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방법 논문

마이크로 RNA

14.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50785

⸱

2013년 11월 30일

 , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

이 논문에서

요약

이 문서는 포르말린 고정 신장 섹션의 마이크로 RNA 발현 colormetric 검출에 최적화의 현장 하이브리드 프로토콜을 설명합니다.

초록

이 문서에서 우리는 마이크로 RNA 프로브를 태그 제닌과 현장 하이브리드 화에를 통해 신장의 miRNA의 비색 검출하는 방법을 설명합니다. 원래 Kloosterman 및 Exiqon miRNA의 프로브 1 폭 넓은 사용을 위해 동료에 의해 ​​개발 된이 프로토콜은, 신장 조직에서의 miRNA 분석에 내재 된 문제를 극복하도록 수정되었습니다. 여기에는 구조 식별 및 잔류 조사 및 항체를 제거하기 어려운 문제가 있습니다. 비교적 얇은 사용, 두께 5mm, 강한 프로브 신호가 세포 내에 유지하면서, 신장 구조의 명확한 시각화를 허용 조직 섹션. 또한, 프로브 농도와 배양 조건은 낮은 배경 및 비특이적 신호 마이크로 RNA 발현의 시각화를 용이하게하기 위해 최적화되었다. 여기서, 최적화 프로토콜은 프로 시저의 끝에서 슬라이드 실장 통해 초기 티슈 콜렉션 및 준비를 덮고, 설명한다. 기본 compone이 프로토콜의 국세청은 다른 조직과 세포 배양 모델 응용 프로그램에 대해 변경 될 수 있습니다.

서론

마이크로 RNA는 내생 적으로 생산되는 RNA를 비 암호화 (약 22 뉴클레오티드) 작은 수 있습니다. 그들은 일반적으로 번역 억압 또는 mRNA의 분해를 통해 단백질 발현을 억제하는 기능을한다. 완전 보완와 mRNA의 대상에있는 miRNA 바인딩, 그것이 가능한 하나의 miRNA가 여러 대상을 억제하기 위해 만드는.

세포의 종류와 구조의 miRNAs을 표현 이해 메커니즘을 이해의 중요한 부분 인을 통해 miRNA의 발현에 영향을 미치는 세포와 조직의 표현형의 변화. 이러한 miRNA의 시퀀싱, qPCR에 노던 블로 팅 등의 방법은 전체 조직에서의 miRNA의 검출에 사용 할 수 있지만,이 방법은 하나가 특정 조직 내에서 온 어떤 특정 세포 유형을 결정하는 것을 허용하지 않습니다. 이러한 방법을 사용하여 분석 전에 셀룰러 및 구조 구성 요소의 해부는 매우 어려울 수 있습니다 적절한 아이솔레이션을 달성하기 위해 필요한 조건은 알을 초래할 수 있습니다유전자 발현 또는 RNA를 저하에 terations. 원위치 혼성화에서 마이크로 RNA는 조직에서 마이크로 RNA 위치 및 발현 수준을 가시화하기 위해 사용하는 방법이다. 이 기술은 신장 등 이종 구조, 구성 조직에 특히 유용합니다.

마이크로 RNA는 신장 개발 2,3 생리학 4에서 규정하는 역할을하는 것으로 나타났다. 마이크로 RNA 발현의 변화는 또한 섬유증 5-10, 당뇨병 성 신증 7, 신장 암 11, 12, 급성 신장 손상은 13 신장 병리에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 우리의 연구에서는 신장 조직에 대한 현장 하이브리드 마이크로 RNA를 최적화하는 것이 건강과 질병 (14) 모두에 miRNA의 표현의 정확한 구조 위치를 결정하기위한 가치있는 것을 발견했다. 다른 마이크로 RNA의 관 및 세포 발현의 결정은 중요하기 때문에 타 자신의 규제rgets는 세포 기능에 의존 할 수있다. 병에 걸린 상태에서 그것은 miRNA의 발현의 변경 기능에 영향을 될 수있는 방법을 결정하는 것도 중요하다.

여기에 설명 된 방법의 목적은 Kloosterman 등. 15, 16, 17, 다른 연구자에 의해 개발 된 기존 ISH 방법론에 따라 구축 할 수 있었고, 사람들은 Exiqon 1에 의해 제안 된 포르말린 고정 신장 조직하는 방법을 최적화 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 일방적 인 요관 폐색 (18)와 신장 마이크로 RNA 미르 - 382 식의 지역적인 차이를 식별하기 위해이 방법을 사용했습니다. 이러한 접근은 추가적인 최적화뿐만 아니라 다른 조직으로 사용될 수있다.

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프로토콜

1. 신장 조직 섹션

  1. 포르말린 - 고정 (10 %) 파라핀 신장 섹션 슬라이드 분석 전에 몇 달 동안 저장 될 수 마이크로 미터 HM (355)를 사용하여 S. 5mm 두께로 현미경 슬라이드 상으로 절단된다.

2. 솔루션 준비

  1. 고압 증기 멸균 나사 정상 병에 DDH 2 O에 1X PBS의 1 L를 준비합니다. DDH 2 O 1 L로 다른 병 채우기 각 병, 덮개에 DEPC의 1 ML을 추가하고 격렬하게 흔들어. 솔루션 RNAses을 파괴 한 후 오토 클레이브 실온에서 밤새 앉아 보자. PBS-T 만들기 위해 400 ㎖의 트윈 20 1X PBS의 L 1에 추가합니다.
  2. 단백질 분해 효소 K 버퍼 (50 mMTris 염산, pH를 8.0 DEPC에 1 ㎜ 염화칼슘 처리 된 물)을 준비합니다.
  3. PBS-T에서 0.2 % 글리신의 솔루션을 준비합니다.

3. 조직 준비

  1. 혼성화 완충액 대량 50 % 포름 아미드로 이루어진 (50 ~ 100 ㎖), 5X SSC, 0.1 % 트윈, 9.2 준비pH가 6, 50 ㎍ / ㎖의 헤파린, 및 DEPC에 500 ㎍ / ㎖의 효모 RNA에 조정을위한 MM의 구연산은 DDH 2 O를 처리 C. º -80에서 1 ㎖ 분량 씩 분주하여 보관하여
  2. 5 분마다 신선한 크실렌의 3 배를 세척하여 조직에서 파라핀을 제거합니다.
  3. DDH 2 O. 에탄올 농도 (100 %, 75 %, 50 % 및 25 %)를 감소에서 5 분 배양하여 조직 절편을 재수
  4. 완전 1 분 동안 조직 절편 (약 0.4 ~ 0.5 ml)에 충당하기에 충분한 DEPC로 슬라이드를 취급한다. 확인 조직은 건조하지 않습니다.
  5. DEPC의 슬라이드는 적절한 처리에 대한 DEPC 포함 된 폐기물을 수집, 5 분 동안 두 번 PBS-T를 처리 씻어. 모든 시약은 DEPC이 시점에서 RNAses을 제거하는 치료를해야한다.
  6. Prewarm 테 K 버퍼링 및 10 μg / ML의 최종 농도에 단백질 분해 효소의 K를 추가합니다. 단백질 분해 K 솔루션으로 조직 섹션을 덮고 5 분 동안 37 º C에서 알을 품다.
  7. 빨리 proteinas 제거전자 K 솔루션 30 초 동안 PBS-T에서 0.2 % 글리신을 추가합니다.
  8. DEPC에 린스 슬라이드는 30 초마다 두 번 PBS-T를 처리.
  9. 10 분 동안 갓 4 % 파라 포름 알데히드의 부분을 수정.

4. 이종 교잡

  1. 하이브리드 버퍼의 50 μL (50 % 포름 아미드, 배 SSC, 0.1 % 트윈, pH를 6, 50 ㎍ / ㎖의 헤파린, 500 ㎍ / ㎖의 효모 RNA에 조정을위한 9.2 MM의 구연산) 조직 섹션 당을 추가하고 이는 RNAse 무료 HybriSlips 커버 조직 섹션보다 더 큰 단지 컷.
  2. 3 '제닌 표지 프로브 (탐침의 보통 DNA TM에 대해 결정 하이브리드의 온도에서 2 시간 동안 습도 제어 하이브리드 오븐에서 Prehybridize 섹션 -21 ° C ~, 미르 - 382에 대한 (즉, 54 ° C는 DNA TM = 75 ° C를 조사 ), 챔버를 유지하기 위해 50 % formamide/50 %의 5 배 SSC에 배어 조직 실험실 와이프를 사용하여 가습.
  3. miRNA의 프로브, 양성 대조군 (U6 작은 핵 RNA)과 대조군 (스크램블을 희석하이브리드 버퍼에 40 nm의 순서는 () 버퍼의 75 μL)는 섹션 당 필요합니다.
  4. 5 분 동안 65 º C에서 혼성화 버퍼 프로브를 가열한다.
  5. 하이브리드 오븐에서 슬라이드를 제거하고 예비 혼성화에서 커버 슬립 과잉 하이브리드 버퍼를 제거합니다.
  6. 직접 조직에, 조직 섹션 당 프로브를 포함하는 버퍼의 75 μl를 추가합니다. 조직 섹션을 포함 할 정도로 그냥 큰 HybriSlips과 조직을 커버.
  7. 슬라이드 홀더 수준을 유지, 4.2 단계 (약 16 시간)의 온도에서 하룻밤 배양을위한 하이브리드 오븐으로 돌아갑니다.

5. 엄격한 세척

  1. 조직에서 커버 슬립을 해제하는 데 도움이 단지 커버 슬립 중 하나 가장자리에서 하이브리드 온도로 가열 200 μL 2X SSC를 추가합니다. 슬라이드를 기울여 커버 슬립을 제거합니다.
  2. 30 분 각각의 혼성화 온도의 3 배에 50 %의 포름 아미드, 50 % 2X SSC 200 μL에 슬라이드를 씻으십시오.
  3. 헹구기슬라이드는 저속에서 진탕에 5 분 각각 실온에서 PBS-T에서 5 배.

6. 검출

  1. 저속에서 진탕에 실온에서 1 시간 동안 버퍼 (2 % 염소 또는 말 혈청, 2 ㎎ / ㎖ PBS-T에 BSA를) 차단에 슬라이드를 품어.
  2. 1:100에서 버퍼를 차단하는 안티-DIG-AP Fab 단편을 희석. 조직 섹션 당 100 μl를 추가하고 HybriSlips 커버는 부분을 커버하기에 충분한 단지 큰 잘라.
  3. 4 ° C 하룻밤 (약 16 시간)에 가습 실에 항체를 품어.
  4. 낮은 속도로 진탕에 5 분마다, PBS-T 7 배에 슬라이드를 씻으십시오.
  5. 5 분마다, 3 배 (100 ㎜ TrisHCl의 pH 9.5, 50 mM의 MgCl2를 100mm 크기의 NaCl, 0.1 % 트윈 20) AP 버퍼에 슬라이드를 씻으십시오.
  6. AP 버퍼에 NBT / BCIP 솔루션을 추가 (200 μl/10 ML 버퍼)
  7. 완전히 모든 조직 섹션을 포함하는 각각의 슬라이드에 희석 NBT / BCIP 솔루션의 400 ~ 500 ML을 추가합니다. 어두운, 레벨, humidif에 개발4 ~ 5 시간 동안 폭발물 실.

7. 장착 슬라이드

  1. 5 분마다 에탄올 농도 (25 %, 50 %, 75 %, 100 %)을 증가하는 섹션 탈수.
  2. 섹션을 취소하기 위해 크실렌 배에 품어.
  3. 마운트 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 설치 매체 건조 하룻밤에 슬라이드.

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결과

혼성화, 배양 중에 건조 또는 NBT / BCIP를 개발하는 동안 더 어둡게 염색 결국 전체적으로 같이 세척 될 조직 절편의 영역. 1 HybriSlip가 가장자리 떨어져 미끄러 된 신장 부분의 일부를 보여준다 그것은 부분적으로 탈수가 될 수 있도록 조직. 나머지 단계에서 재수 커버리지에도 불구하고, 탈수 부에서의 신호는 인위적으로 높다.

NBT-BCIP 개발 시간을 제어의 중요성은도 2a 및도 2b에 설명되어있다. 신장 (그림 2A)를 통해 스크램블 - 미르 제어 탐색 할 조직의 발음 비특이적 발색에 4 ~ 5 시간의 결과보다 긴 개발 기간. 예 U6 작은 핵 RNA 제어와 같은 높은 풍부 대상, 조사해서 신장, (4-5 시간 이상 더 이상 배양 개선 신호가 발생하지 않는도 우레 2B).

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토론

이 문서의 목적은 포르말린 고정 신장 조직에서 잘 작동 현장 하이브리드 화에 miRNA를위한 프로토콜을 설명했다. 이 프로토콜을 작업하는 동안 염색 유물의 몇 가지 중요한 소스가 확인되었습니다. 이러한 점에주의는 염색 유물을 방지하고 성공적인 ISH 실행의 가능성을 높일 수 있습니다.

가 조직 섹션 긴 배양 중에 건조 할 때 염색 유물의 가장 예방 가능한 원인 중 하나가 발생할 수 있습니다. 이 경우 건조되어 조직의 부분은 NBT / BCIP 개발 (그림 1) 동안 매우 어둡게 얼룩 것입니다. 이 프로토콜을 통하여 그 조직 절편이 완전히 모든 배양을 통해와 슬라이드가 완전히 수준 유지되는 액체에 의해 보호 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 조직 절편은 완전히 같은 혼성화 단계만큼 배양 중에 HybriSlips 의해 덮여 및 유지되어야 액체 손실을 방지하기 위해 항체 배양. 조직 절편의 부분 또는 완전 건조가 관찰...

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공개 사항

공개 아무것도 없다.

감사의 글

이 작품은 건강의 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다 HL082798 및 HL111580을 부여합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
파라포름알데히드시그마P6148
PBSGibco70011044
디에틸 피로카보네이시그마D5758
트윈-20시그마P1379
자일렌시그마534056
에탄올울트라 퓨어200CSPTP
Tris-HCl수명 Technologies15506-017
CaCl2SigmaC2536
GlycineJ.T. Baker4059-00
Citric AcidSigmaC2404
FormamideSigmaF9037
20x SSC BufferLife Technologies15557-044
HeparinSAGENT25021-400-30
효모 RNA라이프 테크놀로지AM7118
MgCl2SigmaM8266-1004
NaClJ.T. Baker4058-01
프로테라제 K발효EO0491
3' DIG- miRNA 프로브ExiqonmiR dependent-05
3' DIG- 스크램블 miR 프로브Exiqon99004-05
3' DIG- U6 miR 프로브Exiqon99002-05
Anti-Digoxigenin-Ab FabRoche11093274910
NBT/BCIPRoche11681451001
PermountFisherSP15-500
CoverslipsFisherFit to tissue size
Microtom HM 355 SThermo Scientific23-900-672
인슬라이드 아웃 하이브리드화 오븐Boekel241000
알루미늄 트레이 어셈블리BoekelC2403973
스테인레스 스틸 랙 인서트BoekelC2403754
트 스

참고문헌

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  15. Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  16. Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
  17. Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).

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