 3) 고정된 관상 부분을 장착하고 그렇게 할 때 손상을 방지하는 손재주.

IHC에서는 충분한 고정을 거쳤지만 과잉 고정은 아닌 관류 조직을 사용하는 것이 중요합니다. 주요 어려움은 항체에 대한 항원의 접근이 불가능하다는 것입니다. 우리의 방법은 접근성을 향상시키기 위해 고안되었습니다. 수술 중 동물을 올바르게 관류하고 후속 고정을 하는 것이 첫 번째 단계로 필수적입니다. 우리의 프로토콜에서는 뇌를 추출하기 전에 4% PFA가 최소 5분 동안 동물을 통해 관류되도록 합니다. 그 후, 우리는 추출된 뇌를 4% PFA에 밤새 최소 12시간에서 최대 24-36시간 동안 방치하는 것이 중요하다고 생각합니다. 이것은 PFA에서 최적의 기간이며 더 긴 기간은 더...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 방법론은 원래 존스 홉킨스 의과대학 신경과 세포공학연구소의 송홍준 박사 연구실에서 개발되었습니다. 본 연구는 NIMH (R00MH090115), NARSAD, Fraternal Order of Eagles' Mayo Cancer Research Fund, 그리고 M.H.J.에 수여된 Mayo 재단의 스타트업 패키지와 한국연구재단(NRF)의 기초과학연구 프로그램, 교육과학기술부 자금 지원, A3014385 지원, W.R.K. 등에 수여되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
SuperFrost Plus SlideFisherbrand12-550-15끓는 동안 해마 조직에 강한 접착력을 제공합니다
PVA/DABCO 마운팅 미디어Sigma Aldrich10981-100 ml
Nestin (닭) Aves LabNES신경 줄기 세포 마커
GFAP (토끼)Dako North AmericaZ033401-2성상세포 및 신경 줄기 세포 마커
MCM2 (마우스)BD Transduction Laboratory610701Proliferation marker
DCX (goat)Santa Cruz BiotechnologySC8066Immature neuron marker
Tbr2 (rabbit)AbcamAb23345Amplifying progenitor marker
NeuN (mouse)MilliporeMAB377Mature neuron marker
Cy2 (anti-rabbit)Jackson Immunoresearch111-226-047
Cy2 (안티-닭)Jackson Immunoresearch303-165-006
Cy5 (안티-마우스)Jackson Immunoresearch315-175-047
Cy5 (안티-염소)Jackson Immunoresearch305-165-047
DAPILife Technologies CorporationD1306
Dako PenS2002Dako발수 펜

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).
  2. Santarelli, L., Saxe, M., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301 (5634), 805-809 (2003).
  3. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).
  4. Clelland, C. D., Choi, M., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325 (5937), 210-213 (2009).
  5. Wang, J. W., David, D. J., et al. Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).
  6. D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry. Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).
  7. Daneshtalab, N., et al. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).
  8. Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis. Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
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  11. Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval. Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).

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