미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
신경 돌기, 모두 수상 돌기 및 축색 돌기는 뉴런 사이의 전기 자극의 전도를 가능하게 신경 세포 과정이다. 신경 돌기의 구조를 정의하는 것은 이러한 과정이 시냅스 통신을 지원 자료 및 신호를 이동하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 전자 현미경 (EM)는 전통적으로 신경 돌기 내의 미세 기능을 평가하는 데 사용되었습니다 있지만, 탈수 및 수지 매립시 유기 용제에 노출 구조를 왜곡 할 수 있습니다. 중요한 충족 목표는 유물의 영향을받지 구조 평가를 허용 절차의 수립이다. 여기, 우리는 성장하고 극저온 전자 단층 촬영 (크라이 ET)과의 시험 다음에 전자 현미경 그리드에 다른 차 신경의 플래시 냉동 전체의 신경 돌기에 대한 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 설립했다. 이 기술은 ASSE 용이 나노 미터 분해능에서 냉동 수화 신경 돌기의 3-D 시각화를 허용자신의 형태 학적 차이 ssment. 우리의 프로토콜은 후근 신경절 (DRG) 신경 돌기, 그들의 네이티브에 가까운 상태에서 해마의 신경 돌기의 시각화의 전례가없는보기를 얻을 수 있습니다. 따라서,이 방법은 정상적인 신경 세포와 신경 장애에 의해 영향을 사람들 모두의 신경 돌기에 미래 연구를위한 기초를 만들 수 있습니다.
서론
뉴런은 다운 스트림 신경과 의사 소통을하기위한 정보와 축삭, 종종 아주 긴을받을 모 수석을 정교화하여 중앙과 말초 신경계의 기능에 대한 복잡한 회로의 핵심을 설정합니다. 신경 돌기 가지 신경계의 비판적 기능을 지원 배아 발달과 신경 세포의 분화 및 신경 돌기의 유지 보수 동안 근본적인 역할을한다. Neuritic 과정은 신경 세포의 손상 및 재생뿐만 아니라, 신경계 장애에 비판적 있습니다. 신경 세포의 구조의 연구는 모두 정상 및 병에 걸린 뇌를 이해하는 것이 중요합니다. 다행히, 생리학 관련 신경 세포 배양 시스템은 복잡하고 이질적인 세포 구조를 요점을 되풀이 할 수있다. 고체 실험 플랫폼, 신경 세포의 형태의 정성 및 정량 분석을 가능하게 효과적인 시각화 전략의 해명에 따라 필요합니다. 특히 유용한 것나노 미터 스케일에서 신경 돌기, 축삭과 수상 돌기 모두를 시각화하기위한 일관성있는 플랫폼을 제공하는 자세한 방법합니다.
기존의 전자 현미경은 그들의 진정한 상태에서 시험편에 왜곡을 유도 할 수있는 탈수 수지 매립 중에 유기 용매의 사용을 필요로한다. 따라서 연구 결과 4,9,25의 해석을 제한 - 현재까지 나노 미터 스케일에서 가장 구조적 특성 분석은 이러한 가혹한 화학 물질에 노출되는 더 큰 세포 또는 조직을 기....
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프로토콜
1. 도금 차 뉴런을위한 EM 그리드와 요리 준비
- 적어도 25 배의 배율로 광학 현미경을 사용하여 금 EM 그리드에 구멍 투성이의 탄소의 무결성을 검사합니다. 확인 탄소 구멍은> 98 % 그대로 유지되어 있는지 확인하십시오.
- 기본 뉴런 도금의 경우, EM 격자를 화염 살균 동시에 그 친수성 렌더링하는 분젠 버너를 사용합니다. 가장자리가 아닌 중앙 그리드 화 면적으로 EM 그리드를 데리러 핀셋을 사용합니다. 주의 : 자동 조명 분젠 버너를 두지 마십시오, 이러한 단계를 수행하는 동안 플라스틱 부품에 장갑이나 핀셋을 사용하지 마십시오 :
- 분젠 버너를 점화하기 전에 최소한의 개방 위치에 공기 및 가스 조정을 설정합니다.
- 스트라이커 부싯돌 또는 부탄 라이터를 사용하여 분젠 버너에 불을.
- 키도 크고, 밝은 블루 / 바이올렛 불꽃 내 작은 파란색 내부 불꽃을 달성하기 위해 공기 및 가스 조정을 수정합니다. 내부 불꽃의 끝이 불꽃의 가장 뜨거운 부분입니다. 아래의 손잡이버너의 총신이 공기가 버너 들어가는 양을 조절하기 위해 설정 될 수있는 반면 니스 버너, 가스 버너 튜브들이의 양을 조절한다. 공기 조절 시계 방향으로 돌리면 (보라색 불꽃의 결과로) 공기를 감소하고 반 시계 방향 (노란색 불꽃이 발생) 공기를 ....
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결과
이전 크라이 ET를 통해 동결 및 이미징, 광학 현미경 이미지는 신경 세포가 성장하고있는 EM 그리드주의해야한다. 신경 돌기가 서로 상당한 중복하지 않고 명확하게 볼 수 있어야합니다. 그림 (a)에 색 상자가 확대 된에 신경 돌기가 격자의 격자에 걸쳐 확장되는 그림 (b)에서 높은 배율을 표시하는 영역을 나타냅니다. 각 그리드 사각형은 뉴런과 자신의 신경 돌기를 지원하는 구멍 투성이의 탄소 필름으로 구성되어있다. 이 구멍은 외부 프로젝트를 신경 돌기있는 비교적 큰, 어두운, 전자 밀도가 높은 물체 (그림 3C)와 같은 신경 세포의 시체를 보여줍니다 4K 배율에서 찍은 저용량 크라이 EM 이미지에 분명하다.
탄소에 구멍 위의 신경 돌기 휴식의 일부는 그림 3C에서 컬러 상자에서 선택하고, 확대 된 그림 3D의 높은 배율 (20K.......
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토론
우리는 쥐의 배아 신경 (척수 신경절 및 해마는) 골드 전자 현미경 (EM) 그리드에 성장 및 2-D cryo 종 및 3-D의 극저온을 사용하여 몇 군데되는 자신의 신경 돌기에 충분한 얇은 유리 같은 얼음에 고정 할 수 있다는 것을 보여 ET. 해마의 신경 돌기 이전 크라이 ET 8,10,18,23을 사용하여 몇 군데되었지만, 프로토콜이 부족 한 상업적으로 사용 가능한 장치를 사용하여 성공적으로 복제 충분히 상세한. 그들의 연구는 해마의 신경 돌기를 시각화 크라이 ET의 사용을 개척하고있는 동안 또한, 우리의 연구는 신경 세포의 표본 하나 이상의 유형을 알아내는-ET의 적용 가능성을 탐구한다.
여기, 우리는 EM 최적 얇은 얼음을 달성하기 위해 그들을 모래 바닥, 해마 및 후근 신경절 (DRG) 뉴런 하나와 그리드 준비에 대한 자세한 프로토콜을 설명하고 플 런지 냉동 크라이 ET으로 이미징을. 최적 블롯 시간은, 관통하는 전자 빔을 위해 너무 두꺼운 얼음을.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 NIH 보조금 (PN2EY016525 및 P41GM103832)에 의해 지원되었다. SHS는 걸프 지역 컨소시엄 (NIH 그랜트 번호 T32EB009379)의 학제 간 생명 과학 교육에 대한 WM 켁 센터에 NanoBiology 학제 간 대학원 교육 프로그램의 화목에 의해 지원되었다.
SHS는 해부 성장하고 DRG와 해마 세포를 유리화, cryo 종 및 DRG와 해마 축삭의 크라이 ET 데이터를 수집, 재구성 및 틸트 시리즈 색상 주석. MRG는 해부와 MNR의 실험실에서 해마의 세포를 제공했다. SC는 경사 시리즈 주석의 지원. SHS는 뉴런을 해부하고 성장하는 방법에 대한 CW에 의해 훈련되었다. SHS, WCM, 화장실은 실험을 고안. SHS는 다른 저자의 의견으로 원고를 준비했다.
이 비디오는 t의 Biozentrum의 세포 이미징 및 NanoAnalytics (C-CINA)를위한 센터에서 촬영되었다대학 바젤 그. C-CINA는 스위스 바젤에있는 ETH 취리히의 바이오 시스템 공학 (D-BSSE)의 부서에 통합되어 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Dumont #7 핀셋 | 전자 현미경 과학 | 72803-01 | EM 그리드 처리용 |
| 유리 바닥 접시 | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | 성장하는 샘플용 |
| 전자 현미경 그리드 | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | 성장하는 샘플용 |
| 칼슘-프리 여과지 | Whatman | 1541-055 | 블로팅 샘플용 |
| 대형 플랫 포인트 롱 핀셋 | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | 블로팅 샘플용 |
| 유리화 장치 및 핀셋 | FEI | Vitrobot Mark III | 샘플 냉동 |
| 용 Minigrid 보관 상자 | Ted Pella, Inc. | 160-40 | EM 그리드 저장용 |
| 극저온 전사 홀더 | Gatan | 626 단일 틸트 액체 질소 극저온 전사 홀더 | 이미징 샘플용 |
| 반자동 틸트 시리즈 수집 소프트웨어 | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | 이미징 샘플용 |
| 이미지 처리 소프트웨어 | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | 이미지 처리용 |
| CryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 <>sub6 전자 현미경 | 이미징 샘플용 |
| 4k x 4k CCD 카메라 | Gatan | N/A | 이미징 샘플용 |
| 3D 주석 소프트웨어 | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | 3D 데이터 처리용 |
| 2D 이미지 디지털 스티칭용 | 소프트웨어 Adobe | Adobe Photoshop | 2-D 데이터 DMEM |
| , High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | 해마 배양을 위해 |
| Boric acid Sigma | Aldrich | B-0252 | 해마 배양을 위해 |
| 테트라보레이트 나트륨 | Sigma Aldrich | B-9876 | 해마 배양을 위해 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | 해마 배양용 |
| 필터 시스템 | Corning | 430758 | 해마 배양용 |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | DRG 배양 |
| B-27 보충제 | Invitrogen | 17504-044 | DRG 배양용 |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Invitrogen | 15140-122 | DRG 배양용 |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | DRG 배양용 |
| 재조합 쥐 b-NGF | R& D Systems | 556-NG | DRG 배양용 |
| 유리딘 | 시그마 | U3003-5G | DRG 배양용 |
| 5'-플루오로-2'-데옥시우리딘 | 시그마 | F0503-100MG | DRG 배양용 |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | DRG 배양용 |
참고문헌
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like ....
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