표현 이온 채널 연구에 대한 특정 감각 신경 세포 인구의 식별

요약

구심성 감각 뉴런은 주변부에서 중추 신경계로 감각 정보를 알립니다. 특정 구심성 뉴런을 식별하는 것은 그들의 생리학을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 우리는 구심성 뉴런을 식별하기 위한 역행 라벨링 방법을 설명하고, 패치 클램프 전기생리학 및 면역세포화학을 사용하여 이러한 뉴런의 전위의존성 이온 채널을 연구합니다.

초록

감각 뉴런은 신체의 여러 부분에서 중추 신경계로 신호를 전달합니다. 이 뉴런의 소마(soma)는 척추를 둘러싸고 있는 등뿌리 신경절(dorsal root ganglia)에 있습니다. 이러한 감각 구심성 뉴런이 발현하는 수용체와 채널을 이해하면 질병에 대한 새로운 치료법으로 이어질 수 있습니다. 첫 번째 단계는 관심 있는 감각 뉴런의 특정 하위 집합을 식별하는 것입니다. 여기에서는 형광 염료 DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)를 사용하여 역행 표지를 통해 근육에 신경을 분포시키는 구심성 뉴런을 식별하는 방법을 설명합니다. 근육 구심성의 흥분에 대한 이온 채널의 기여를 이해하면 말초 혈관 질환 또는 심부전과 같은 특정 질병 상태에 의해 유발되는 과도한 흥분성을 더 잘 제어하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 이러한 뉴런에 의해 발현되는 전압 의존 이온 채널을 식별하기 위해 패치 클램프 전기생리학과 면역세포화학의 두 가지 접근 방식을 사용했습니다. 전기생리학과 약리학적 차단제는 기능적 이온 채널 유형을 식별할 수 있지만, 당사는 특정 차단제를 사용할 수 없는 채널을 식별하고 세포 집단의 이온 채널 분포 패턴을 더 잘 이해하기 위해 면역세포화학을 사용했습니다. 이러한 기술은 특정 신경 세포를 연구하기 위해 신경계의 다른 영역에 적용할 수 있습니다.

서론

Dorsal root ganglia (DRG)는 신체의 여러 부분에 분포하는 구심성 뉴런의 체질(soma)로 구성되어 있으며, 서로 다른 신경 분포 표적을 가진 감각 뉴런을 연구함으로써 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다¹. 구심성 뉴런을 분리하고 식별하기 위해 다양한 간접 또는 침습적 방법이 사용됩니다(예: 플루오로골드¹과 같은 마커를 신경에 주입, 외과적 방법²로 근육에 염료 주입). 뉴런과 뉴런 관을 표지하는 데 성공적으로 사용된 다양한 염료 중 DiI와 같은 형광 염료는 뉴런 말단의 빠른 흡수, 뉴런의 장기 체류 및 뉴런 간 전달 부족으로 인해 신경 해부학적 추적에 널리 사용됩니다³. DiI로 표지된 구심성 뉴런은 자세한 연구를 위해 형광 현미경을 사용하여 쉽게 시각화할 수 있습니다. 그러나 한 가지 한계는 세포 내 항원결정기(epitopes)를 사용한 면역세포화학(immunocytochemistry)에 필요한 세포 투과화(cell percebilization) 과정에서 DiI과 같은 marker가 세포에서 손실될 수 있다는 것입니다⁴. 여기에서는 DRG에서 근육 구심성 뉴런을 식별하기 위해 골격근에 주입된 DiI를 사용하는 방법을 설명합니다. 또한 항체가 세포 내 항원결정기에 접근할 수 있도록 하는 동시에 뉴런에서 DiI을 유지하는 세포 투과화 방법에 대해서도 설명합니다. 우리는 이렇게 식별된 뉴런을 연구하기 위해 패치 클램프 전기생리학과 면역세포화학을 모두 사용하는 방법을 보여주고, 뉴런 흥분성을 제어하는 이온 채널을 연구하는 데 있어 각 기술의 뚜렷한 이점을 설명합니다. 마지막으로, 전기생리학적 데이터의 해석을 방해할 수 있는 잠재적인 문제에 대해 설명합니다. 우리는 이러한 방법을 사용하여 근육 및 피부 구심성 뉴런을 확인하고 이렇게 식별된 뉴런에서 발현되는 전위의존성 나트륨(NaV) 채널을 결정했습니다⁸. 그러나 이러한 방법은 특정 표적 조직 또는 뇌핵을 신경 분포시키는 뉴런의 식별된 하위 집합을 연구하기 위한 다양한 준비에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 모든 동물 작업은 기관 및 동물 관리 지침에 따라 수행되어야 합니다.

1. 동물의 준비와 라벨링

1. 쥐 마취: 케타민(체중 50mg/kg), 자일라진(5mg/kg) 및 아세프로마진(1mg/kg)의 혼합물을 복강 내 주사하여 쥐(일반적으로 150-400g)를 마취합니다. 발을 꼬집어 반사 신경을 확인하고 반응이 없을 때까지 기다립니다. 마취 반응은 동물마다 다르기 때문에 통증 반사를 테스트하여 마취제의 효과를 결정하는 것이 가장 좋습니다.
2. DiI 용액: DiI 분말의 무게를 측정하고 멸균 100% DMSO에 용해시켜 1.5% 용액(15mg/ml)을 얻습니다. 용액을 사용할 때까지 건조한 분위기의 실온에 보관하십시오.
3. DiI 주사: 전기 면도기를 사용하여 마취된 쥐의 양쪽 다리에 있는 종아리 부위의 털을 면도합니다.
   1. 1ml 멸균 주사기(11/4 in 27G 바늘)에 200μl의 1.5% DiI 용액을 채웁니다. 각 비복근의 장축과 평행하게 바늘을 천천히 삽입하고 근육에서 물러나지 않고 바늘을 근육에서 천천히 밀어내면서(~10초) 근육에 100μl DiI를 주입합니다.
   2. 근육에서 바늘을 빼내기 전에 주사기 플런저를 뒤로 당겨 염료가 팁에서 더 이상 흐르지 않는지 확인하고 10초 동안 기다린 다음 근육에서 바늘을 빼냅니다. 이 단계는 바늘에서 피부로 DiI가 누출되는 것을 방지하며, 이는 피부 구심성을 표시할 수 있습니다.
   3. 다른 쪽 다리에 대해서도 반복합니다.
   4. DiI가 근육에서 DRG로 운반되는 데 4-5일이 소요됩니다.

2. 해부 및 신경 세포 격리

1. 솔루션:
   1. 제조업체의 지침에 따라 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)과 Earle's Balanced Salt Solution(EBSS)을 준비하고 여과, 살균 및 4°C에서 보관합니다.
   2. 배양 배지(MEM Plus): 89ml 최소 필수 배지(MEM), 10ml 소 태아 혈청(FBS), 1ml 페니실린-스트렙토마이신 용액을 혼합하고 필터 살균 및 4°C에서 보관합니다.
   3. 폴리리신 용액: 폴리-L-라이신 브롬화 수소 분말(10mg/100ml)을 pH 8.1의 0.1M 붕산나트륨 용액에 용해시키고 필터를 살균하여 -20°C에서 분취액을 보관합니다.
2. 커버 슬립 코팅
   1. 유리 커버슬립(12mm 라운드)을 70% 에탄올로 3-4시간 동안 세척하고 멸균 배양 후드에서 자연 건조합니다.
   2. 건조된 커버슬립을 폴리리신 용액 O/N에 넣습니다.
   3. 폴리리신 용액에서 제거하고 멸균 증류수로 2회씩 5회 세척하여 과도한 폴리리신을 제거합니다.
   4. 커버 슬립을 분리하고 배양 후드에서 건조시킨 다음 4 ^oC에서 보관하십시오.
3. 해부를 위한 설정
   1. 얼음 위에 HBSS 10ml가 담긴 비커, 35mm 페트리 접시, 100mm 페트리 접시를 놓습니다.
   2. 효소의 무게를 잰다: 콜라겐분해효소 7mg, DNAse 1mg, 트립신 10mg.
   3. 흔들리는 수조를 37°C로 예열하고 10ml의 EBSS가 들어 있는 15ml 원심분리기 튜브를 수조에 넣어 예열합니다.
4. 해부:
   1. IACUC 승인 프로토콜에 따라 쥐를 희생시킵니다. Carbon dioxide는 쥐를 안락사시키는 데 사용되었습니다.
   2. 등의 피부를 절개하여 등을 빠르게 제거하고, 더 나은 노출을 위해 척추를 따라 결합 및 근육 조직을 제거하고, 척추의 요추 부분(흉부 부위 끝에서 장골골까지; 그림 1).
   3. 분리된 척추를 100mm 페트리 접시에 넣고 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 식힌 HBSS 용액을 바르고 준비물을 촉촉하고 차갑게 유지합니다.
   4. 척추 측면에서 근육을 자릅니다. 롱거(rongeurs) 또는 가위를 사용하여 등쪽 후판 절제술을 시행하고 DRG를 포함하는 오목부를 둘러싸고 있는 뼈를 부드럽게 제거합니다.
   5. 이 과정에서 얼음처럼 차가운 HBSS(~1ml)를 반복적으로 바릅니다.
   6. 말초 신경과 중추 신경을 절단하여 DRG를 분리합니다(신경절 처리를 용이하게 하기 위해 1-2mm의 신경을 남겨둡니다).
   7. 분리된 DRG를 얼음처럼 차가운 HBSS 버퍼가 들어 있는 35mm 페트리 접시에 넣습니다.
   8. 모든 L-4 및 L-5 DRG가 분리될 때까지 반복합니다. 흉부 DRG는 DiI 라벨링을 위한 음성 대조군으로 별도로 분리 및 처리할 수 있습니다.
   9. 분리된 DRG가 있는 접시를 해부 현미경 아래에 놓고 마이크로 가위와 집게를 사용하여 과도한 신경과 혈관을 제거합니다.
   10. 효소에 더 잘 노출되도록 DRG를 자르되 DRG를 제거하지 마십시오.
5. DRG 뉴런 해리:
   1. 효소를 따뜻한 EBSS 배지에 추가합니다(수조에 보관). 짧게 흔들어 녹이고 여과하여 살균합니다.
   2. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 모든 DRG를 효소 용액에 넣습니다. HBSS는 효소 혼합물을 희석하므로 DRG와 함께 첨가되는 HBSS의 부피를 최소화합니다.플라스크를 95% O₂ 및 5% CO₂로 60초 동안 가스화한 후 플라스크를 단단히 캡핑합니다.
   3. 37°C로 설정된 진탕 수조에서 240rpm에서 60분 동안 플라스크를 배양합니다.
   4. 배양이 끝나면 플라스크를 50x 세게 흔들어 DRG⁵를 분리합니다.
   5. 멸균 상태에서 플라스크에 MEM Plus 5ml를 첨가하여 효소를 중지합니다.
   6. 플라스크 내용물을 멸균 15ml 원심분리기 튜브에 옮기고 16 x g에서 6분 동안 원심분리기를 가열합니다.
   7. 상층액을 제거하여 버리고 샘플에 MEM Plus 5ml를 추가합니다. 펠릿을 분해하기 위해 피펫으로 부드럽게 분쇄합니다.
   8. 원심분리 단계를 반복하여 상층액을 제거 및 폐기하고 MEM Plus 500μl를 첨가합니다. 1ml 피펫 팁을 피펫에 올려 부드럽게 분쇄하여 세포 현탁액을 만듭니다.
   9. 폴리라이신 코팅된 유리 커버슬립 하나를 빈 멸균 35mm 접시에 넣습니다. 세포 현탁액을 커버슬립 중앙에 한 방울(~50μl) 떨어뜨립니다.
   10. 세포 용액이 소진될 때까지 반복합니다.
   11. 35mm 접시를 37°C 및 5% CO₂ 인큐베이터에 1시간 동안 넣어 뉴런이 커버슬립에 부착되도록 합니다.
   12. 각 접시에 2ml의 미디어를 추가하고 인큐베이터로 다시 넣습니다.

3. 패치 클램프 녹음

1. 녹음을 위한 솔루션: 이 솔루션은 NaV 전류를 기록하기 위한 것입니다. 조성이 다른 용액의 예는 다음 참고 문헌^5-7에서 찾을 수 있습니다.
   1. 외부 용액: (mM 단위) 45 NaCl, 100 N-methyl-d-glucamine (NMG)•Cl, 4 MnCl₂, 10 Na•HEPES 및 10 포도당, pH = 7.4 및 삼투압 = 320 mOsm.
   2. 내부 용액: (mM) 104 NMG•Cl, 14 크레아틴•PO₄, 6 MgCl₂, 10 NMG•HEPES, 5 Tris•ATP, 10 NMG₂•EGTA 및 0.3 Tris₂•GTP(pH 7.4 및 삼투압 = 300 mOsm).
2. 이온 전류 측정:
   1. 전극 풀러의 유리 모세관에서 기록 전극을 당기고 마이크로포지를 사용하여 팁을 열 연마합니다. 전극의 저항은 일반적으로 2-3MΩ입니다.
   2. DiI 표지된 DRG 뉴런을 상피 형광이 있는 현미경과 TRITC 큐브를 사용하여 식별합니다. DiI의 여기 파장은 550nm이고 방출 파장은 570nm입니다.
   3. 유리 전극에 내부 용액(전극 팁의 ~ 1cm만 채워짐)을 채우고 부드럽게 두드려 갇힌 기포를 제거합니다. 전극 홀더에 넣고 미세 조작기를 사용하여 셀로 이동합니다.
   4. 전극이 셀에 닿으면 단단한 밀봉이 형성될 때까지(전극 저항의 증가에 따라 결정됨) 흡입 튜브를 통해 부드럽게 흡입합니다.
   5. 멤브레인 전압을 원하는 유지 전위(일반적으로 -60 - -120mV)로 고정합니다.
   6. 전극 끝의 멤브레인 패치를 제거하기 위해 더 강한 흡입을 가하여 전체 세포 패치 cl을 얻습니다. 전체 셀 구성으로의 전환은 정전 용량 전류의 증가로 전기적으로 관찰됩니다^8-10.
   7. 패치 cl의 보상 회로를 사용하여 직렬 저항을 보상합니다.amp 증폭기(최소 80% 보상 사용)^8,10.

4. 면역세포화학

1. 4% 파라포름알데히드로 커버슬립의 뉴런을 1시간 동안 고정한 다음 2% Tween 20 in phosphate buffered saline(PBS)으로 10분 동안 투과화합니다.
2. 고정 세포 O/N을 차단 용액(일반 혈청 또는 소 혈청 알부민)과 특정 관심 항원에 결합하기 위해 개발된 항체인 1차 항체를 배양합니다.
3. 1차 항체가 결핍된 차단 용액에서 뉴런 O/N의 대조군 세트를 배양합니다.
4. PBS 버퍼로 커버슬립을 5분 동안 3회 세척한 다음 1% Tween 20으로 각각 5분씩 2회 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다.
5. 적절한 형광 태그가 지정된 2차 항체로 테스트 및 제어 커버슬립을 배양하고, 이 항체는 1차 항체에 결합하여 시각화를 가능하게 합니다.
6. PBS 3x로 커버슬립을 5회 세척하여 과도한 2차 항체를 제거합니다.
7. 장착 매체를 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다.
8. 커버슬립 가장자리에 투명 매니큐어를 바르고 제자리에 고정합니다. 건조되면 형광 현미경과 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 뉴런을 시각화하고 이미지를 캡처합니다.
   참고: 이 작업에서는 Nikon 현미경을 NIS-elements BR 3.2 소프트웨어와 함께 사용했습니다. 노출 시간은 제어 슬라이드와 테스트 슬라이드에 대해 최적화되고 동일하게 유지되었습니다.
9. ImageJ(rsbweb.nih.gov/ij/index.html)와 같은 이미징 소프트웨어를 사용하여 개별 뉴런에서 형광 강도와 세포 크기를 측정합니다.

결과

여기에 설명된 방법을 사용하여 DRG에서 근육 구심성 뉴런을 확인하고 이러한 뉴런에서 발현되는 전위의존성 나트륨 채널(NaV)을 결정했습니다. DiI 라벨링된 근육 구심성 뉴런(그림 1C)은 DRG의 전체 뉴런 모집단 중 작은 부분을 차지하며, 평균 16%의 뉴런(167/1047)이 라벨링되었습니다. 정량화는 먼저 ImageJ를 사용하여 형광을 측정하고 강도 데이터의 히스토그램을 플로팅하여 양성으로 표지된 뉴런의 임계값을 결정함으로써 수행되었습니다. 임계값은 평균 강도와 표준 편차(SD)를 제공하는 라벨링되지 않은 뉴런의 큰 피크에 가우스 분포를 피팅하여 결정되었습니다(그림 1D). 임계값 수준은 평균 강도에 2x SD를 더한 값으로 설정하여 강도가 임계값인 모든 뉴런이^11,12> 표시된 것으로 표시되도록 했습니다.

전기생리학:

패치 클램프 녹음을 위...

토론

삼두근에서 유래한 근육 구심성 신경(예: 비복근)은 운동 압박 반사(EPR)¹³를 조사하기 위해 여러 연구에서 사용되었습니다. EPR을 매개하는 감각 뉴런을 연구하는 데 대한 관심을 감안할 때 비복근은 염료 주입을 위해 선택되었습니다. DiI는 친유성 특성과 온전한 원형질막을 통한 확산에 의해 뉴런에서 손실되지 않기 때문에 선택되었습니다^3,14. 이 방법을 가이드로 사용하여 관심 있는 표적 기관에 염료를 주입하여 신경 포괄하는 구심성 뉴런을 식별할 수 있습니다. 문헌 검색은 최상의 주사 부위와 분리할 DRG를 찾는 데 필요한 정보를 제공합니다 ^13,15,16.

DiI의 주입은 의도한 조직만 주입하도록 주의해서 이루어져야 합니다. 염료가 조직 내에 잘 분포되어 있는지 확인하는 것도 중요합니다. 우리는 세로 근육 축을 따라 주입하여 근육의 염료 분포를 최적화했습니다. 바늘을 근육에 삽입하고 근육을 따라 바늘을...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 및 1.9	Alamone Labs, 예루살렘, 이스라엘	ASC- 001/ 009 /008 /017
Alexa Fluor 2차 항체	Invitrogen
Normal goat serum
Fluoro-Gel	Electron Microscopy Sciences	17985